3 BAHAN DAN METODE
3.3 Metode Penelitian
3.3.5 Analisis Simbiosis Aspergillus dan Penicillium
S. selanica
Bentuk simbiosis Aspergillus dan Penicillium pelarut fosfat dengan tanaman uji dianalisis melalui beberapa tahap, yaitu analisis kolonisasi Aspergillus dan
Penicillium terpilih pada akar tanaman uji, respon tumbuh tanaman uji yang
diinokulasi Aspergillus dan Penicillium pelarut fosfat dengan perlakuan berbagai taraf % TCP (dinyatakan sebagai mg P2O5/tanaman) dalam larutan Hoagland dan serapan hara tanaman.
15 A Analisis kolonisasi dengan biru tripan 0.05% dan mikroskop pemindai
elektron
Analisis kolonisasi dilakukan dengan cara mewarnai akar tanaman yang telah diinokulasi dengan Aspergillus dan Penicillium menggunakan biru tripan 0.05%. Analisis dilakukan terhadap lima contoh dari masing-masing tanaman setiap minggu dengan pemberian dosis P 100% (setara 60 mg P2O5/tanaman). Metode pewarnaan akar mengikuti prosedur Kormanick & McGraw (1982) dan diperkuat dengan pengamatan mikroskop pemindai elektron. Akar tanaman dipisahkan dari media dengan hati-hati agar sistem perakaran tidak rusak. Akar dicuci dengan air mengalir selama 10 menit untuk menghilangkan sisa media tanam dan setelah itu dipotong dengan ukuran 1 cm. Akar direndam dalam larutan KOH 10% pada suhu 90o
Pengamatan kolonisasi Aspergillus dan Penicillium pada akar tanaman menggunakan mikroskop pemindai elektron sesuai dengan metode Lewinson (Lewinson et al. 1994). Preparasi diawali dengan merendam sampel akar di dalam
caccodylate buffer selama 2 jam, kemudian diagitasi dalam ultrasonic cleaner
selama 5 menit. Akar direndam dalam larutan glutaraldehyde 2.3% selama 2 hari dan difiksasi dengan tannic acid 2% selama 6 jam. Akar dicuci 4 kali dengan
caccodylate buffer selama 5 menit, selanjutnya didehidrasi secara bertahap dalam
alkohol 50% (5 menit), alkohol 70% (20 menit), alkohol 85% (20 menit), alkohol 95% (20 menit) dan 2 kali dalam alkohol absolut (10 menit). Akar selanjutnya direndam dua kali dalam tert butanol selama 10 menit, dibekukan dalam freezer
dan terakhir dimasukan ke dalam freezed drier sampai kering. Akar yang sudah kering diletakkan di atas batang besi dan dilapisi dengan 30 nm emas menggunakan mesin ion coater IB2. Struktur cendawan yang terdapat pada
C selama 10-15 menit untuk menghilangkan isi sel. Apabila selama proses tersebut akar masih gelap, maka perendaman dapat diperpanjang sampai diperoleh akar yang transparan. KOH dibuang dan sisanya dihilangkan dengan membilas akar dengan akuades sebanyak 3-5 kali. Akar direndam dalam larutan HCL 1N selama 1 malam, selanjutnya diwarnai dengan pewarna biru tripan 0.05% selama 20-30 menit. Akar yang telah diwarnai disimpan dalam larutan gliserol 50% dan diamati menggunakan mikroskop cahaya.
16
permukaan akar diamati menggunakan mikroskop pemindai elektron model JSM 5000 LV yang dioperasikan pada tegangan 20 kv. Pengamatan proses kolonisasi menggunakan mikroskop pemindai elektron dilakukan di Laboratorium Zoologi, LIPI Cibinong.
Akar dinyatakan terkolonisasi bila minimal setengah dari panjang potongan akar membawa Aspergillus dan Penicillium. Kolonisasi dinyatakan dalam persen jumlah akar terkolonisasi dari seluruh akar yang diamati tiap sampel. Struktur-struktur khusus cendawan yang terbentuk semuanya diamati dan didokumentasikan menggunakan kamera digital.
B Analisis respon tumbuh dan serapan hara tanaman inang yang diinokulasi kapang pelarut fosfat
Respon tumbuh dan serapan hara tanaman terhadap inokulasi Aspergillus
dan Penicillium pelarut fosfat diuji dengan memberi perlakuan berbagai dosis %
TCP (dinyatakan sebagai mg P2O5) dalam larutan Hoagland pada tanaman Z. mays dan S. selanica. Dosis TCP yang digunakan yaitu, 0% (0 mg P2O5/tanaman), 50% (setara 30 mg P2O5/tanaman) dan 100% (setara 60 mg P2O5/tanaman). Tanaman kontrol diberi perlakuan 60 mg P2O5
Setelah pengukuran parameter respon tumbuh tanaman selesai, maka dilakukan analisis serapan hara (NPK) terhadap tanaman tersebut. Analisis NPK dilakukan di Balai Penelitian Tanah, Bogor secara komposit. Serapan NPK (mg hara/tanaman) dihitung dengan mengalikan persentase kadar hara (%) dan bobot kering masing-masing tanaman.
