Analisis Molekular

BAB III. METODE PENELITIAN

F. Analisis Molekular

Beberapa metode dilakukan untuk mendapatkan data molekular dari isolat. Metode yang dilakukan adalah sebagai berikut.

1. Isolasi Genom DNA

Ekstrasi DNA diawali dengan memasukkan 1,5 ml 1xTE Buffer ke dalam isolat basah dan disentrifugasi. Perlakuan ini diulangi sebanyak 4 kali untuk mencuci sel. Setelah dicuci, pellet ditambahkan 500 µl 5 mM EDTA (pH 8.0) dan 50 µl lysozyme. Isolat kemudian di inkubasi di dalam water bath selama 1 jam pada suhu 37 o_{C. Setelah diinkubasi, isolat ditambahkan 50 µl 20% SDS (Sodium}

Dodecyl Sulfate) dan 50 µl proteinase K solution yang selanjutnya diinkubasi di water bath selama 1 jam pada suhu 55 o_{C. Selama inkubasi, setiap 5 menit isolat}

digoyang pelan-pelan untuk membantu mengeluarkan DNA. Setelah selesai, isolat kemudian ditambahkan 400 µl 25:24:1 PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol), dikocok selama 1 menit dan disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm, supernatan kemudian diambil dan dimasukkan kedalam

eppendof tube yang baru. Perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Supernatan yang telah didapatkan kemudian ditambahkan 3M Na acetate 1/10 volume dari supernatan dan 2-propanol 2 kali volume dari supernatan. Dikocok, DNA akan terlihat berwarna putih seperti benang-benang lendir. Eppendof tube berisi DNA kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Supernatan kemudian dibuang, dan pellet ditambahkan 70% ethanol untuk membersihkan sisa-sisa larutan. Setelah itu DNA dikerinkan dengan cara membiarkan diuapkan pada temperatur ruang. DNA yang telah kering kemudian ditambahkan 500 µl 1x TE Buffer dan dilarutkan. Setelah itu ditambahkan 50 µl Rnase A solution dan 0.5 µl Rnase T1 solution kemudian diinkubasi di dalam water bath selama 30 menit pada suhu 37 o_{C. Larutan kemudian ditambahkan 50}

µl Proteinase K dan di inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 o_{C. Setelah selesai}

kemudian dilakukan lagi perlakuan dengan PCI sebanyak 3 kali. Supernatan kembali ditambahkan 3M Na acetate 1/10 volume dari supernatan dan 2- propanol 2 kali volume dari supernatan. Eppendof tube berisi DNA kemudian di sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Supernatan kemudian dibuang, dan pellet ditambahkan 70% ethanol untuk membersihkan sisa-sisa larutan. DNA kering kemudian disimpan di dalam kulkas suhu 4 o_C.

2.

Determinasi G+C Content

DNA kering dilarutkan di dalam 25 µl aquades steril, direbus selama 10 menit dan langsung didinginkan di dalam es. Setelah itu ditambahkan 10 µl nuclease P1 solution dan diinkubasi di dalam water bath selama 1 jam pada suhu 50 o_C.

Setelah itu ditambahkan 10 µl BAP solution dan di inkubasi di dalam water bath selama 24 jam pada suhu 37 o_{C. Setelah itu ditambahkan 10 µl BAP solution dan}

25 µl nuclease P1 solution, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o_{C. Sampel}

kemudian dianalisis dengan menggunakan HPLC. Kondisi HPLC yang digunakan disajikan pada Tabel 10.

Tabel 10. Kondisi HPLC untuk Derminasi G+C Content

Tahapan Kondisi

Kolom ODS C-18 (4.6 x 150 mm, Cosmosil

5C18-MS-II, 38019-81, Nakalai tesque, Tokyo, Japan.

Temperatur 35 o_C

Fase Mobile Campuran 0,2 M NH4H2PO4-CH3CN

(40 :1 )

Flow Rate 1,0 ml/min

Deteksi UV Detector (270 nm)

Larutan Pencuci 20% CH3CN

3. Isolasi Gen 16S rRNA

Isolasi diawali dengan cara melisiskan sel bakteri secara fisik. Isolat diambil dengan metode sumuran sebanyak 5 koloni dan dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi bead. Koloni kemudian di fragmentasi selama 10 menit. Hasil lisis kemudian dimasukkan kedalam mikrotube untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 5-10 menit. Setelah selesai, supernatan dibuang. Pellet yang tersisa kemudian dicuci dengan 1xTE solution sebanyak 3 kali dan ditambahkan TE solution hingga berjumlah 150 µl. Selanjutnya ditambahkan 20 µl lysozyme dan dikocok. Isolat kemudian diinkubasi pada water bath selama 1 jam dengan suhu 37 o_{C. Setelah selesai kemudian ditambahkan 50}

µl 20% SDS dan 50 µl Proteinase K. Isolat kemudian di inkubasi pada suhu 55 o_C.

