3.3 Tahapan Penelitian
3.4.2 Analisis kimiawi
Analisis kimiawi yang dilakukan pada penelitian ini meliputi analisis proksimat (kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak), pengukuran nilai pH, analisa total asam laktat tertitrasi dan analisis asam amino bebas.
(1) Analisis kadar air (AOAC 2005)
Cawan porselin dikeringkan di dalam oven selama satu jam dengan suhu 105 oC, lalu didinginkan di dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang hingga mendapatkan berat konstan. Sampel ditimbang sebanyak 2 gram, dimasukkan ke dalam cawan porselin kemudian dikeringkan di dalam oven 105 oC selama 5 jam atau hingga berat konstan. Setelah itu cawan berisi sampel didinginkan di dalam desikator selama 30 menit, lalu ditimbang. Apabila belum
didapatkan berat konstan, cawan porselin dipanaskan lagi ke dalam oven (105oC) selama 30 menit. Hal tersebut harus dilakukan berulang-ulang sampai didapatkan berat konstan. Penentuan kadar air menggunakan rumus :
Kadar air (%) = ሺ ୣ ୰ ୟ ୲ ୱ ୟ ୫ ୮ ୣ ୪ ୟ ୵ ୟ ୪ሻି( ୣ ୰ ୟ ୲ ୱ ୟ ୫ ୮ ୣ ୪ ୟ ୩ ୦ ୧ ୰)
ୣ ୰ ୟ ୲ ୱ ୟ ୫ ୮ ୣ ୪ ୟ ୵ ୟ ୪() x 100%
(2) Analisis kadar abu (AOAC 2005)
Cawan porselin dikeringkan di dalam oven selama satu jam dengan suhu 105 oC, lalu didinginkan di dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang
hingga mendapatkan berat konstan. Sampel ditimbang sebanyak 2 gram, dimasukkan ke dalam cawan porselin dan dipijarkan diatas nyala api pembakar Bunsen hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur listrik (furnace) dengan suhu ≤ 550 oC selama 2 jam. Selanjutnya cawan didinginkan selama 30 menit pada desikator, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat konstan. Penentuan kadar abu menggunakan rumus :
Kadar abu (%) = ୣ ୰ ୟ ୲ ୟ ୠ ୳()
ୣ ୰ ୟ ୲ ୱ ୟ ୫ ୮ ୣ ୪()x 100%
(3) Analisis kadar protein (AOAC 2005)
Penentuan kadar protein ini menggunakan metode semi-mikro Kjeldahl. Sampel sebanyak 0,75 g dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl. Ke dalam labu tersebut ditambahkan 6,25 g K2SO4 dan 0,6225 g CuSO4 sebagai katalisator. Sebanyak 15 ml H2SO4 pekat dan 3 ml H2O2secara perlahan-lahan ditambahkan kedalam labu dan didiamkan selama 10 menit dalam ruang asam. Tahap selanjutkan adalah proses destruksi pada suhu 410oC selama + 2 jam atau hingga didapatkan larutan jernih. Hasil destruksi didiamkan hingga mencapai suhu kamar dan ditambahkan 50–75 ml akuades. Erlenmeyer disiapkan dan diiisi dengan 25 ml larutan H3BO34% yang mengandung indikator (Bromchresol green 0,1% dan methyl red 0,1% (2:1)) sebagai penampung destilat. Labu Kjeldahl dipasang pada rangkaian alat destilata uap dan ditambahkan 50 ml NaOH 40%
(alkali). Kemudian hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer tersebut hingga volume destilat mencapai 150 ml (hasil destilat berwarna hijau).
