D. Spektrometer NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
4.4. Analisis Senyawa Menggunakan Spektrum NMR
Spektroskopi NMR berdasarkan pada penyerapan gelombang radio oleh inti-inti tertentu dalam molekul apabila berada dalam medan magnet (Fessenden, 1990). Sinyal NMR yang terukur berupa nilai pergeseran kimia (δ) dalam satuan ppm. Nilai δ merupakan perbedaan resonansi frekuensi suatu inti relatif terhadap standar (Janie, et al., 2006, Akitt, 1983).
Spektrum pengukuran 1H-NMR dan 13C-NMR menggunakan tetrametilsilan (TMS) sebagai standar. TMS mempunyai 12 atom H dan 4 atom C yang ekivalen sehingga memberikan nilai pergeseran kimia dalam bentuk singlet yang muncul pada daerah medan magnet yang tinggi (δ = 0 ppm).
Konfirmasi struktur molekul terhadap keempat senyawa [S1], [S2], [S3], dan [S4] mengunakan analisis spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR dapat mengatasi problema penentuan struktur suatu senyawa hanya melalui informasi gugus fungsi saja. Informasi pengukuran dari spektrum 1H-NMR dapat memberikan indikasi dan deskripsi mengenai bagian hidrokarbon molekul dari nilai pergeseran kimia yang menunjukkan proton untuk masing-masing lingkungan kimia, konstanta kopling (J), dan jumlah proton dari hasil integrasinya. Melalui pengukuran dari spektrum 13C-NMR dapat diketahui jenis karbon primer, sekunder, tersier dan kuartener (-CH3, -CH2-, CH-, -C-, O-C, C=O, -CONH-, dan lain-lain) [Akitt, 1983].
4.4.1 Senyawa 3-hidroksi-N-oktilpikolinamida [S1]
Analisis penetapan struktur molekul senyawa [S1] menggunakan spektrometer 1H-NMR (Lampiran 6) dan 13C-NMR (Lampiran 7) dapat ditunjukkan dalam Tabel 8 dan menggunakan panduan Gambar 17 sebagai berikut:
Gambar 17. Struktur senyawa 3-hidroksi-N-oktilpikolinamida [S1]
Tabel 8. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR senyawa 3-hidroksi-N-oktilpikolinamida [S1] (CDCl3, 500 MHz)
C/H Pergeseran Kimia (δ, ppm)
1H-NMR (m*,J dalam Hz) 13C-NMR m*= multiplisitas, J = konstanta kopling
Pergeseran kimia proton dari gugus -OH pikolinat pada δ = 12,27 ppm (1H,s) sinyal berbentuk singlet, karena -OH terikat pada atom C3’ aromatik yang tidak mempunyai proton. Nilai pergeseran kimia ini muncul lebih down field (medan rendah) menjauhi nilai pergeseran kimia TMS karena atom H
dari gugus -OH membentuk ikatan hidrogen intramolekuler dengan gugus karbonil dari amida (-C=O). sinyal pada δ = 7,30 ppm (1H, m); δ= 7,33 ppm (1H,m), dan δ= 8,03 ppm (1H,m) masing-masing merupakan proton aromatik pada C4, C5, dan C6 dari cincin pikolinat. Sinyal berbentuk multiplet (m) muncul karena interaksi sebuah proton dengan proton-proton tetangganya yang tidak ekivalen dengan proton tersebut akan memberikan isyarat NMR dengan sinyal-sinyal yang terbelah (splitting) menjadi sinyal-sinyal rangkap.
Pergeseran kimia pada δ= 0,87 ppm (3H,t) merupakan pergeseran proton pada gugus metil, C8’. Sinyal berbentuk triplet karena atom H dalam gugus metil terikat pada atom karbon metilen tetangganya yang mempunyai dua proton. Gugus proton dari metilen C3’-C7’ ditunjukkan ada pada δ = 1,31 ppm (10H,m) dengan muncul sinyal berbentuk multiplet. Integrasi atom H gugus metilen sebanyak 10 menunjukkan adanya 5 gugus metilen (-CH2-).