selama 30 menit di dalam water bath. Isolasi DNA selanjutnya dilakukan menggunakan bantuan Promega Kit. 50 µl dari isolat diambil dan dipindahkan ke tempat baru. Selanjutnya ditambahkan 5 µl “FastBreak Cell Lysis Reagent” dan 100 µl “ SV Lysis Buffer” lalu dikocok. Diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit sambil dikcok beberapa kali. Selanjutnya ditambahkan 40 µl “MagneSil ´dan dikocok serta diinkubasi selama 4 menit pada suhu ruang. Supernatan kemudian dihilangkan dan ditambahkan 100 µl 80% ethanol. Supernatan kembali dihilangkan kemudian dikeringkan dengan partikel magnetik selama 7-10 menit. Selanjutnya ditambahkan 100 µl aquades steril dan dikocok. Di inkubasi pada suhu 65 o_{C selama 10 menit sambil dikocok beberapa kali. Plate kemudian}

diletakkan pada magnetic stand dan dipindahkan ke tube baru. Selanjutnya dilakukan amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan PCR. Primer yang digunakan adalah sebagai berikut (Brosius et al., 1981).

Tabel 11. Primer yang digunakan untuk analisis sequencing gen 16S rRNA (Brosius et al., 1981)

Primer Basa

9F 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG

1541R 5’-AAGGAGGTGATCCAGCC

PCR dilakukan menggunakan kit TaKaRa Ex Taq. Larutan PCR yang digunakan adalah campuran dari Template DNA 1 µl 10 ng/ µl, 10xreaction buffer 5 µl, dNTP mix 4 µl, primer 9F 1 µl, Primer 1541R 1 µl, Taq Polymerase 0,25 µl dan aquades steril 37,75 µl. Kondisi PCR yang digunakan disajikan pada Tabel 12.

Tabel 12. Kondisi PCR untuk mendapatkan produk PCR

Tahapan Kondisi

3 menit, 95 o_C

Pre-denaturation

Denaturation 30 detik, 95 o_C

Annealing 15 detik, 55 o_{C 30 siklus}

Elongation 1 menit, 72 o_C

Final Extension 5 menit, 72 o_C

Produk PCR selanjutnya dilakukan purifikasi dan analisis. Produk PCR murni ditambahkan 90 µl magnetic beads solution, di-vortex selama 30 detik kemudian diletakkan pada magnetic plate selama 3 menit dan dihilangkan supernatannya. Selanjutnya ditambahkan 200 µl 70% ethanol dan dihilangkan supernatannya kemudian diulang sekali lagi. Plate kemudian dikeringkan selama 5 menit dan ditambahkan aquades steril sebanyak 40 µl. Isolat kemudian di-vortex selama 30 detik dan ditaruh pada magnetic plate. Supernatan kemudian dipindahkan ke plate baru. Selanjutnya dipersiapkan 1% Agarose-gel dan dilakukan penuangan 1xTAE pada mesin elektroforesis. Selanjutnya dipersiapkan 1 µl 6x loading buffer + 4 µl Produk PCR dan 1 µl 6xLoading buffer + 5 µl 100 bp DNA ladder dan dilakukan elektroforesis. Gel kemudian dimasukkan kedalam larutan ethidium bromide selama 15-30 menit. Spot kemudian dilihat dibawah lampu UV. Produk PCR

yang telah dimurnikan selanjutnya dilakukan sekuensing gen 16S rRNA menggunakan BigDye terminator V3. 1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystem) dengan 2 primer yaitu forward primer adalah 9F serta reverse primer 1541R. Larutan yang digunakan untuk sequencing PCR merupakan campuran Template DNA 1 µl 10 ng/µl, BigDYE Terminator 2 µl, 5x Premix Buffer 1 µl, Setiap primer 1 µl dan aquades steril 5 µl. Kondisi yang digunakan disajikan pada Tabel 13.

Tabel 13. Kondisi PCR untuk Sequencing gen 16S rRNA

Tahapan Kondisi

Pre-denaturation 1.5 menit, 96 o_C

Denaturation 10 detik, 96 o_C

Annealing 5 detik, 50 o_{C 25 Siklus}

Elongation 4 menit, 60 o_C

Final Extension 5 menit, 72 o_C

4. Pembuatan Pohon Filogenetik

Pembuatan pohon filogenetik 10 isolat yang digunakan dalam penelitian kali ini diawalai dengan mendapatkan sequence 16S rRNA yang sebelumnya telah dilakukan deteksi oleh peneliti dari LIPI sebelumnya. Hasil sequencing ini selanjutnya dilakukan pencarian spesies menggunakan website BLAST (Basic Local Assignment Search Tool). Hasil yang didapatkan paling mendekati selanjutnya dicatat. Untuk mendapatkan hasil spesies yang paling mendekati, selanjutnya dilakukan perbandingan dengan menggunakan pohon filogenetik. Pembanding untuk spesies yang didapatkan dari hasil BLAST digunakan seluruh data 16S rRNA spesies yang terdaftar di dalam satu genus yang berada di website LPSN (List of Prokaryotic names with standing in Nomenclature). Seluruh data yang telah didapatkan kemudian dianalisis menggunakan program MEGA6 yang berfungsi untuk membantu pembuatan pohon filogenetik. Data sequence 16S rRNA dari isolat dan LPSN kemudian di align menggunakan ClustalW yang berada di dalam MEGA6. Setelah di align kemudian dilakukan pembuatan pohon filogenetik dengan menggunakan parameter Kimura-2 method dan bootstrap sebanyak 1000 kali.