Destilat dititrasi dengan HCl 0,2 N, dilakukan hingga warna berubah menjadi abu-abu natural. Blanko dilakukan seperti tahapan contoh tanpa menggunakan sampel. Pengujian contoh dilakukan duplo. Kadar protein dihitung dengan rumus:
Kadar protein (%) = ሺ୫ ୪ ୌ େ ୪ ି ୫ ୪ ୠ ୪ ୟ ୬ ୩ ୭ሻ୶ ୌ େ ୪ ୶ ଵ ସ, ୶ ϐ ୩
ୠ ୣ ୰ ୟ ୲ ୱ ୟ ୫ ୮ ୣ ୪(୫ ) x 100%
(4) Analisis kadar lemak ( AOAC 2005)
Labu lemak yang telah dikeringkan di dalam oven (105 oC) ditimbang hingga mendapatkan berat konstan. Sebanyak 2 gram sampel dibungkus dengan kertas saring bebas lemak kemudian dimasukkan ke dalam selongsong lemak. Selongsong tersebut dimasukkan ke dalam tabung soxhlet. Sebanyak 150 ml kloroform dimasukkan ke dalam labu lemak. Sampel direfluks selama 8 jam, dimana pelarut sudah terlihat jernih yang menandakan lemak telah terekstrak semua. Selanjutnya pelarut yang ada pada labu lemak dievaporasi untuk memisahkan pelarut dan lemak, kemudian labu lemak dikeringkan dengan oven 105 oC selama 30 menit. Setelah itu ditimbang hingga didapatkan berat konstan. Penentuan kadar lemak menggunakan rumus :
Kadar lemak (%) = ( ୣ ୰ ୟ ୲ ୪ ୟ ୠ ୳ ୟ ୩ ୦ ୧ ୰ ି ୣ ୰ ୟ ୲ ୪ ୟ ୠ ୳ ୟ ୵ ୟ ୪)
ୣ ୰ ୟ ୲ ୱ ୟ ୫ ୮ ୣ ୪ x 100%
(5) Pengukuran nilai pH (Hanna 1995)
Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan alat pH-meter digital yang dinyalakan terlebih dahulu selama 15–30 menit. Elektroda dibilas dengan akuades dan dikeringkan dengan tissue. Selanjutnya pH-meter dikalibrasi dengan mencelupkan batang probepada buffer pH 4 lalu dicelupkan kembali pada buffer pH 7 dibiarkan beberapa saat hingga stabil. Sampel sebanyak 5 ml ditambahkan akuades 45 ml, kemudian dihomogenkan dengan stirrer selama 2 menit.
Elektroda dicelupkan ke dalam sampel selama beberapa menit, nilai pH dibaca setelah menunjukkan angka stabil.
(6) Total asam tertitrasi (Fardiaz 1989)
Sebanyak 10 ml sampel dipipet, kemudian dilarutkan dengan aquades dalam gelas piala sampai tanda tera 100 ml, lalu sampel didiamkan selama 30 menit dan diaduk. Larutan ini lalu disaring dan dipipet sebanyak 10 ml lalu ditambahkan 2–3 tetes indikator fenoftalein. Titrasi dengan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah muda. Persentase asam laktat yang dibentuk dihitung berdasarkan rumus :
Total asam laktat (TA) = ୟ ୶ ୠ ୶ ୡ ୶ ୢ ୣ ୶ ଵ x 100%
Keterangan :
a = jumlah NaOH yang terpakai (ml) b = normalitas NaOH (0,1 N)
c = berat molekul (BM) asam laktat (90) d = pengenceran (10)
e = berat sampel (gram)
(7) Analisis asam amino bebas (Ishida et al.1987)
Preparasi sampel untuk pengujian asam amino bebas dilakukan tanpa proses hidrolisis. Sampel digerus sampai halus kemudian ditimbang sebanyak 2,55 gram. Sampel kemudian direndam di dalam sulfosalycylic acid (SSA) 5% selama 1–2 jam untuk proses presipitasi sehingga protein terpisah dari zat-zat lainnya. Kemudian dilakukan penyaringan dengan kertas saring whatman, disentrifuse (3000x g selama 30 menit), dan penyaringan lagi dengan menggunakan kertas milipore0,45µm.
