Bagan Alir Penelitian - TEORI MUTAKHIR - Penyakit Layu pada Stroberi di Bali dan Pemanfaatan Tr

BAB II TEORI MUTAKHIR

2.5 Bagan Alir Penelitian

Mengacu pada Rencana Induk Penelitian (RIP) Universitas Udayana 2012 – 2016, penelitian ini mendukung bidang unggulan Ketahanan Pangan. Salah satu indicator yang ingin dicapai pada pengembangan komuditas hortikultura buah-buahan sayuran dan tanaman hias tahun 2017-2021 adalah aplikasi peningkatan produktivitas dan kualitas. Peningkatan produktivitas dan kualitas dapat bisa dicapai dengan pengendalian hama dan penyakit tumbuhan. Penyakit layu adalah salah satu penyakit yang banyak terdapat pada tanaman stroberi di kawasan bedugul pada akhir akhir ini, yang sangat mengganggu produktivitas dan kualitas buah-buahan. Penelitian pendahuluan kami menunjukkan keberadaan penyakit ini mengakibatkan penurunan produksi sampai dengan 80% di Desa Pancasari, Kecamatan Sukasada, Buleleng dan Candikuning, Kecamatan Baturiti, Tabanan (hasil wawancara petani). Keberadaan penyakit ini, sebbelumnya belum pernah dilaporkan sehingga untuk upaya pengendaliannya sangat sulit dilakukan secara efektip dan efisien. Untuk itu diperlukan identifikasi patogen penyebab penyakit layu. Identifikasi penyebab patogen tanaman dapat dilakukan dengan meliaht ciri ciri morfologi dari patogen penyebab penyakit, tetapi biasanya dengan cara seperti itu hanya mampu untuk mengidentifikasi sampai tingkat genus.

Identifikasi yang lebih akurat dapat dilakukan dengan identifikasi secara molekuler melalui PCR, sequencing dan analisis filogeni.

Oleh karena itu maka penelitian ini dibuat untuk mengumpulkan data yang akurat untuk mengetahui spesies patogen, sehingga dapat dilakukan upaya pengendalian patogen secara efektip.

PENELITIAN PENDAHULUAN:

Pengumpulan data intensitas penyakit layu pada berbagai daerah sentra produksi stroberi; yaitu :

 Desa Pancasari, Kecamatan, Sukasada, Buleleng

 Desa Candikuning, Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan

Tahun I

 Identifikasi patogen penyebab penyakit layu stroberi dengan melihat ciri morfologi.

 Mengkoleksi mikroba antagonis yang berpotensi sebagai pengendali patogen penyebab penyakit layu stroberi

Luaran dan indikator capaian

1. Hasil Identifikasi yang akurat tidak hanya secara morfologi tetapi juga secara molekuler melali PCR, sequence nukleotida (DNA) dan filogeni penyakit layu stroberi di Bali

2. Dapat dianalisis kekerabatan secara filogeni patogen penyebab penyakit layu stroberi dengan di Bali dengan daerah lainnya 3. Mikroba antagonis yang berpotensi untuk dikembangkan menjadi agen pengendali penyakit layu stroberi yang ramah lingkungan.

Sejalan dengan road map diatas maka perencanaan penelitian kami buat sebagai berikut:

Gambar 2 Bagan alir penelitian

Tabel 1

Peta Jalan (Road Map) Ketahanan Pangan

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Identifikasi Patogen Penyebab Penyakit Layu

Identifikasi patogen penyebab penyakit layu dilakukan mengikuti prosedur postulat Koch. Prosedur postulat Koch meliputi: Penyebab penyakit harus ditemukan dalam tanaman yang sakit, tidak pada yang sehat, penyebab penyakit harus dapat diisolasi dari tanaman sakit dan dibiakkan dalam kultur murni, penyebab penyakit dapat dikulturkan dan menimbulkan penyakit pada tanaman sehat dengan gejala yang sama dengan gejala awal ditemukan penyakit, penyebab penyakit harus dapat diisolasi ulang dari tanaman yang diinokulasikan.

3.1.1 Isolasi Patogen Penyebab Penyakit Layu Pada Stroberi Sampel tanaman sakit diambil dari tanaman stroberi yang menunjukkan gejala layu dan berbecak pada batangnya di sentra pertanaman stroberi di desa Pancasari. Isolasi dilakukan dengan cara memotong bagian yang terinfeksi (daun, batang atau akar) dengan ukuran sekitar 1x1cm, dicelupkan ke dalam alkohol 70%

selama 2 menit untuk menghilangkan kontaminasi pada bagian luarnya. Potongan bagian tanaman kemudian dibilas dengan cara dicelupkan ke dalam akuades steril sebanyak 3 kali, setelah itu diletakkan pada permukaan media Potato Dextrose Agar (PDA) yang telah berisi antibiotik kloramfenikol (100mg/L) (Samson et al. 1995), kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 3-5 hari.

