D. Spektrometer NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
4.5. Sitotoksisitas Senyawa Analog terhada Sel Kanker Murine Leukemia P-388
Aktivitas biologi senyawa analog UK-3A, [S1]-[S4], diuji secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P-388. Uji aktivitas sitotoksik ini
dilakukan dengan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazo-2-il-)2,5-difeniltetrazolium bromide (Alley et.al.1988 diacu dalam Sahidin et.al.,2005) dengan
konsentrasi penambahan senyawa uji dalam ragam konsentrasi 0,1; 0,3; 1;
3; 10; 30; dan 100 µg/mL. Sebagai kontrol positif digunakan senyawa antikanker cis-platin dengan ragam konsentrasi yang sama.
Pengujian MTT adalah suatu standar pengujian laboratorium secara kolorimetri (metode pengukuran berdasarkan perubahan warna yang terjadi) karena mengukur pertumbuhan/perkembangbiakan sel. Metode ini
digunakan untuk menentukan sitotoksisitas zat-zat yang berpotensi sebagai obat. Sel hidup mempunyai kemampuan untuk mengubah warna MTT menjadi berwarna ungu, sebaliknya bagi sel mati MTT tetap berwarna kuning. Sel hidup berbentuk bulat sementara sel mati mempunyai bentuk tidak teratur (Wikipedia, 2008). Dalam sel hidup, enzim reduktase
mitokondria adalah aktif sehingga pewarna kuning MTT dapat direduksi oleh enzim tersebut menjadi formazan ungu yang mempunyai panjang
gelombang, λ = 550 nm. Nilai absorbansi (A) merupakan rata-rata untuk tiga kali ulangan dan selanjutnya diplot suatu grafik sebagai hubungan
persentase penghambatan/inhibisi terhadap konsentrasi senyawa uji.
Kemampuan sitotoksik senyawa uji ditentukan sebagai nilai IC50 yaitu nilai
kemampuan mematikan sel kanker sebanyak 50%. Kemampuan mematikan (IC) diperoleh dari formulasi berikut.
Berdasarkan formulasi tersebut nilai IC adalah selisih absorban oleh sel kotrol (A0) dengan Absorban oleh sel dengan perlakuan senyawa uji (As) dan dibandingkan dengan A0-nya dikalikan 100%. Hasil uji sitotoksisitas masing-masing senyawa analog dapat dilihat pada Tabel 12 dan Lampiran 14.
Tabel 12. Hasil uji sitotoksisitas senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker Murine leukemia P-388
No. Senyawa IC50 (µg/mL)
cis-platin (control positif) UK-3A
Berdasarkan tabel di atas, ke-empat senyawa analog UK-3A ;[S1], [S2], [S3], dan [S4], mempunyai aktivitas antikanker Murine leukemia P-388 lebih tinggi, jika dibandingkan dengan senyawa UK-3A induk. Keuntungan sintesis senyawa analog tersebut adalah disintesis secara sederhana melalui satu tahap reaksi amida berdasarkan modifikasi struktur molekul senyawa induk serta diperolehnya hasil uji IC50 senyawa-senyawa analog tersebut lebih tinggi aktivitas biologinya dari pada senyawa induk.
A0 - As
IC = x 100%
As
Aktivitas tertinggi ditunjukkan pada senyawa yang memiliki struktur molekul salisilat/fenol jika dibandingkan dengan struktur pikolinatnya.
Aktivitas antikanker senyawa-senyawa analog, [S1]-[S4], ditunjukkan oleh nilai IC50 yang lebih rendah dari IC50 untuk UK-3A. Gugus fungsi seperti fenol yang ada pada senyawa-senyawa analog [S2] dan [S4] tersebut diperkirakan mempunyai peranan penting dalam aktivitas. Gugus OH pada senyawa diduga mempunyai interaksi pengikatan senyawa pada sisi pengikatan (binding site) sel target melalui ikatan hidrogen yang terlibat antara dua molekul yang bekerja sebagai donor dan akseptor. Donor ikatan hidrogen adalah proton dari fenol yang menempel pada atom oksigen yang bersifat elektronegatif dan sebagai akseptornya adalah gugus-gugus OH yang ada pada sel target (Patrick, 2001).