Sampel sebanyak 10 μl dimasukkan kedalam tabung vial kosong dan ditambahkan pereaksi ortoftalaldehida (OPA) 25 μl, kemudian dibiarkan selama satu menit agar derivatisasi berlangsung sempurna. Sebanyak 5 μl larutan sampel
diinjeksikan ke dalam kolom HPLC, kemudian ditunggu sampai pemisahan semua asam amino selesai. Waktu yang diperlukan sekitar 25 menit. Kandungan asam amino bebas dalam sampel dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Konsentrasi asam amino bebas (μmol) = ୳ ୟ ୱ ୮ ୳ ୬ ୡ ୟ ୩ ୱ ୟ ୫ ୮ ୣ ୪
୳ ୟ ୱ ୮ ୳ ୬ ୡ ୟ ୩ ୱ ୲ ୟ ୬ ୢ ୟ ୰ x konsentrasi standar
Asam amino bebas (mg/g) = ୱ ୟ ୫ ୟ ୫ ୧ ୬ ୭ ୠ ୣ ୠ ୟ ୱ(ஜ ୫ ୭ ୪)୶ ୠ ୣ ୰ ୟ ୲ ୫ ୭ ୪ ୣ ୩ ୳ ୪
ୣ ୰ ୟ ୲ ୱ ୟ ୫ ୮ ୣ ୪(ஜ ୰ ୟ ୫) x 1000
Kondisi operasi alat HPLC yang digunakan adalah sebagai berikut: Temperatur 27o C (suhu ruang), jenis kolom Ultra Techspere, kecepatan aliran eluen 1 ml/menit, tekanan sebesar 3000 psi, fase mobil (eluen) terdiri dari dua macam buffer yaitu buffer A (buffer asetat 0,025 M, pH 6,5) dan buffer B (larutan methanol 95%) dengan gradien seperti yang tercantum pada Tabel 4, detektor fluoresensi, panjang gelombang eksitasi 350 nm dan panjang gelombang emisi 450 nm serta kolom derivatisasiberupa pre-column derivatization.
Tabel 4 Hubungan antara waktu elusi dengan gradien buffer B Waktu (menit) Laju aliran eluen (ml/menit) Buffer B (%)
0 1 0 1 1 0 2 1 15 5 1 15 13 1 42 15 1 42 20 1 70 22 1 100 26 1 100 28 1 0 38 1 0
3.4.3 Uji total mikroba (TPC) (Fardiaz 1989)
Prinsip kerja dari analisis total mikroba/total plate count (TPC) adalah perhitungan jumlah koloni mikroba yang ada di dalam sampel dengan pengenceran sesuai dengan keperluan dan dilakukan secara duplo. Pembuatan larutan contoh dengan cara mencampurkan 1 g sampel dan diblender bersama
larutan pengencer (garam fisiologis) sebanyak 10 ml larutan pengencer sampai homogen.
Pengenceran dilakukan dengan cara memipet 1 ml larutan contoh yang sudah homogen dengan pipet steril dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi larutan pengencer (garam fisiologis) sebanyak 9 ml sehingga terbentuk pengenceran hingga 10-1. Kemudian dengan cara yang sama dilakukan pengenceran hingga diperoleh larutan dengan pengenceran 10-5. Setiap pengenceran diambil sebanyak 1 ml untuk ditambahkan ke media (plate count agar/PCA), kemudian diratakan dan disterilkan dengan pembakaran. Cawan petri yang telah berisi agar dan larutan contoh dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi cawan terbalik. Suhu inkubator yang digunakan adalah 35 oC dan diinkubasi selama 48 jam, selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah koloni yang ada di dalam cawan petri.
Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptik untuk mencegah kontaminasi yang tidak diinginkan dan pengamatan secara duplo dapat meningkatkan ketelitian. Jumlah koloni yang dapat dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni antara 30–300.
