BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
E. Analisis Senyawa Hasil Sintesis
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan fisika-kimia yang didasarkan pada perbedaan adsorbsi antara fase diam terhadap fase gerak dan zat terlarut yang terjadi secara kompetitif. Bercak dengan nilai Rf
sama kemungkinan adalah senyawa yang sama. Campuran yang akan dipisahkan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai dan lebih menguntungkan jika digunakan pelarut pengembang yang kepolarannya sama (Gritter dkk., 1991). Gasparic (1978) menyebutkan bahwa terbentuknya suatu bercak tunggal tidak dapat disimpulkan sebagai suatu senyawa murni sebelum digunakan sistem pelarut dengan kepolaran yang berbeda.
Pada sistem seperti KLT, dimana bagian lintasan dan koefisien partisi mungkin tidak konstan sepanjang jarak pengembangan, rasio jarak yang dilalui oleh zat terlarut dan fase gerak disebut sebagai retardation factor (Rf) dengan rumus sebagai berikut :
Rf=
Pemilihan pelarut untuk menghasilkan pemisahan yang baik memerlukan sejumlah percobaan. Sistem pelarut biasanya merupakan campuran yang tediri dari dua komponen yaitu air dan pelarut organik polar yang larut dalam air. Pemilihan sistem pelarut ini dapat dilakukan secara eksperimental maupun dengan menghitung nilai kekuatan pelarut (S’) dengan rumus :
S’ = FaSa + FbSb + …
dengan F adalah volume fraksi dari pelarut murni (a, b, dan seterusnya) dan S adalah parameter kekuatan pelarut. Dengan semakin besar nilai S menunjukkan bahwa semakin kuat solut untuk teradsorpsi pada silika gel KLT tetapi akan semakin lemah terikat pada sistem KLT fase terbalik (Dean, 1995).
Tabel I. Parameter Empiris Kekuatan Pelarut (S)
Solven S Heksan 1-Propanol Tetrahidrofuran Etil asetat Etanol Kloroform Asam asetat Metanol Air 0,0 3,9 4,2 4,3 5,2 4,4 6,2 6,6 9,0 (Dean, 1995) Silika gel lebih sering digunakan untuk bahan pelapis. Lapisan silika gel merupakan kumpulan sangat tebal dari partikel kecil dengan ukuran seragam (6-13 µm) dengan permukaan halus dan rata (Dean, 1995). Silika gel
bersifat sedikit asam sehingga sampel dengan sifat asam sering agak mudah dipisahkan sehingga dapat meminimumkan reaksi asam-basa antara penjerap dan senyawa yang dipisahkan (Gritter dkk., 1991). Pengikat yang sering digunakan untuk serbuk silika gel adalah 5-20 % kalsium sulfat hemihidrat, bentuk halus dari gipsum (silika gel G) yang dipergunakan untuk meningkatkan kohesi dari partikel adsorben dan meningkatkan adhesi dari lapisan adsorben dengan lempeng (Dean, 1995).
2. Kromatografi gas
Kromatografi gas adalah suatu metode pemisahan dengan proses migrasi diferensial dimana komponen-komponen cuplikan ditahan secara selektif oleh fasa diam berupa padatan maupun cairan serta fase gerak berupa gas. Kromatografi gas ini dapat digunakan untuk analisa kualitatif (penentuan sifat-sifat dari suatu komponen atau campuran dari komponen) serta analisa kuantitatif (penentuan jumlah dari suatu komponen atau komponen-komponen dalam suatu campuran) (Sastrohamidjojo, 1991).
Data kromatografi gas biasanya terdiri dari waktu retensi atau waktu tambat berbagai komponen campuran. Waktu retensi diukur mulai dari titik penyuntikan sampai titik maksimum puncak dan sangat khas untuk senyawa tertentu pada kondisi tertentu (kolom, suhu, gas pembawa, dan laju aliran). Adanya komponen tertentu dapat dipisahkan dengan cara spiking jika tersedia senyawa murninya. Senyawa murni ditambahkan ke dalam cuplikan yang diduga mengandung senyawa yang diinginkan dan dikromatografi. Jika puncak yang sesuai diperkuat secara simetris pada dua sistem fase diam yang
berlainan dan kepolarannya berbeda, komponen itu mungkin ada (Gritter dkk., 1991).