Bila struktur salisilat, [S2] dan [S4], berubah menjadi pikolinat memberikan senyawa [S1] dan [S3], maka aktivitas antikanker senyawa-senyawa analog berstruktur pikolinat yang ditunjukkan dalam Tabel 12 memberikan aktivitas biologi senyawa pikolinat lebih rendah dari aktivitas biologi senyawa yang memiliki struktur salisilat. Perubahan struktur molekul tersebut memberikan pengaruh pada afinitasnya yaitu terjadi penurunan terhadap aktivitas biologi senyawa terhadap sel kanker Murine leukemia P-388.
Pengaruh gugus hidrokarbon netral dari senyawa [S4] yang memiliki gugus alkil dibandingkan dengan senyawa [S2] yang memiliki gugus aril pada penelitian ini diperoleh hasil signifikan. Gugus alkil mempunyai
kemampuan untuk cocok/tepat ke dalam kantong hidropobik (hydrophobic
pocket) dengan interaksi van der Waals sementara cincin aromatik dapat
berinteraksi dengan daerah planar hidropobik melalui interaksi yang sama yaitu van der Waals. Kedudukan tempat pengikatan yang berbeda tersebut diduga mempunyai perbedaan afinitas terhadap sel kanker. Interaksi dari kedua gugus baik dari alkil maupun cincin aril penting untuk pengikatan suatu molekul yang berfungsi sebagai obat dengan binding site (Patrick, 2001).
Hasil penelitian aktivitas biologis beberapa senyawa analog UK-3A dari modifikasi dilakton cincin terbuka (Tabel 2) menunjukkan bahwa aktivitas sitotoksik makin tinggi bila sifat lipofilik senyawa makin besar. Sifat lipofilik suatu senyawa berkaitan dengan kemampuan senyawa tersebut untuk menembus membran sel yang bekerja seperti hidrofobik barier (Patrick, 2001). Kecenderungan sifat lipofilik dari senyawa analog [S1] dibandingkan [S3] menunjukkan hasil uji aktivitas antikanker lebih tinggi untuk senyawa [S1], demikian juga halnya untuk sifat lipofilik senyawa [S4] mempunyai aktivitas antikanker lebih tinggi dari pada senyawa [S2].
Studi sifat fisikokimia dari sejumlah senyawa-senyawa analog UK-3A, [S1]-[S4], dipelajari menggunakan persamaan matematis secara in-silico dari software hyperchem 7.0. Salah satu sifat fisikokimia tersebut di antaranya untuk menentukan karakter hidrofobik/lipofilik suatu senyawa.
Lipofilisitas molekul diukur dari nilai log P dengan P dinyatakan sebagai koefisien partisi kelarutan dalam lemak/air yang mempunyai rentang nilai -0,4 sampai 5 (optimal pada nilai log P = 3). Tabel 13 diperlihatkan nilai log P dari senyawa analog UK-3A, [S1]-[S4], hasil penelitian ini dan dibandingkan
dengan nilai log P dari obat komersial taxol, UK-3A, dan Antimisin A3. Aturan lima Lipinski digunakan untuk mengevaluasi suatu senyawa kimia yang dapat berfungsi sebagai obat (Lipinski, 1997, Patrick, 2001, Wikipedia, 2008).
Tabel 13. Analisis nilai log P dari senyawa analog UK-3A baru, UK-3A, taxol, dan antimisin A3
Nilai optimum log P dari aturan tersebut adalah 3, sehingga
berdasarkan hasil tersebut, nilai log P dapat memprediksi bahwa senyawa analog [S4] mempunyai karakter lipofilik yang optimal dan sesuai dengan hasil penelitian uji aktivitas biologi senyawa analog [S4] secara in- vitro menunjukkan nilai IC50 = 7,5 µg/mL.