3.5 Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Rancangan percobaaan yang digunakan pada penelitian pendahuluan adalah ada dua rancangan yaitu sebagai berikut :
(a) Rancangan percobaan pada penentuan bahan penghidrolisis dan lama hidrolisis menggunakan rancangan acak lengkap faktorial dengan 2 faktor yaitu faktor bahan penghidrolisis terdiri dari 3 taraf (air tajin, jus nenas, sari nenas) dan lama hidrolisis terdiri dari 3 taraf (10 hari, 20 hari dan 30 hari), masing-masing dilakukan tiga kali pengulangan. Model matematika rancangan acak lengkap faktorial menurut Steel dan Torrie (1991) adalah sebagai berikut :
Keterangan :
Yijk = nilai pengamatan faktor bahan penghidrolisis (i), lama hidrolisis (j) pada ulangan ke -k
µ = nilai tengah populasi (nilai rata-rata sesungguhnya) Ai = pengaruh faktor bahan penghidrolisis pada taraf ke-i Bj = pengaruh faktor lama hidrolisis pada taraf ke-j
(AB)ij= pengaruh interaksi antara bahan penghidrolisis (i) dengan lama hidrolisis (j) pada ulangan ke-k
εijk = faktor galat
(b) Rancangan percobaan pada penentuan komposisi menggunakan rancangan acak lengkap dengan 1 faktor yaitu komposisi gonggong dan bahan penghidrolisis yang terdiri dari 5 taraf (1:1, 1:2,1:3,1:4 dan 1:5), masing-masing dilakukan tiga kali pengulangan. Model matematika rancangan percobaannya menurut Steel dan Torrie (1991) adalah sebagai berikut :
Yij = µ + Ai + εij Keterangan :
Yij= nilai pengamatan pada satuan percobaan ke-j pada perlakuan faktor A taraf ke-i
µ = nilai tengah populasi (nilai rata-rata sesungguhnya)
Ai= pengaruh komposisi gonggong dan bahan penghidrolisa pada taraf ke-i (i = 1:1,1:2,1:3,1:4 dan 1:5)
εij= faktor galat
Rancangan percobaan pada penelitian lanjutan menggunakan rancangan acak lengkap faktorial dengan 2 faktor yaitu faktor teknik pemutusan proses fermentasi yang terdiri dari 2 taraf (pasteurisasi, sterilisasi) dan faktor lama penyimpanan (0 hari, 7 hari dan 14 hari), masing-masing dilakukan tiga kali pengulangan. Model matematika rancangan acak lengkap faktorial menurut Steel dan Torrie (1991) adalah sebagai berikut :
Keterangan :
Yijk = nilai pengamatan faktor teknik pemutusan proses fermentasi (i), faktor lama penyimpanan (j) pada ulangan ke -k
µ = nilai tengah populasi (nilai rata-rata sesungguhnya)
Ai = pengaruh faktor teknik pemutusan fermentasi pada taraf ke-i Bj = pengaruh faktor lama penyimpanan pada taraf ke-j
(AB)ij= pengaruh interaksi antara teknik pemutusan proses fermentasi (i) dengan lama penyimpanan (j) pada ulangan ke-k
εijk = faktor galat
Data yang diperoleh dianalisis ragam (anova). Hasil analisis ragam yang menunjukkan perbedaan nyata akan diuji lanjut dengan menggunakan uji lanjut Duncan.
Data organoleptik merupakan data non-parametrik sehingga dianalisis dengan menggunakan Uji Mann-Withney (pairwise comparison) dengan taraf nyata α = 0,05, untuk uji perbandingan pasangan dan berdasarkan pedoman SNI 01-2346-2006 untuk menentukan nilai sensori akhir pada uji hedonik dan skoring yaitu dengan menggunakan batas interval bawah dengan pembulatan ke bilangan bulat terdekat.
Uji Mann-Withney (pairwise comparison) merupakan metode untuk sampel yang memiliki nilai sama besar dari dua populasi yang independen. Ini adalah salah satu uji yang paling terkenal signifikansinya untuk data non- parametrik. Uji Mann Withney sering juga disebut uji Wilcoxon Rank sum test untuk dua populasi (Iriawan dan Septin 2006). Menurut Santoso (2005), dalam analisis Mann-Whitney digunakan hipotesis sebagai berikut :
H0: 1 2(kelompok 1 lebih baik daripada kelompok 2) H1 : 1 2(kelompok 1 lebih buruk daripada kelompok 2)
Dasar pengambilan keputusan uji Mann-Whitneyadalah : Jika probabilitas > 0,1 maka Hoditerima.
Langkah-langkah melakukan uji Mann-Whitney diantaranya sebagai berikut :
1. Membuat ranking untuk sampel pertama dan sampel kedua dari 1 sampai (n1 + n2). Dalam hal ini n1 adalah banyaknya data dalam sampel pertama (x1) dan n2adalah banyaknya data dalam sampel kedua (x2). Apabila ada ranking yang sama, maka ranking data adalah rata-rata ranking.
2. Menjumlahkan ranking untuk sampel pada sampel x1(W).
3. Menghitung nilai taksiran, yaitu median selisih antara sampel pertama (x1) dan sampel kedua (x2).
Data dapat diinterpretasikan berupa jumlah dan median masing-masing sampel yang digunakan. Nilai taksiran yang tertera merupakan median selisih antara sampel pertama dan sampel kedua.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN