Profil Pita RAPD
Hasil isolasi DNA genom 16 genotipe tetua dan F1 jarak pagar menggunakan metode CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) yang dimodifikasi (Murray dan Thompson 1980) menghasilkan ukuran pita DNA yang cukup bervariasi. Berdasarkan pengukuran pita DNA genom menggunakan mesin spektrofotometer Nano Drop (ND-1000 v 3.5.2), diperoleh rata-rata DNA genom memiliki kuantitas antara 767.8 ng/µl (genotipe Curup) hingga 3915.20 ng/µl (genotipe PalembangxPalembang) dengan nilai kemurnian DNA hasil isolasi antara 1.77 hingga 1.97 (Tabel 7). Penentuan kemurnian DNA dapat dilakukan dengan menghitung ratio absorbansi pada A260 dengan A280 (Ratio A260 : A280). Nilai maksimal ratio A260: A280 adalah 2. Semakin rendah nilai ratio tersebut, semakin rendah kualitas DNA akibat kontaminasi protein.
Tabel 7 Konsentrasi DNA genom 16 genotipe tetua dan F1 jarak pagar (ng/µl)
Genotipe Konsentrasi DNA
ng/µl 260/280 ng/µl 260/280 x (ng/µl) IND 2636.3 1.93 2624.6 1.93 2630.45 PDI 1008.1 1.93 1061.8 1.87 1034.95 JGY 1927.3 1.92 1959.8 1.92 1943.55 CRP 761.3 1.94 774.3 1.93 767.80 KMR 1714.3 1.94 1737.3 1.94 1725.80 MDN 2155 1.94 2182.3 1.94 2168.65 LMP 1227.3 1.91 1223.2 1.93 1225.25 CRPxMDN 1444.7 1.95 1473.3 1.96 1459.00 LMPxPDI 814.1 1.93 825 1.93 819.55 PDIxMDN 3578.9 1.83 3585.3 1.84 3582.10 PDIxLMP 2427.4 1.96 2440 1.97 2433.70 CRPxPDI 763.6 1.92 775.9 1.94 769.75 KMRxKMR 1912.2 1.94 1921.8 1.94 1917.00 PLG x PLG 3877.8 1.78 3952.6 1.77 3915.20 LMPxLMP 1656.2 1.95 1673.2 1.95 1664.70 INDxIND 1501.4 1.95 1540.8 1.94 1521.10
30
Analisis keragaman genetik telah dilaksanakan pada 16 genotipe tetua dan F1 jarak pagar dengan menggunakan 20 primer RAPD yang masing-masing berukuran 10 basa. Hasil penelitian menunjukkan amplifikasi DNA pada enam belas genotipe tetua menggunakan 20 primer RAPD diperoleh 11 primer menghasilkan pita polimorfik, 7 primer menghasilkan pita monomofik dan 2 primer tidak teramplifikasi (Tabel 8). Hasil amplifikasi DNA tanaman jarak pagar menggunakan 20 primer acak tersebut tidak selalu memperoleh pita dengan intensitas yang sama. Perbedaan intensitas setiap pita tidak bisa digunakan untuk menduga jumlah kopi pasang basa pada setiap pita RAPD. Intensitas DNA hasil amplifikasi pada setiap primer sangat dipengaruhi oleh: pertama, kemurnian dan konsentrasi DNA cetakan. DNA cetakan yang mengandung senyawa-senyawa seperti polisakarida dan senyawa fenolik, serta konsentrasi DNA cetakan yang terlalu kecil sering menghasilkan pita DNA amplikasi yang redup atau tidak jelas (Weeden et al. 1992). Kedua, sebaran situs penempelan primer pada DNA cetakan (Grattapaglia et al. 1992; Weeden et al. 1992). Ketiga, adanya kompetisi tempat penempelan primer pada DNA cetakan yang menyebabkan satu fragmen diamplifikasi dalam jumlah banyak dan fragmen lainnya sedikit. Proses amplifikasi mungkin saja diinisiasi pada beberapa tempat, namun hanya beberapa set yang dapat dideteksi sebagai pita sesudah diamplifikasi (Grattapaglia et al. 1992).