Studi in-silico bagi senyawa-senyawa analog di atas merupakan salah satu kajian penting untuk analisis pendahuluan sebelum eksperimen in-vitro.
Namun variasi beberapa senyawa dalam sintesis senyawa analog yang telah dilakukan pada penelitian ini dimungkinkan untuk kajian lain seperti
pembuktian bahwa senyawa [S4] yang mempunyai struktur kimia asam salisilat yang memiliki gugus alkil yang lipofilik merupakan senyawa yang
dapat mempengaruhi respon biologis dibandingkan dengan senyawa lain dari [S1], [S2], dan [S3]. Hasil uji aktivitas biologi secara in-vitro dari keempat senyawa analog dinyatakan bahwa keempat senyawa mempunyai potensi sebagai senyawa antikanker Murine Leukemia P-388. Klarifikasi perbedaan potensi dari kedua hasil uji aktivitas biologi untuk ketiga senyawa lain selain [S4] baik secara in-vitro maupun in-silico bahwa pada penelitian ini tidak diperoleh korelasi positif kemungkinan besar disebabkan adanya modifikasi kimia dan enzimatis sehingga dapat memberikan aktivitas berbeda dari respon biologi senyawa terhadap sel target.
5. 1 Kesimpulan
1. Hasil sintesis senyawa-senyawa analog UK-3A diperoleh sebagai berikut :
a. 3-Hidroksi-N-oktilpikolinamida [S1] berbentuk minyak berwarna kuning jernih dengan rendemen hasil 76%
b. 2-Hidroksi-N-fenilbenzamida [S2] berbentuk kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 165-1670C dan rendemen hasil 80%
c. 3-Hidroksi-N-enilpikolinamida [S3] berbentuk kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 83-850C dan rendemen hasil 96%
d. 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida [S4] berbentuk kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 43-450C dan rendemen hasil 93%
2. Aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 memberikan hasil uji IC50 untuk masing-masing senyawa analog berturut-turut adalah [S1]= 13,2; [S2]= 7,75; [S3]= 18,5; [S4] =7,5
3. Senyawa analog UK-3A dari hasil penelitian mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker Murine Leukemia P-388 lebih tinggi dibandingkan senyawa UK-3A induk. Senyawa tersebut disintesis melalui rute reaksi lebih sederhana.
4. Senyawa analog yang mempunyai struktur cincin fenol (salisilat) memiliki daya hambat pertumbuhan sel kanker Murine leukemia P-388 lebih tinggi jika dibandingkan senyawa analog yang memiliki struktur cincin piridin (pikolinat).
5. Lipofilisitas senyawa [S4] dengan nilai log P = 2,13 menunjukkan peningkatan aktivitas sitotoksik sel kanker Murine leukemia P-388 dibandingkan sampel lainnya ([S1], [S2], [S3]).
5. 2 Saran
v Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk menentukan aktivitas biologi senyawa [S4] terhadap beberapa sel kanker lain seperti B16, KB, COLO-201, 3T3 sebagai reseptor.
Akitt, J.W., 1983. “An Introduction to the Fourier Transform-Multinuclear Era”, 2nd ed., Chapman & Hall Ltd., New York, USA.
Ardinata, E., 2007. “Sintesis Senyawa Analog UK-3A : 3-Hidroksipikolinil-dioktil Glutamat dan 2-Hidroksinikotinil3-Hidroksipikolinil-dioktil Glutamat dan Uji Sitotoksisitas terhadap Sel Kanker Murine Leukemia P-388”, Tesis, Magister Sains Ilmu Kimia, Program Pascasarjana U.I, Depok.