Miselium jamur yang tumbuh selanjutnya dimurnikan dengan cara mebiakkan kembali hifa dari jamur yang tumbuh pada media PDA. Jamur yang sudah murni kemudian dibiakkan dalam media PDA miring dan disimpan untuk uji berikutnya (Tsao, 1983).

19 Jamur yang telah berhasil diisolasi dan dimurnikan selanjutnya diuji patogenitasnya pada tanaman stroberi. Identifikasi spora jamur dilakukan berdasarkan tingkat pertumbuhan, warna koloni, diameter koloni, dan bentuk spora. Isolat yang akan diidentifikasi dibuatkan slide culture sesuai dengan metode (Duncan dalam Onions et.al 1981) dengan tujuan mengamati struktur jamur secara jelas. Slide yang telah dibuat diidentifikasi pada mikroskop dengan perbesaran 40x dan 100x. Kemudian dilakukan pengamatan terhadap struktur miselium, spora atau konidianya, dan badan penghasil sporanya. Ciri-ciri setiap isolat dibandingkan berdasarkan kunci determinasi pada Atlas of Entomopathogenic Fungi (Samson et al, 1996) dan sumber lainnya.

3.1.2 Uji Patogenitas Jamur Hasil Isolasi

Jamur patogen yang telah diisolasi dari tanaman stroberi yang menunjukkan gejala layu, diinokulasikan pada tanaman stroberi sehat yang berumur 1 bulan. Inokulasi dilakukan dengan menyiramkan biakan jamur yang telah dibiakkan selama 3 hari pada media PD-broth ke bagian akar dan mengoleskan isolat jamur pada batang dan daun stroberi yang telah dilukai sebelumnya. Stroberri yang telah diinokulasikan dengan kandidat patogen selanjutnya diamati perkembangan penyakitnya dengan mencatat gejala yang ditimbulkan. Pengamatan dilakukan mulai 3 hari setelah inokulasi.

Kandidat patogen yang mengakibatkan tanaman sakit sesuai dengan gejala awal ditemukan penyakit selanjutnya diisolasi kembali sesuai dengan metode di atas kemudian diidentifikasi.

3.1.3 Identifikasi Patogen penyebab penyakit layu secara morfologi

Patogen penyebab penyakit layu hasil isolasi kemudian diidentifikasi dengan mengamati morfologi jamur secara makroskopis dan mikroskopis. Karakteristik morfologi jamur

kemudian dicocokkan dengan karakteristik jamur yang terdapat pada buku CMI untuk menentukan nama genusnya.

3.1.4 Identifikasi Molekuler

Identifikasi molekuler jamur dilakukan dengan menggunakan primer universal yang didesain dari Internal Transkript Spacer (ITS) 1 (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) dan ITS 4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3). Tahapan identifkasi molekuler terdiri dari ekstraksi DNA total, PCR, Visualisasi, dan sikuensing.

Ekstraksi DNA. Isolat jamur penyeab penyakit layu stroberi diremajakan pada media padat Potato Dextrose Agar (PDA). Isolasi DNA dilakukan pada miselium berumur 4 hari dengan metode kit Wizard Genomic ex Promega Corp.

PCR. Hasil ekstraksi DNA kemudian diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer yang didesain dari Internal Transkript Spacer (ITS) 1 (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) dan ITS 4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3). Total volume untuk amplifikasi PCR adalah 50 μL, terdiri dari isolat DNA sebanyak 3 μL, primer ITS1 dan ITS4 masing-masing 10 μL, dNTP 2 mM sebanyak 5 μL, Gotec Colourless sebanyak 5 μL, MgCl2 sebanyak 3 μL, akuades steril sebanyak 8,75 μL dan Taq DNA polimerase sebanyak 0,25 μL. dilakukan pada Thermal cycler pada kondisi predenaturasi pada 94 ºC selama 4 menit ; dilanjutkan dengan 40 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94 ºC selama 35 detik, penempelan primer (annealing) pada 52 ºC selama 30 detik dan pemanjangan (extension) pada 72 ºC selama 30 detik; dan siklus terakhir ditambahkan 10 menit pada 72 ºC.