Tabel 8 Jenis primer, susunan basa dan jumlah pita DNA lima belas genotipe jarak pagar yang diamplifikasi menggunakan 20 primer acak
No. Primer Susunan Basa (5'--'3) Uk. Pita (bp) Total Pita Total Pita
polimorfik 1 OPE-01 CCCAAGGTCC 400-2000 9 2 2 OPE-03 CCAGATGCAC 600-1200 3 2 3 OPE-05 TCAGGGAGGT 500-2100 8 6 4 OPE-15 TCAGGGAGGT 400-1200 9 1 5 OPE-19 ACGGCGTATG 375-1500 8 4 6 OPH-01 GGTCGGAGAA 0 0 0 7 OPH-02 TCGGACGTGA 500-700 4 0 8 OPH-03 AGACGTCCAC 500-1700 10 0 9 OPH-05 AGTCGTCCCC 300-1700 8 3 10 OPH-06 ACGCATCGCA 450-1450 6 0 11 OPH-07 CTGCATCGTG 400-1750 5 3 12 OPH-08 GAAACACCCC 0 0 0 13 OPH-13 GACGCCACAC 350-1200 8 1 14 OPH-19 GTGACCAGCC 500-2000 4 2 15 OPM-02 ACAACGCCTC 650-1100 3 0 16 OPM-12 GGGACGTTGG 400-1100 6 0 17 OPM-16 GTAACCAGCC 400-700 4 0 18 OPM-17 TCAGTCCGGG 500-1000 5 3 19 OPM-20 AGGTCTTGGG 350-1500 7 6 20 OPM-24 GGCGGTTGTC 450-1000 5 0 Total 112 33 Persentase 29 Rata-rata pita 3.4 1.65
31
Umumnya jumlah pasang basa yang masih dapat diamplifikasi pada DNA genom tanaman berkisar antara 200-2000 pasang basa, bahkan kadang-kadang mencapai 5000 pasang basa (Grattapaglia et al. 1992). Hasil penelitian ini memperoleh pita RAPD berukuran 300-2000 pasang basa.
Menurut Jubera et al. (2009) data marka molekuler dalam hubungannya dengan data morfologi berguna untuk menetapkan tingkat perbedaan dan kemiripan antar kultivar. Fragmen atau pita hasil amplifikasi RAPD diasumsikan sebagai satu lokus. Hasil amplifikasi di skoring 1 jika ada pita dan 0 jika tidak ada pita yang teramplifikasi.
Jumlah pita DNA genotipe tetua jarak pagar yang berhasil diamplifikasi oleh setiap primer berkisar dari 3 pita (OPE-03 dan OPM-02) sampai 10 pita (OPH-03), atau rata-rata menghasilkan 3.4 pita per primer. Jumlah pita yang diperoleh serupa dengan hasil Zainudin et al. (2010) yang berkisar antara 4-10 pita DNA per primer dan Jubera et al. (2009) yang berkisar antara 5-10 pita DNA per primer.
Polimorfisme pita yang dihasilkan pada penelitian ini sebesar 29% (33 pita) dari 112 total pita DNA yang diperoleh. Profil pita RAPD hasil amplifikasi DNA 15 genotipe jarak pagar pada beberapa primer (OPE, OPH dan OPM) yang digunakan dapat dilihat pada Gambar 8 sampai dengan Gambar 10.
Gambar 8 Profil pita RAPD hasil amplifikasi DNA 15 genotipe jarak pagar menggunakan primer OPE-01. Ladder 100bp; (1) genotipe IND; (2) PDI; (3) JGY; (4) CRP; (5) KMR; (6) MDN; (7) LMP; (8) CRPxMDN; (9) LMPxPDI; (10) PDIxMDN; (11) PDIxLMP; (12) CRPxPDI; (13) KMRxKMR; (14)PLGxPLG; (15) LMPxLMP
Gambar 8 menunjukkan pola pita DNA tanaman jarak pagar menggunakan primer OPE-01, menghasilkan 9 pita dengan ukuran pita 400-2000 bp; Gambar 9 menunjukkan pola pita DNA tanaman jarak pagar menggunakan primer OPH-07, menghasilkan 5 pita dengan ukuran pita 400-1750 bp; sedangkan Gambar 10 menunjukkan pola pita DNA tanaman jarak pagar menggunakan primer OPM-20, menghasilkan 7 pita dengan ukuran pita 350-1500 bp .
32
Gambar 9 Profil pita RAPD hasil amplifikasi DNA 15 genotipe jarak pagar menggunakan primer OPH-07. Ladder 100bp; (1) genotipe IND; (2) PDI; (3) JGY; (4) CRP; (5) KMR; (6) MDN; (7) LMP; (8) CRPxMDN; (9) LMPxPDI; (10) PDIxMDN; (11) PDIxLMP; (12) CRPxPDI; (13) KMRxKMR; (14)PLGxPLG; (15) LMPxLMP
Gambar 10 Profil pita RAPD hasil amplifikasi DNA 15 genotipe jarak pagar menggunakan primer OPM-20. Ladder 100bp; (1) genotipe IND; (2) PDI; (3) JGY; (4) CRP; (5) KMR; (6) MDN; (7) LMP; (8) CRPxMDN; (9) LMPxPDI; (10) PDIxMDN; (11) PDIxLMP; (12) CRPxPDI; (13) KMRxKMR; (14)PLGxPLG; (15) LMPxLMP
Pemakaian primer OPH-02, OPH-03, OPH-06, 02, 12. OPM-16 dan OPM-24 tidak mampu memberikan perbedaan pita DNA antara lima belas genotipe jarak pagar yang diuji. Seluruh genotipe menghasilkan pita DNA dengan jumlah dan ukuran yang beragam. Pemakaian primer OPH-01 dan OPH-08 tidak memberikan profil pita DNA terhadap ke lima belas genotipe yang diuji setelah proses amplifikasi PCR
Polimorfisme DNA hasil analisis PCR yang diperoleh dalam penelitian ini membuktikan bahwa analisis molekuler RAPD dapat dipergunakan untuk mendeteksi polimorfisme genom tanaman jarak pagar. Selama proses PCR,
33
amplifikasi DNA akan terjadi jika primer menempel pada situs komplementer yang jaraknya berdekatan dan orientasinya sangat baik. Keseluruhan pola pita yang terbentuk selanjutnya akan dipergunakan dalam menyusun analisis kemiripan antar ke enam belas genotipe tersebut.