Budi, G.S., 2006. “Identifikasi Senyawa Bioaktif Ekstrak Kulit Batang Tanjang (Bruguiera gymnorhiza) dalam Etanol dan Uji
Sitotoksisitasnya terhadap Sel HeLa”, Skripsi, Program Sarjana, MIPA UNSOED, Purwokerto.
Bailey, P.D., 1992. “An introduction to Peptide Chemistry”, John Wiley & son.
New York.
Bowolaksono, A., 2007. “Apoptosis: Bila sel Berqurban”,
http://www.beritaiptek.com/rss/ diakses tanggal 19 Mei 2008 pukul 17.10 WIB.
Carey, F.A., Sunberg, R.J., 1991. “Advanced Organic Chemistry”, 3rd ed., Part 3 : Reaction and Synthesis, Plenum Press, New York.
Fessenden, R. J., Fessenden, J. S., 1990. ”Kimia Organik”, Jilid 2, Edisi Ketiga, Penterjemah: Pudjaatmaka, A. H., Penerbit Erlangga, Jakarta.
Fessenden, R. J., Fessenden, J. S., 1991. ”Kimia Organik”, Jilid 1, Edisi Ketiga, Penterjemah : Pudjaatmaka, A. H., Penerbit Erlangga, Jakarta.
Firmansyah, F., 2003. “Optimasi Sintesis Senyawa 2-Hidroksi-N-Fenil Benzamida”. Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila,
Griffer, R.J., Bobbitt, J.M., Schwarting, A.E., 1991. “Pengantar Kromatografi”, Edisi kedua, ITB Press, Bandung.
Hanafi, M., 1995. “Studies of Novel Antibiotics Metabolites from Streptomyces sp. 517-02”, Thesis, Departement of Chemistry Faculty of Science, Osaka City University, Osaka.
Hanafi, M., Shibata, K., Ueki, M., Taniguchi, M. 1996., “UK-2A, B, C, and D: a Novel Antifungal Antibiotics from Streptomyces sp. 517-02 : II.
Structural Elucidation”, J. Antibiotics, 49 (12): 1226-1226.
Hanafi, M., Ueki, M., Kusumoto, A., Shibata, K., Tanaka, T., Taniguchi, M., 1997. “UK-3A, a Novel Antifungal from Streptomyces sp. 517-02 : Fermentation, Isolation, Structural Elucidation, and Biological Properties”, J. Antibiotics, 50 (7): 551-555.
Hanafi, M., Trisnamurti, R.H., Saefudin, E., Thelma, A.B., Ngadiman., 1997a.
“Sintesis dan uji aktivitas biologi senyawa analog UK-3,
3-hidroksipikolinil serin metil ester dan turunannya”, Prosiding Seminar Nasional Kimia II; Yogyakarta 13 Desember 1997, Jurusan Kimia Fakultas MIPA UGM. ISSN: 1410-8313, Yogyakarta.
Hanafi, M., Trisnamurti, R.H., Thelma, A.B., Herlina., 1997b. “Optimasi pembentukan senyawa analog antibiotik UK-3, 3-hidroksipikolinil serin metil ester”, Prosiding Seminar Nasional 24-27 November 1997, Himpunan Kimia Indonesia Bandung Cabang Jawa Barat, p. 69-74.
Hanafi, M., Thelma A.B., 1998. ”Sintesis Senyawa Analog Antibiotika UK-3, Pengaruh Gugus Hidroksi terhadap Aktivitas Biologi”, Prosiding Seminar Nasional II Kimia dalam Pembangunan Holiday Inn., Yogyakarta.
Hanafi, M., 1998. “Sintesis Senyawa Analog dengan Antibiotik UK-3”.
Laporan Riset Unggulan Terpadu V 1997/1998”, Kantor Menteri Negara Riset dan Teknologi Dewan Riset Nasional.
Hanafi, M., Anita,Y., Putra, A.M.J., 2008. ”SintesisPengaruh Lipofilisitas Pada Analog UK-3A terhadap Aktivitas Antikanker Leukemia P-388”, Seminar IPT, LIPI, Serpong.
