METODE PENELITIAN
3.6 Analisis Fosfor
3.6.1 Analisis Kualitatif Fosfor
Analisis Kualitatif fosfor dapat dilakukan dengan pereaksi ammonium molibdat dan barium klorida. Analisis kualitatif dilakukan pada larutan sampel.
1. Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 5 ml larutan sampel, ditambahkan pereaksi ammonium molibdat 4% b/v ± 2 ml, dikocok lalu didiamkan, maka akan terbentuk endapan kuning.
2. Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 5 ml larutan sampel, ditambahkan pereaksi barium klorida 5% b/v ± 1 ml, dikocok lalu didiamkan, maka akan terbentuk endapan putih yang larut dalam asam encer.
3.6.2 A nalisis K uantitatif F osfor
3.6.2.1 Pembuatan L ar utan I nduk B aku K H2PO4 (L I B I )
Ditimbang 0,2195 g KH2PO4 yang telah dikeringkan di dalam oven dengan suhu 105ºC, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 500 ml, ditambahkan 25 ml larutan HNO3 5 N, dikocok hingga larut, dicukupkan volumenya dengan akuabides hingga garis tanda. Diperoleh konsentrasi fosfor pada Larutan Induk Baku ( LIB) I adalah 100 µg/ml (Sitompul, 2009).
Perhitungan konsentrasi Larutan Induk Baku dapat dilihat pada Lampiran 8, halaman 44.
3.6.2.2 Pembuatan K ur va Ser apan L ar utan K H2PO4
Dari LIB I dipipet 3 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml kemudian dicukupkan dengan akuabides hingga garis tanda. Dipipet 1 ml larutan tersebut, ditambahkan 5 ml akuabides, dan 1 ml larutan pengembang warna fosfor lalu dikocok (konsentrasi 0,8571 µg/ml). Diukur serapan pada rentang λ 400-800 nm.
3.6.2.3 Penentuan W aktu K er ja
Dari LIB I dipipet 3 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dicukupkan volumenya dengan akuabides hingga garis. Dipipet 1 ml larutan tersebut, ditambahkan 5 ml akuabides dan 1 ml larutan pengembang warna fosfor,
dikocok, dan didiamkan (konsentrasi 0,8571 µg/ml). Kemudian diukur serapan
pada λ maksimum 705 nm mulai menit ke-1 hingga menit ke-60 dengan interval
waktu 1 menit.
3.6.2.4 Pembuatan K ur va K alibr asi L ar utan B aku F osfor
Dari LIB I tersebut dipipet (1; 2; 3; 4; dan 5) ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, kemudian dicukupkan volumenya dengan akuabides hingga garis tanda. Dipipet masing-masing 1 ml larutan tersebut, ditambahkan 5 ml akuabides dan 1 ml larutan pengembang warna fosfor, dikocok dan didiamkan selama 20 menit. Didapat kosentrasi larutan (0,2857; 0,5714; 0,8571; 1,1429; dan 1,4286) μg/ml. Diukur serapan pada λ maksimum 705 nm pada menit ke-20 dengan spektrofotometer sinar tampak.
3.6.2.5 Penetapan K adar F osfor Dalam Sampel
3.6.2.5.1 Penetapan K adar F osfor pada C acing T anah Megascolex sp.
Dipipet 10 ml larutan sampel, dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml, dicukupkan volume dengan akuabides hingga garis tanda. Dari labu tersebut dipipet 10 ml, dimasukkan ke dalam labu 25 ml, dicukupkan volume dengan akuabides hingga garis tanda. Dipipet 1 ml larutan tersebut, dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 5 ml larutan pengembang warna fosfor dan 1 ml akuabides. Didiamkan selama 20 menit. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 705 nm. Pengukuran harus dilakukan dalam rentang waktu kerja yang telah diperoleh.
Dipipet 1 ml larutan sampel, dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 5 ml akuabides dan 1 ml larutan pengembang warna fosfor. Didiamkan selama 20 menit. Diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 705 nm. Pengukuran harus dilakukan dalam rentang waktu kerja yang telah diperoleh.
Nilai serapan yang diperoleh harus berada dalam rentang nilai kurva kalibrasi larutan baku, Dengan demikian konsentrasi fosfor dapat dihitung berdasarkan persamaan garis regresi linier dari kurva kalibrasi.
