2) Cemaran mikroba ALT, maks
3.3 Tahapan Penelitian
3.4.3 Analisis kimia
-sampel air jumlah 3.4.3 Analisis kimia
Analisis kimia yang dilakukan meliputi analisis proksimat (kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan kadar karbohidrat), protein larut garam, kadar pH, dan Total volatile base nitrogen (TVBN).
a) Kadar air (AOAC 1995)
Penentuan kadar air ini berdasarkan pada perbedaan berat contoh sebelum dan sesudah dikeringkan. Mula-mula cawan kosong yang akan digunakan dikeringkan dalam oven selama 30 menit pada suhu 105 °C atau sampai didapat berat yang tetap, kemudian cawan didinginkan selama 30 menit dalam desikator, setelah dingin kemudian cawan tersebut ditimbang.
Sampel sebanyak 5 gram ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan lalu dikeringkan dalam oven selama 12 jam pada suhu 100 °C sampai 102 °C. Cawan kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan setelah dingin ditimbang kembali. Persentase kadar air (berat basah) dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
Kadar air (%) = x 100 %
Keterangan : B = Berat sampel (g)
B1 = berat (sampel + cawan) sebelum dikeringkan (g) B2 = berat (sampel + cawan) setelah dikeringkan (g)
b) Kadar abu (AOAC 1995)
Prinsip penetapan kadar abu adalah dengan menimbang sisa mineral hasil pembakaran bahan organik pada suhu 650 °C. Cawan dipanaskan dalam oven lalu didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang beratnya. Sampel ditimbang sebanyak 5 gram dan diletakkan dalam cawan, kemudian dibakar dalam kompor listrik hingga tidak mengeluarkan asap. Cawan kemudian dimasukkan
kedalam tanur. Secara bertahap suhu tanur dinaikkan hingga mencapai suhu 650 °C hingga diperoleh abu yang berwarna putih keabu-abuan. Cawan kemudian
didinginkan dalam desikator, setelah cawan dingin kemudian cawan ditimbang. Presentase dari kadar abu dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
Kadar abu (%) = 100% (g) sampel Berat (g) abu Berat
c) Kadar protein (AOAC 1995)
Penentuan kadar protein kasar ini menggunakan metode semi mikro
Kjeldahl. Sampel sebanyak 0,75 gram dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl. Kedalam labu tersebut ditambahkan 6,25 gram K2SO4 dan 0,6225 gram CuSO4 sebagai katalisator. Sebanyak 15 ml H2SO4pekat dan 3 ml H2O2secara perlahan-lahan ditambahkan kedalam labu dan didiamkan selama 10 menit dalam ruang asam. Tahap selanjutnya adalah proses destruksi pada suhu 410 oC selama ± 2 jam atau hingga didapatkan larutan jernih. Hasil destruksi didiamkan hingga mencapai suhu kamar dan ditambahkan 50-75 ml akuades.
Disiapkan erlemenyer berisi 25 ml larutan H3BO3 4 % yang mengandung indikator (bromcheresol green 0,1% dan methyl red 0,1% (2:1)) sebagai penampung destilat. Labu Kjeldahl dipasang pada rangkaian alat destilasi uap. Ditambahkan 50 ml NaOH 40% (alkali). Dilakukan destilasi dan destilat ditampung dalam erlemenyer tersebut hingga volume destilat mencapai 150 ml (hasil destilat berwarna hijau).
Destilat dititrasi dengan HCl 0,2 N, dilakukan hingga warna berubah menjadi abu-abu natural. Blanko dilakukan seperti tahapan contoh. Pengujian contoh dilakukan duplo. Kadar protein dilakukan dengan rumus :
Kadar N (%) = sampel mg 100 x 14,007 x HCl N x blanko) ml -HCl (ml
Kadar protein (%) = % N x faktor konversi (6,25)
d) Kadar lemak (AOAC 1995)
Kadar lemak ditentukan dengan metode ekstraksi Soxhlet. Prinsipnya lemak diekstrak dengan pelarut dietil eter. Setelah pelarutnya diuapkan, lemaknya dapat ditimbang dan dihitung persentasenya.
Labu lemak yang ukurannya sesuai dengan alat ekstraksi Soxlet yang akan digunakan, dikeringkan dalam oven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang.
Sampel yang sudah dihomogenkan ditimbang sebanyak 5 gram. Dibungkus dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak. Selongsong sampel ditutup dengan kapas bebas lemak.
Pelarut dietil eter dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya, sesuai dengan ukuran soxhlet yang digunakan. Refluks dilakukan selama minimal 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi dan ditampung pelarutnya. Selanjutnya labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105 °C. Setelah didapatkan berat yang tetap, lemak dalam labu tersebut didinginkan dalam desikator. Selanjutnya lemak beserta labunya ditimbang dan dihitung kadar lemaknya. Kadar lemak dapat dihitung dengan menggunakan rumus : % 100 (g) sampel berat (g) lemak berat (%) lemak Kadar
e) Protein larut garam (PLG) (Shuffle dan Galberaeth 1964 dalamEryanto 2006) Sampel sebanyak 5 g ditambahkan 50 ml larutan NaCl 5 % kemudian di homogenkan dengan menggunakan homogenizer selama 2-3 menit, suhu blender tetap dijaga rendah. Setelah itu, sampel kemudian di sentrifuse pada 10.000 rpm selama 30 menit pada suhu 10 °C. Setelah itu, sampel disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman no.1. Filtrat yang didapat ditampung dalam Erlenmeyer, lalu disimpan pada suhu 4 °C. sampel. Sampel sebanyak 25 ml dianalis kandungan proteinnya dengan menggunakan metode semi-mikro Kjeldahl. Perhitungan kadar protein larut garam adalah :
Kadar PLG (%) = x 100 1000 x (g) sampel berat 6,25 x fp x 14,007 x HCl N x b) -(a
Keterangan : A = ml titrasi HCl sampel B = ml titrasi HCl blanko
f) Nilai pH (Suzuki 1981)
Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan alat pH meter yang dinyalakan terlebih dahulu selam 15-30 menit. Elektroda dibilas dengan aquades dan dikeringkan dengan tissue. Selanjutnya pH meter dikalibrasi dengan mencelupkan batang probe pada buffer pH 4 lalu dicelupkan kembali pada buffer
pH 7 lalu dibiarkan hingga stabil. Sampel sebanyak 5 g ditambahkan akuades 45 ml, kemudian dihomogenkan dengan menggunakan homogenizer selama 2-3 menit. Setelah sampel tercampur dengan baik, elektroda yang telah siap dicelupkan ke dalam sampel selama beberapa menit, nilai pH dibaca setelah menunjukkan angka yang stabil. Pengujian dilakukan dengan dua kali ulangan.
g) Total volatile base nitrogen(TVBN) (BSN 1998)
Prinsip dari pengujian terhadap kadar TVBN (Total Volatile Base Nitrogen) sampel adalah senyawa-senyawa basa volatil (ammonia, mono-, di-, trimetilamin, dll) yang terdapat dalam sampel yang bersifat basa diuapkan. Senyawa-senyawa tersebut diikat oleh asam borat dan dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N.
Penentuan TVBN dilakukan dengan metode Conway, dimana pertama-pertama 25 g sampel dihomogenkan dengan menggunakan homogenizer selama 25 menit dengan 75 ml larutan TCA 7 %, lalu disaring untuk mendapatkan filtrat yang bening. Sebanyak 1 ml H3BO3 2 % dimasukkan ke dalam inner chamber
cawan Conway dan 1 ml filtrat ke outer chamber. Sebelum cawan ditutup, pinggir cawan diolesi vaselin agar penutupan sempurna, pada posisi hampir menutup ditambahkan K2CO31 :1 (b/v) ke dalam outer chamber sebanyak 1 ml kemudian cawan Conway segera ditutup.
Blanko dikerjakan dengan mengganti sampel dengan filtrat TCA 7 % dengan produr yang sama seperti diatas. Setelah itu sampel diinkubasi pada suhu 35 °C selama 24 jam. Selanjutnya larutan asam borat yang mengandung sampel atau tidak (blanko) ditetesi 2 tetes inkubator (methyl red 0,1 dan bromethyl blue
0,1 %, dengan perbandingan 2:1), kemudian dititrasi dengan larutan HCl sambil diaduk sehingga warnanya berubah menjadi merah muda. Kadar TVBN dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Kadar TVBN (mgN/100g) = (g) sampel berat 100 x fp x 14,007 x HCl N x j) -(i
Keterangan : i = volume titrasi sampel (ml) j = volume titrasi blanko (ml) fp = faktor pengenceran
N HCl = normalitas HCl 14,007 = bobot atom nitrogen