Metode kromatografi gas dan spektrometri massa memberikan keuntungan saat keduanya digunakan secara bersamaan. Proses pemisahan dilakukan oleh kromatografi gas, sedangkan proses identifikasi dan kuantitatif dilakukan oleh spektrometri massa. Keuntungan dari kromatografi gas-spektrometri massa antara lain metode ini dapat digunakan untuk hampir semua jenis analit, memiliki batas deteksi yang rendah, dan memberi informasi penting tentang spektrum massa dari suatu senyawa organik (Dean, 1995).
3. Elusidasi Struktur dengan Spektrometri Massa (Mass Spectrometry) Penentuan struktur molekul organik dapat dilakukan dengan metode spektroskopi. Dalam hal ini dapat digunakan spektroskopi ultraviolet, spektrofotometri inframerah, spektroskopi resonansi magnetik inti, dan spektrometri massa (Samhoedi, 1980).
Pada spektrometri massa sering kali dipergunakan metode Electron Impact (EI) yaitu spektrometer massa membombardir molekul dalam fase uap dengan sinar elektron berenergi tinggi dan mencatat hasil tumbukan elektron sebagai spektrum ion positif dan dinyatakan dalam massa/muatan (m/z) (Silverstein and Webster, 1998). Ion bermuatan positif yang berenergi tinggi ini disebut ion molekuler yang kemudian dapat dipecah menjadi ion berukuran lebih kecil (Sastrohamijojo, 1991).
Proses ini menginisiasi ion radikal yang disebut ion molekuler atau induk. Untuk spesies molekuler M, pembentukan ion sering ditulis dalam persamaan :
M + e ÆM . + 2 e
Tanda titik disini menunjukkan bahwa ion berada dalam bentuk radikal karena kehilangan sebuah elektron. Puncak ion molekuler memiliki nilai m/z yang berhubungan dengan bobot molekul dari molekul netral aslinya (Skoog, 1985).
Spektrum massa merupakan grafik perbandingan massa/muatan (m/z) terhadap kelimpahan relatifnya. Muatan ion dari kebanyakan partikel yang terdeteksi dalam spektra massa adalah +1. Nilai m/z ion semacam ini sama dengan massanya. Dari segi praktis spektrum massa adalah rekaman dari massa partikel kelimpahan relatif partikel tersebut (Fessenden dan Fessenden, 1986b).
4. Perhitungan Jumlah Senyawa Hasil Sintesis dengan Program ImageJ
ImageJ yang menggunakan bahasa pemrograman Java ini diciptakan oleh Wayne Rasband di National Institutes of Health (NIH). ImageJ dapat digunakan untuk berbagai format gambar standar yang akan diolah, termasuk implementasi gabungan gambar dengan warna 48-bit yang sekarang ini sedang berkembang. Kemampuan untuk membuka berbagai jenis format gambar telah menjadi keistimewaan yang dimiliki oleh ImageJ (Collins, 2007).
Aplikasi ImageJ dapat dipergunakan untuk mengukur suatu wilayah dari obyek yang bersifat kompleks. Misalnya adalah menentukan wilayah
terjadinya fotosintesis di daun, sehingga dipilih wilayah yang berwarna hijau dari keseluruhan bagian daun yang berwarna-warni. Dilakukan pengaturan gambar yang akan dianalisis dengan mengubahnya menjadi warna hitam putih serta gambar binary sehingga dapat dilakukan analisis partikel untuk menghitung luas area hijau. Dapat pula dilakukan pengaturan
brightness/contrast yang kemudian dapat dilakukan analisis partikel untuk menghitung luas area hijau (Reinking, 2001).