/tanaman tetapi tidak diinokulasi dengan Aspergillus dan Penicillium pelarut fosfat. Parameter respon tumbuh yang diamati yaitu pertambahan tinggi tajuk tanaman, bobot basah dan kering tanaman, panjang akar serta bobot basah akar.
Sebelum dilakukan analisis NPK, sampel tanaman dicuci dengan air bebas ion untuk menghilangkan debu-debu dan kotoran yang menempel. Contoh tanaman kemudian dikeringkan di dalam oven dengan suhu 70oC. Contoh yang telah kering digiling dengan mesin grinder yang memiliki filter dengan kehalusan 0.5 mm, selanjutnya dipanaskan pada suhu 105oC selama 4 jam untuk menghilangkan air dan siap untuk dianalisis.
17 Analisis kadar N dilakukan menggunakan metode Kjehdahl. Sebanyak 0.25 g contoh tanaman dimasukkan ke dalam tabung digestion dan ditambah dengan 1 g campuran selen (siap pakai) dan 2.5 ml H2SO4. Campuran diratakan dan dibiarkan selama satu malam. Blanko dibuat dengan cara yang sama tetapi tidak mengandung sampel. Sampel selanjutnya dipanaskan hingga suhu 350oC dan dihentikan setelah terlihat ada uap putih yang keluar sehingga didapat ekstrak jernih. Tabung diangkat dan didinginkan, kemudian ekstrak diencerkan dengan air bebas ion hingga tepat 50 ml. Ekstrak dikocok sampai homogen dan dibiarkan semalam agar partikel mengendap. Satu ml ekstrak contoh dipipet ke dalam tabung reaksi, ditambah dengan 9 ml air bebas ion dan divorteks. Dua ml ekstrak encer dimasukkan dalam tabung reaksi baru dan ditambah larutan sangga Tartrat dan Na-fenat masing-masing sebanyak 4 ml, lalu divorteks dan dibiarkan 10 menit. Masing-masing tabung ditambah 4 ml NaOCl 5%, divorteks dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 636 nm. Larutan (NH4)2SO4
Penetapan unsur P dan K dilakukan dengan metode pengabuan basah menggunakan campuran asam nitrat (HNO
dengan konsentrasi 0-20 ppm digunakan sebagai standar.
3) dan asam perklorat (HClO4). Sebanyak 0.5 g sampel tanaman dimasukkan ke dalam tabung digestion, lalu ditambah dengan 5 ml HNO3 dan HClO4 dan dibiarkan selama satu malam. Sampel dipanaskan dalam digestion blok pada suhu 100oC selama satu jam, kemudian suhu ditingkatkan menjadi 150oC. Setelah uap kuning habis, suhu
digestion blok ditingkatkan menjadi 200o
Pengukuran kadar P dilakukan dengan mengencerkan masing-masing ekstrak contoh sampai 10x. Sebanyak 2 ml ekstrak encer contoh ditambah dengan 10 ml pereaksi pewarna P dan divorteks sampai homogen lalu dibiarkan selama 30 menit. Kadar P diukur pada panjang gelombang 693 nm dengan spektrofotometer UV-VIS. Sebagai standar digunakan larutan PO
C. Proses destruksi dihentikan setelah terlihat ada asap putih yang keluar dan sisa ekstrak kurang lebih 0,5 ml. Tabung diangkat dan dibiarkan dingin. Ekstrak diencerkan dengan air bebas ion hingga tepat 50 ml dan dikocok sampai homogen dan siap digunakan untuk penentuan kadar P dan K.
4 dengan konsentrasi 0-20 ppm.
18
Pengukuran kadar K dilakukan dengan cara memipet masing-masing 1 ml ekstrak ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan 9 ml larutan La 0,25 %. Larutan divorteks sampai homogen dan kadar K diukur menggunakan
flamefotometer. Larutan standar K yang digunakan adalah K2SO4
Percobaan dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 5 ulangan. Data selanjutnya diolah menggunakan program SPSS 16.0 dan diuji lanjut menggunakan uji Jarak Berganda Duncan.
dengan konsentrasi 0-250 ppm. Larutan pereaksi yang digunakan dalam penentuan kadar NPK dan rumus yang dipakai dapat dilihat pada Lampiran 3.