Harbone, J.B., Dey, P.M., 1991. “Method in Plant Biochemistry”, 6, Assay for Bioactivity, Academic Press, London.
Hendayana, S., Karohman, A., Sumarna, A.A., Supriatna, A., Buchari, 1994.
“Kimia Analitik Instrumen”, IKIP, Semarang Press, Semarang.
http://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay diakses tanggal 19 Mei 2008 pukul 14.50 WIB.
http://en.wikipedia.org/wiki/cancer diakses tanggal 19 Mei 2008 pukul 11.15 WIB.
http://www.labtestsonline.org/understanding/condition/leukemia.html diakses tanggal 19 Mei 2008 pukul 15.38 WIB.
http/www.oncologychannel.com/leukemias/index.shtml diakses tanggal 19 Mei 2008 pukul 15.38 WIB.
http://en.wikipedia.org/wiki/Electron_transport_chain diakses tanggal 19 Maret 2008 pukul 11.00 WIB.
http://en.wikipedia.org/wiki/apoptosis diakses tanggal 19 Maret 2008 pukul 14.05 WIB.
Lesault, I., Quang, C.T., Frampton, J., Ghusdael, J., 2002. “Direct Regulation of Bcl-2 by FLI-1 is involved in the survival of FL-1 transformed erythroblasts”, Embo J., 21(4): 604-703.
Janie, U. A., et al., 2006. “Teknik Modern Spektroskopi NMR : Teori dan Aplikasi dalam Elusidasi Struktur Molekul Organik dan Biomolekul”, LIPI Press, Jakarta.
Kurnia, A., 2007. “Sintesis dan Uji Aktivitas Biologi Senyawa Analog
Antibiotika UK-3 : Diamilnikotinil Glutamat Ester dan Diheksil nikotinil Glutamat Ester”, Tesis, Magister Sains Ilmu Kimia, Program
Pascasarjana U.I, Depok.
Klassen, C.D., 2001. “Toxicology : The basic Science of Poisons”, 6th ed., McGraw-Hill corp., New York.
Liu, W., et al., 2003. “Medical Chemistry Anticancer Agent”, J. Medicinial, 3:
217-23.
Lipinski, C., et al., 1997. “Advance Drug”, Del.Rev., 23: 3
March, J., 1992. “Advenced Organic Chemistry, reaction, mechanism and structure”, 4th ed., A Wiley Interscience, New York.
Martin, G.S., 1999. “Normal cell and cancer cells: In Bioshop”, Weinberg, R.A., Ed., Molecular oncology, Scientific American, New York, p.13-40.
Murray, R.K., Dearyl, K. G., Mayes, P.A., Rodwell, V.W., 2003. “Biokimia”, Andry Hartono, Ed., Edisi ke-25, EGC, Jakarta.
Patrick, G., 2001. “Instant notes in medicinal chemistry”, BIOS Scientific Publisher.
Pine, S.H., Hendrickson, J.B., Crom, D.C., 1998. “Kimia Orgnik 2”, Peterjemah: Roehyati, J., Susanti, W.B., Penerbit ITB, Bandung.
Rahmawati, N., 2004. “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Bandotan (Ageratum conyzoides L) terhadap Sel HeLa dan Profil Kromatografi Lapis Tipisnya”, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Rosalina, L., 1999. “Sintesis dan Uji Aktivitas Biologi Senyawa Analog Antibiotika UK-3A : 3-Hidroksipikolinil Dialkil Glutamat Ester dan
2-hidroksinikotinil Dialkil Glutamat Ester”, Tesis, Magister Sains Ilmu Kimia, Program Pascasarjana UI, Depok.
Sahidin, et al., 2005. “Cytotoxic Properties of Oligostilbenoids from the tree barks of Hopea dryobalanoides”, J. Naturforsch, 60: 723-727.