Analisis Kemiripan
Dari hasil skoring pita polimorfik selanjutnya digunakan untuk menganalisis tingkat kemiripan dari 15 genotipe jarak pagar. Hasil matriks koefisien kemiripan penanda RAPD antara 15 genotipe jarak pagar berdasarkan 33 lokus yang teramplifikasi dengan rentang nilainya berkisar 0.36 hingga 1.00 (Tabel 9).
Tabel 9 Nilai koefisien kemiripan genetik 15 genotipe tetua dan F1 jarak pagar berdasarkan 11 primer marka RAPD
IND PDI JGY CRP KMR MDN LMP CxM LxP PxM PxL CxP KxK PlxPl LxL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 1.00 2 0.73 1.00 3 0.42 0.58 1.00 4 0.58 0.73 0.48 1.00 5 0.61 0.82 0.45 0.73 1.00 6 0.70 0.79 0.48 0.70 0.79 1.00 7 0.58 0.79 0.48 0.76 0.85 0.88 1.00 8 0.58 0.85 0.42 0.76 0.91 0.82 0.94 1.00 9 0.52 0.36 0.36 0.45 0.48 0.45 0.52 0.45 1.00 10 0.67 0.76 0.45 0.73 0.94 0.73 0.79 0.85 0.55 1.00 11 0.73 0.82 0.45 0.79 0.82 0.67 0.79 0.85 0.55 0.88 1.00 12 0.58 0.79 0.42 0.76 0.97 0.76 0.88 0.94 0.52 0.91 0.85 1.00 13 0.64 0.85 0.42 0.76 0.97 0.82 0.88 0.94 0.45 0.91 0.85 0.94 1.00 14 0.61 0.82 0.39 0.79 0.94 0.79 0.91 0.97 0.48 0.88 0.88 0.97 0.97 1.00 15 0.64 0.85 0.42 0.76 0.97 0.82 0.88 0.94 0.45 0.91 0.85 0.94 1.00 0.97 1.00
Nilai koefisien terendah (0.36) ditemukan antara genotipe LMPxPDI dengan JGY, dan LMPxPDI dengan JGY. Hal ini berarti bahwa jarak genetik antara genotipe LMPxPDI dengan JGY, dan LMPxPDI dengan JGY cukup jauh, karena memiliki koefisien kemiripan hanya 36%. Sedangkan nilai koefisien tertinggi (1.0) ditemukan antara genotipe LMPxLMP dan KMRxKMR. Genotipe LMPxLMP dan KMRxKMR mempunyai jarak genetik yang sangat dekat, karena mempunyai koefisien kemiripan 100%.
Gambar 11 menunjukkan dendrogram lima belas aksesi jarak pagar hasil analisis gerombol dengan metode UPGMA berdasarkan 33 lokus yang teramplifikasi. Hasil analisis gerombol berdasarkan data RAPD membentuk dendrogram dengan koefisien kemiripan berkisar 0.45-1.00 atau terdapat kemiripan 45-100%. Pada koefisien kemiripan 0.72, lima belas genotipe jarak pagar dapat dikelompokkan menjadi empat kelompok utama.
34
Gambar 11 Dendrogram 15 genotipe jarak pagar berdasarkan penanda RAPD yang dianalisis dengan SAHN-UPGMA pada program NTSYS-pc versi 2.02.
Kelompok I, III dan IV hanya terdiri dari satu genotipe, yaitu secara berturut-turut genotipe Indralaya (IND), Lampung x Pidi (LMP x PDI) dan Jogyakarta (JGY). Kelompok II terdiri dari dua belas genotipe yaitu Pidi (PDI), Komering (KMR), Komering x Komering (KMR x KMR), Lampung x Lampung (LMP x LMP), Curup x Medan (CRP x MDN), Palembang x Palembang (PLG x PLG), CurupxPidi (CRP x PDI), Pidi x Medan (PDI x MDN), Pidi x Lampung (PDI x LMP), Medan (MDN), Lampung (LMP) dan Curup (CRP).
Tahap 3 Analisis Karakteristik Populasi F2 Jarak Pagar Berdasarkan