Nilai pergeseran proton dari C1’, δ= 3,43 ppm, mempunyai nilai pergeseran kimia lebih ke arah down field dari pada proton dari C2’ dengan δ= 1,62 ppm, karena adanya efek induksi dan berdekatan dengan gugus amida yang lebih elektronegatif. Demikian juga halnya, pergeseran kimia proton dari C2’ lebih down field dari pada proton dari C3’-C7’. Sinyal NMR dari proton C1’
berbentuk kuartet karena adanya interaksi dengan satu proton dari -NH
amida dan 2 proton metilen dari C2’. Proton dari gugus amida ditunjukkan oleh δ = 8,04 ppm (1H,d), berupa puncak doublet yang berasal dari interaksi proton amida dengan 1 proton yang diikat oleh C1’. Pergeseran kimia untuk proton yang terdapat pada pelarut CDCl3 muncul pada δ = 7,26 ppm.
Data spektrum hasil pengukuran menggunakan 13C-NMR
menghasilkan pergeseran kimia antara lain δ = 14,6 ppm yang merupakan pergeseran kimia dari gugus metil C8’. Pergeseran pada δ = 22,71-29,5 ppm menunjukan gugus metilen (-CH2-) dari C3’-C7’. Pergeseran kimia makin ke arah down field bila makin dekat dengan atom nitrogen amida yang lebih elektronegatif. Karbon gugus karbonil pada amida memberikan
pergeseran kimia C1’ dengan δ= 168,78 ppm lebih down field, karena pengaruh atom oksigen lebih elektronegatif . Sinyal 1H NMR pada δ = 126,16; 128,56; 139,44; dan 157,85 ppm menunjukkan pergeseran kimia atom karbon aromatik pada cincin pikolinat, yaitu masing-masing C4, C5, C2, dan C3. Gugus dari C2 dan C6, saling simetris dan mempunyai nilai
pergeseran kimia sama yaitu δ= 139,44 ppm. Gugus C3 memiliki nilai pergeseran kimia paling down field di antara karbon-karbon lain pada cincin pikolinat karena C3’ mengikat gugus oksigen yang bersifat elektronegatif.
Hasil spektrum 13C-NMR juga memberikan nilai δ = 77,19 ppm yang merupakan pergeseran kimia atom karbon dari pelarut CDCl3.
4.4.2 Senyawa 2-hidroksi-N-fenilbenzamida [S2]
Penetapan struktur molekul senyawa [S2] berdasarkan analisis 1 H-NMR (Lampiran 8) dan 13C-NMR (Lampiran 9) dapat ditunjukkan dalam Tabel 9 dan menggunakan panduan Gambar 18 sebagai berikut:
1
Gambar 18. Struktur senyawa 2-hidroksi-N-fenilbenzamida [S2]
Tabel 9. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR senyawa 2-hidroksi-N-fenilbenzamida [S2] (CDCl3, 500 MHz)
C/H Pergeseran Kimia (δ, ppm)
1H-NMR (m*, J dalam Hz) 13C-NMR m*=multiplisitas, J = konstanta kopling
Pergeseran kimia proton dari gugus -OH salisilat pada δ = 10,22 ppm (1H, s) sinyal berbentuk singlet/tunggal karena -OH terikat pada atom C3 yang tidak mempunyai proton. Nilai pergeseran kimia ini muncul lebih down field karena gugus -OH membentuk ikatan hidrogen intramolekuler dengan
gugus karbonil dari amida. Proton dari gugus amida ditunjukkan oleh sinyal berbentuk singlet pada δ = 7,99 ppm (1H, s), karena -NH terikat pada tetangganya yang masing-masing tidak mempunyai proton dari atom C1’
aromatik dan C1 karbonil (C1-CON-). Pergeseran kimia proton aromatik muncul antara δ= 7-8,5 ppm. Pergeseran kimia δ= 6,98 ppm (1H, m)