Sastrohamidjoyo, H., 1992. “Spektroskopi Infra Merah”. UGM, Yogyakarta.
Shiomi, K., Hatae, K., Hatano, H., Matsumono, A., Takahashi, Y., Lin Jiang, C., Tomoda, H., Kobayashi, S., Tanaka, H., Omura, S., 2005. “A New Antibiotic, Antimycin A9, Produced by Streptomyces sp. K01-0031”, J.Antibiotic, 58(1): 74-78.
Shimano, M., Kamei, N., Shibata, T., Inoguchi, K., Itoh, N., Ikari, T., Senda, H., 1998. “Total Synthesis of the Antifungal Dilactones UK-2A and UK3A : The Determination of their Relative and Absolute
Configurations”. Tetrahedron Lett., 39 : 4363-4366.
Siswandono, B., Soekardjo, 2000. “Kimia Medisinal”, Jilid 1, Airlangga, University Press., Surabaya.
Siswondono, 2004. “Leukemia Peringkat Pertama Penyakit pada Anak.
Sumber”, hhtp://www.gizi.net/cgi-bin/berita/fullnews, diakses tanggal 15 Februari 2008, pukul 10.15 WIB.
Shi, Y., Cidlowski, J., Scott, D., Wu, J., Shi, Y.B., 2003. “Molecular
Mechanisms of Programmed Cell Death”. Kluwer Academic/Plenum, New York
Taniguchi, M., Shibata, K., Abe. K., Kodama, R., Uotani, K., 1995. Jpn.
Pattent, 7-233165.
Taniguchi, M., 2005. “Semisynthesis and Biological Evaluation of Analogues of UK-3A, a Novel Antifungal Antibiotics from Streptomyces sp. 517-02”, Bioorg. Med. Chem. Lett. 15: 2011-2014.
Ueki, M., 1995. “Studies on Novel Bioactive Metabolites from Streptomyces sp. 517-02”. Thesis, Departement of Chemistry Faculty of Science, Osaka City University, Osaka.
Ueki, M., Hanafi, M., Shabata K., Taniguchi, M., 1996. “UK-2A, B, C and D Novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 517-02: Structure elucidation”, J. Antibiotic, 49 : 1226-1231.
Ueki, M., et al., 1996a. “UK-3A a novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 517-02, fermentation, isolation, and biological properties”, J. Antibiotic, 49 : 639-644.
Ueki, M., et al., 1997a. “UK-3A a novel antifungal antibiotics from
Streptomyces sp. 517-02, fermentation, isolation, structure elucidation and biological properties”, J. Antibiotic, 50 (7) : 551-555.
Ueki, M., et al., 1997b. “The mode of action of UK-2A and UK-3A novel antifungal from Streptomyces sp. 517-02”, J. Antibiotic, 50 (12): 1052-1057.
Usuki, Y., et al., 2006. “Structure activity relationship studies on UK-2A, a novel antifungal antiniotic from Streptomyces sp. 517-02. Part 5: Roles of the 9-membered dilactone-ring moiety in respiratory inhibition”. J.
Biorg. Med. Chem. Lett., 16: 3319-3322.
Widodo, W. S., 1998. “Sintesis senyawa analog antibiotika UK-3
(3-hidroksipikolinil serin isobutil ester dan turunannya”, Skripsi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia, Depok.
Wulandari, R., 2007. “Sintesis dan Uji Aktivitas Biologi Senyawa Analog Antibiotika UK-3 : L-Diamilpikolinil Glutamat Ester dan L-Diheksil pikolinil Glutamat Ester”. Tesis. Magister Sains Ilmu Kimia, Program Pascasarjana U.I, Depok.
Yayasan Kanker Indonesia, 2006. “Apa Yang Harus Anda Ketahui Tentang Kanker. Yayasan Kanker Indonesia”,
http://news.indosiar.com/news_read.htm?id=21479, diakses tanggal 11 Februari 2008, pukul 11.45 WIB.