Menurut Walpole (1982), kadar fosfor dapat dihitung dengan rumus:
Kadar =C × V × VP W
Keterangan: C = Konsentrasi larutan sampel setelah pengenceran (μg/ml) V = Volume labu tentukur (ml)
FP = Faktor pengenceran W = Berat sampel (g)
3.7 A nalisis Data Secar a Statistik 3.7.1 Penolakan H asil Pengamatan
Kadar fosfor yang diperoleh dari hasil pengukuran masing-masing larutan sampel dianalisis dengan uji distribusi dengan rumus:
thitung =�(x−x�) SD/√6�
Data ditolak apabila t hitung lebih besar dari t tabel, dan sebaliknya. Untuk mencari standar deviasi (SD) digunakan rumus:
SD =�∑(x−x�)2 n−1
Keterangan: x = Kadar sampel x
� = Kadar rata-rata sampel n = Jumlah pengulangan
dan untuk menentukan kadar mineral di dalam sampel dengan interval kepercayaan 99%, ɑ = 1%, dk = n-1, dapat digunakan rumus:
μ= x�± (t(α/2,dk )× SD/√n)
Keterangan: x : Kadar rata-rata sampel SD : Standard deviasi
dk : Derajat kebebasan (dk = n-1) α : Tingkat kepercayaan
n : Jumlah pengulangan
3.7.2 Pengujian B eda Nilai R ata-R ata A ntar Sampel
Menurut Sudjana (2005), sampel yang dibandingkan adalah independen dan jumlah pengamatan masing-masing lebih kecil dari 30 dan variasi (σ) tidak diketahui sehingga dilakukan uji F untuk mengetahui apakah variasi kedua populasi sama (σ0= σ1) atau berbeda (σ0≠σ1) dengan menggunakan rumus:
Fo = S1
2
S22
Keterangan: F0 : Beda nilai rata-rata S1 : Standard deviasi terbesar S2 : Standard deviasi terkecil
Menurut Walpole (1982), apabila dari hasil perhitungan diperoleh F0 tidak melewati nilai kritis F, maka perhitungan dilanjutkan dengan menggunakan uji distribusi t dengan rumus:
Sp =�(n1−1)S12+ (n2−1)S22 n1+n2−2 to = X�1−X�2 S�n1 1+ 1 n2
Keterangan: x�1 : Kadar rata-rata sampel 1
x
�2 : Kadar rata-rata sampel 2
Sp : Simpangan baku
S1 : Standard deviasi sampel 1 S2 : Standard deviasi sampel 2
Jika F0 melewati niai kritis F, maka perhitungan dilanjutkan dengan menggunakan uji distribusi t dengan rumus
to = X�1−X�2 S�n1
1+
1 n2
Keterangan: x�1 : Kadar rata-rata sampel 1
x
�2 : Kadar rata-rata sampel 2
Sp : Simpangan baku
S1 : Standard deviasi sampel 1 S2 : Standard deviasi sampel 2
Kedua sampel dikatakan berbeda apabila t0 yang diperoleh melewati nilai kritis t, dan sebaliknya (Sudjana, 2005).
3.8 V alidasi M etode
Uji perolehan kembali atau recovery dilakukan dengan metode penambahan larutan baku (standard addition method). Dalam metode ini, kadar fosfor dalam sampel ditentukan terlebih dahulu, selanjutnya dilakukan penentuan kadar fosfor dalam sampel setelah penambahan larutan standar dengan konsentrasi tertentu (Ermer dan Miller, 2005).
Cacing tanah yang telah dikeringkan ditimbang seksama sebanyak 5 gram, ditambahkan 10 ml larutan baku fosfor (100 µg/ml), kemudian dilanjutkan dengan prosedur destruksi basah seperti yang telah dilakukan sebelumnya. Selanjutnya diukur absorbansinya sebagaimana perlakuan terhadap sampel.
Menurut Harmita (2004), persen perolehan kembali (uji recovery) dapat dihitung dengan rumus di bawah ini:
%��������=(��− ��)
��∗ × 100%
Keterangan: CF = Kadar larutan sampel setelah penambahan baku CA = Kadar rata-rata sampel
CA* = Kadar larutan standard yang ditambahkan 3.8.2 Simpangan B aku R elatif
Keseksamaan atau presisi diukur sebagai baku relatif atau koefisien variasi. Keseksamaan atau presisi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual kestika suatu metode dilakukan secara berulang yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan adanya kesekasamaan metode yang dilakukan (Harmita,2004).
Simpangan baku relatif dapat dihitung dengan rumus di bawah ini.
RSD =SD X
Keterangan: x� = Kadar rata-rata sampel SD = Standard deviasi
RSD = Relative Standard Deviasi
3.8.3 Penentuan B atas Deteksi (L imit of Detection) dan B atas K uantitasi (L imit of Quantitation)
Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi merupakan kuantitas terkecil analit salam sampel yang yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004).
Menurut Harmita (2004), batas deteksi dan batas kuantitasi ini dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
SY/X = �(Y−Yi)2 n−2 LOD =3 × SY/X Slope LOQ = 10 × SY/X Slope
BAB IV