merupakan pergeseran proton C6 gugus metin (–CH-) benzen. Pergeseran kimia pada δ= 7,03 ppm (1H, m) merupakan pergeseran proton pada C4 dan δ= 7,55 ppm (1H, m) merupakan pergeseran proton pada C5. Sinyal multiplet muncul karena suatu proton pada posisi C6/C5/C4 memiliki satu proton dengan tetangga-tetangganya yang tidak ekivalen dan memberikan suatu isyarat NMR dengan sinyal-sinyal yang terbelah menjadi puncak rangkap selain itu proton tersebut juga memiliki ekivalensi dengan proton dari
tetangga-tetangganya yang lain. Kerapatan elektron yang rendah pada posisi meta meyebabkan C5 lebih down field. Pergeseran kimia pada δ= 7,45 ppm (2H, m) merupakan pergeseran proton metin (-CH-) benzen pada posisi C2’
dan C6’ yang mempunyai nilai sama. Proton dari gugus C3’ dan C5’
mempunyai pergeseran kimia pada δ= 7,60 ppm (2H, m). Proton dari gugus C3’ dan C5’ lebih down field dari pada proton dari gugus C2’ dan C6’, karena terletak pada posisi meta dari gugus amida dan kerapatan elektron pada
posisi tersebut relatif lebih rendah. Proton dari gugus C4’ mempunyai pergeseran kimia δ= 7,09 ppm (1H, m), karena lebih up field dibandingkan proton dari gugus C3’dan C5’. Pergeseran kimia untuk proton yang terdapat pada pelarut CDCl3 muncul pada δ = 7,26 ppm.
Data spektrum hasil pengukuran menggunakan 13C-NMR
menghasilkan pergeseran kimia antara lain δ = 14,6 ppm yang merupakan pergeseran kimia karbon dari gugus C1’. Pergeseran pada δ = 123,52-127,29 ppm menunjukkan karbon dari C3’ dan C5’. Pergeseran kimia cenderung down field bila makin dekat dengan atom nitrogen yang lebih elektronegatif
atau terletak pada posisi meta. C4’ terletak pada posisi para sehingga relatif mempunyai nilai pergeseran kimia yang sama pada posisi orto, C2’ dan C6’.
Karbon gugus karbonil pada amida memberikan pergeseran kimia C1-CON- pada δ = 168,62 ppm muncul ke arah lebih down field, karena pengaruh atom oksigen lebih elektronegatif . Sinyal NMR pada δ = 118,34; 162,50;
111,33; 128,56 ppm menunjukkan pergeseran kimia atom karbon aromatik pada cincin fenol/salisilat, yaitu masing-masing C2, C3, C4, dan C5. Karbon dari gugus C3 memiliki nilai pergeseran kimia lebih down field di antara karbon-karbon lain dalam cincin fenol, karena C3 mengikat inti atom oksigen elektronegatif. Hasil spektrum 13C-NMR juga memberikan nilai δ = 77,19 ppm yang merupakan pergeseran kimia atom karbon dari pelarut CDCl3.
4.4.3. Sintesis 3-hidroksi-N-fenilpikolinamida [S3]
Hasil analisis senyawa 3-hidroksi-N-fenilpikolinamida [S3]
berdasarkan spektrum 1H-NMR (Lampiran 10) dan 13C-NMR (Lampiran 11) dapat ditunjukkan dalam Tabel 10 dan menggunakan panduan Gambar 19 sebagai berikut:
Gambar 19. Struktur senyawa 3-hidroksi-N-fenilpikolinamida [S3]
Tabel 10. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR untuk senyawa 3-hidroksi-N-fenilpikolinamida [S3] (CDCl3, 500 MHz)
C/H Pergeseran Kimia (δ, ppm)
1H-NMR (m*, J dalam Hz) 13C-NMR m*= multiplisitas, J = konstanta kopling
Pergeseran kimia proton dari gugus -OH pikolinat pada δ = 11,94 ppm (1H, s) sinyal berbentuk singlet/tunggal, karena -OH terikat pada atom C3 yang tidak mempunyai proton. Nilai pergeseran kimia ini muncul lebih down field, karena gugus -OH membentuk ikatan hidrogen intramolekuler dengan
gugus karbonil dari amida. Proton dari gugus amida ditunjukkan oleh δ = 9,92 (1H, s) berupa sinyal berbentuk singlet, karena NH terikat pada atom yang tidak mempunyai proton dari C1’ aromatik dan C1 karbonil (C1-CON-).
Pergeseran kimia pada δ= 8,13 ppm (1H, m) merupakan pergeseran proton C6 dari metin (-CH-) benzen. Pergeseran kimia pada δ= 7,72 ppm (1H, m) merupakan pergeseran proton C4 dan δ= 7,70 ppm (1H, m) merupakan pergeseran proton C5. sinyal multiplet muncul karena memiliki satu proton tetangga yang tidak ekivalen pada posisi orto dan meta dan memberikan suatu isyarat yang terbelah menjadi sinyal-sinyal rangkap. Posisi sinyal ke arah lebih down field sesuai tingkat kerapatan elektron yang ada,dengan urutan kerapatan elektron makin rendah maka makin down field. Urutan proton dari C5 lebih down field dari proton C6, sementara proton pada gugus C6 dan C4 hampir memiliki kesamaan dalam kerapatan elektron. Pergeseran kimia pada δ= 7,42 ppm (2H, m) merupakan pergeseran proton pada posisi C2’ dan C6’ yang mempunyai nilai sama. C3’ dan C5’ mempunyai
pergeseran kimia pada δ= 7,36 (2H, m). Proton dari gugus C2’ dan C6’ lebih down field dari pada proton dari C3’ dan C5’, karena kerapatan elektronnya relatif lebih rendah dan pososinya berdekatan dengan gugus elektronegatif dari inti atom nitrogen dari amida. Proton dari gugus C4’ mempunyai
pergeseran kimia δ= 7,19 (1H, m), karena lebih up field (medan magnet tinggi) dibandingkan proton dari gugus C3’ dan C5’. Pergeseran kimia untuk proton yang terdapat pada pelarut CDCl3 muncul pada δ = 7,26 ppm.
Data spektrum hasil pengukuran menggunakan 13C-NMR
menghasilkan pergeseran kimia antara lain δ = 131,53 ppm yang merupakan pergeseran kimia karbon dari gugus C1’. Pergeseran pada δ = 129,4 ppm menunjukan karbon dari metin (-CH-) pada C3’ dan C5’. Pergeseran kimia makin bernilai down field bila makin dekat dengan inti atom nitrogen amida yang lebih elektronegatif atau terletak pada posisi meta. Karbon dari C4’
terletak pada posisi para sehingga relatif lebih down field dari pada posisi orto, C2’ dan C6’. Karbon gugus karbonil pada amida memberikan
pergeseran kimia C1’ pada δ= 167,06 ppm muncul ke arah lebih down field, karena pengaruh inti atom oksigen lebih elektronegatif . Sinyal NMR pada δ = 158,48; 139,13; 128,56; dan 126,16 ppm menunjukkan pergeseran kimia atom karbon aromatik pada cincin pikolinat, yaitu masing-masing C3, C2, C5, dan C4. Karbon dari Gugus C3 memiliki nilai pergeseran kimia paling down field di antara karbon-karbon lain pada cincin pikolinat, karena adanya efek
elektronegatif atom oksigen yang berdekatan dengan karbon pada C3. Hasil spektrum 13C-NMR juga memberikan nilai δ = 77,19 ppm yang merupakan pergeseran kimia atom karbon dari pelarut CDCl3.
4.4.4. Sintesis 2-hidroksi-N-oktilbenzamida [S4]
Hasil analisis senyawa 2- hidroksi-N-oktilbenzamida [S4] berdasarkan spektrum 1H-NMR (Lampiran 12) dan 13C-NMR (Lampiran 13) dapat
ditunjukkan dalam Tabel 11 dan menggunakan panduan Gambar 20 sebagai berikut:
Gambar 20. Struktur senyawa 2- hidroksi-N-oktilbenzamida [S4]
Tabel 11. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR senyawa 2- hidroksi-N-oktilbenzamida [S4] (CDCl3, 500 MHz)
C/H Pergeseran Kimia (δ, ppm)
1H-NMR(m*,J dalam Hz) 13C-NMR 1-CON- m*=multiplisitas, J = konstanta kopling
Data spektrum hasil pengukuran spektrometer 1H-NMR untuk senyawa [S4] dapat dijelaskan bahwa nilai pergeseran kimia pada δ= 0,87 ppm (3H, t) merupakan pergeseran proton dari gugus metil, C8’. Sinyal berbentuk triplet karena proton dari gugus metil terikat pada dua proton atom karbon metilen tetangganya. Proton dari gugus metilen C3’-C7’ ditunjukkan ada pada δ = 1,27 ppm (10H, m) dengan sinyal muncul berbentuk multiplet.
Integrasi atom H gugus metilen sebanyak 10 menunjukkan adanya 5 gugus metilen. Nilai pergeseran dari proton C1’ pada δ= 3,42 ppm mempunyai nilai pergeseran kimia lebih down field dari pada C2’ pada δ= 1,60 ppm, karena berdekatan dengan gugus amida yang lebih elektronegatif. Demikian juga halnya, pergeseran kimia dari proton C2’ lebih down field dari pada proton dari C3’-C7’. Sinyal proton dari C1’ berbentuk kuartet, karena interaksi antara satu proton dari -NH amida dan 2 proton metilen dari C2’. Proton dari gugus amida muncul pada pergeseran kimia, δ = 6,48 ppm (1H, s) sinyal berupa singlet, karena -NH terikat pada atom C1-CON- yang tidak mempunyai proton. Sinyal pada δ = 6,81 ppm (1H, m ); 7,36 ppm (1H, m); 6,96 ppm (1H, m); dan 7,37 ppm (1H, m) masing-masing menunjukan adanya 1 proton aromatik pada C4, C5, C6, dan C7. Multiplisitas terjadi karena terjadinya splitting (pemecahan) yang disebabkan oleh atom H tetangga yang tidak
ekivalen dan memiliki konstanta kopling yang kompleks dalam signal NMR.
Pergeseran kimia lebih down field pada posisi meta dalam cincin fenol, karena efek elektronegatif dari atom oksigen dapat mengurangi kerapatan elektron pada posisi meta tersebut. Pergeseran kimia proton dari gugus -OH
dari fenol muncul pada δ = 12,43 ppm (1H, s) sinyal berbentuk singlet, karena -OH terikat pada atom C3 aromatik yang tidak mempunyai proton.
Nilai pergeseran kimia ini muncul lebih down field karena gugus OH membentuk ikatan hidrogen intramolekuler dengan gugus karbonil pada amida. Pergeseran kimia untuk proton yang terdapat pada pelarut CDCl3
muncul pada δ = 7,26 ppm.
Data spektrum hasil pengukuran menggunakan 13C-NMR
menghasilkan pergeseran kimia antara lain δ = 14,21 ppm yang merupakan pergeseran kimia karbon dari gugus metil C8’. Pergeseran kimia pada δ = 22,75-29,60 ppm menunjukan nilai dari karbon C3’-C7’. Pergeseran pada δ = 31,9 dan 39,9 ppm untuk karbon dari C2’ dan C1’. Nilai Pergeseran kimia ke arah lebih down field bila makin dekat dengan atom nitrogen amida yang lebih elektronegatif, sehingga urutan down field makin tinggi sesuai deret berikut C1’>C2’>C3’>C8’. Karbon gugus karbonil pada amida memberikan pergeseran kimia C1-CON pada δ= 170,10 ppm lebih down field, karena pengaruh atom oksigen lebih elektronegatif. Sinyal 13C NMR pada δ = 114,56; 161,0; 118,67; 134,20; 118,75; dan 125,47 ppm menunjukkan pergeseran kimia atom karbon aromatik pada cincin fenol, yaitu masing-masing C2, C3, C4, C5, C6 dan C7. Karbon dari gugus C3 memiliki nilai pergeseran kimia paling down field di antara karbon-karbon lain pada cincin fenol, karena C3 mengikat atom oksigen yang elektronegatif. Hasil spektrum
13C-NMR juga memberikan nilai δ = 77,20 ppm yang merupakan pergeseran kimia atom karbon dari pelarut CDCl3.
4.5. Sitotoksisitas Senyawa Analog terhada Sel Kanker Murine