Elektroforesis dan Sekuensing. Produk PCR 5 μl (ditambah 2 μl loading dye) dielektroforesis dalam gel agarose 2%.

Elektroforesis dilakukan selama 30 menit pada 100 Volt. DNA yang telah dielektroforesis kemudian divisualisasi dengan UV

21 transluminator. Sekuensing dilalukan di Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga Yogyakarta untuk dilakukan sekuen nukleotida.

Analisis Sikuen. Hasil sekuen dianalisis untuk membuat allignment kemudian digunakan untuk mengetahui tingkat homologi atau kesejajaran dengan sekuen gen B. bryoniae yang telah dipublikasikan di GeneBank dengan Program Basic Local Alignment Tool (BLAST) (NCBI 2014).

Analisis Filogenetik. Data sekuen nukleotida kemudian dilanjutkan dengan analisis filogenetika menggunakan software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 5.05).

3.2 Isolasi Mikroba Antagonis Patogen Penyebab Penyakit Layu Pada Stroberi

Mikroba antagonis diisolasi dari tanah rhizosfer tanaman stroberi sehat di daerah Bedugul, rhizosfer tanaman jambu biji kristal di desa Plaga, rhizosfer tanaman brokoli, rhizosfer tanaman sehat di Kebun Raya Bedugul dan tanah di sekitar kotoran sapi.

Isolasi mikroba antagonis dilakukan dengan metode pengenceran berseri. Sampel tanah sebanyak 50 gram disuspensikan dengan 500 ml air steril dalam erlenmeyer. Suspensi tersebut dikocok sampai homogen menggunakan rotary shaker berkecepatan 200 rpm selama 30 menit, selanjutnya larutan yang sudah tercampur secara homogen dipindahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air steril sehingga diperoleh pengenceran 10^-1. Hasil pengenceran tersebut selanjutnya diencerkan kembali secara berseri sehingga diperoleh suspensi 10^-2, 10^-3, 10^-4 sampai 10^-6. Kandidat mikroba antagonis dari golongan jamur dibiakkan dari tingkat pengenceran 10^-3-10^-4, sedangkan dari golongan bakteri dibiakkan dari pengenceran 10^-5-10^-6.

Pembiakan kandidat mikroba antagonis dilakukan dengan meneteskan suspensi sebanyak 0,5 ml pada media biakan yang sesuai untuk pertumbuhannya. Suspensi yang telah diteteskan

pada cawan petri kemudian diratakan menggunakan glass rod steril dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 2-3 hari.

Media yang telah ditumbuhi dengan kandidat mikroba antagonis kemudian disemprotkan dengan spora mikroba patogen yang telah diencerkan pada air steril. Kandidat mikroba antagonis yang menghasilkan zone hambatan dipilih untuk dimurnikan. Koloni mikroba antagonis yang tumbuh selanjutnya diidentifikasi

3.3 Uji In Vitro Kemampuan Mikroba Antagonis Mengen-dalikan Patogen Penyebab Penyakit Layu Stroberi Kandidat mikroba antagonis terpilih diuji kemampuannya untuk mengendalikan patogen penyebab penyakit layu pada tanaman stroberi secara in vitro dengan metode biakan ganda (dual culture method) (Benhamou dan Chet, 1993). Uji biakan ganda dilakukan dengan menanam isolat mikroba antagonis dan isolat jamur patogen penyakit layu berhadapan dalam cawan petri berdiameter 9 cm, jarak antar inokulum 3 cm. Inokulum patogen penyakit layu dan mikroba antagonis berupa potongan biakan berdiameter 8 mm yang diambil menggunakan pelubang gabus (cork borer) (Sudantha dan Abadi, 2007). Selanjutnya cawan petri tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 6 hari.

Pengamatan dilakukan dengan mengukur selisih jari-jari koloni patogen pada kontrol (R0) dengan jari jari koloni patogen pada perlakuan (R1) dibandingkan dengan jari-jari koloni patogen pada kontrol (R0) cawan kontrol / tanpa perlakuan isolat mikroba antagonis seperti Gambar 1

Gambar 3

Skema uji daya hambat mikroba antagonis terhadap pertumbuhan patogen penyebab penyakit layu stroberi secara in vitro

Rumus persentase daya hambat mikroba antagonis terhadap pertumbuhan patogen penyebab penyakit layu stroberi secara in vitro :

P = R0-R1 x 100%

R0 Dimana:

R0 = Jari-jari pertumbuhan jamur patogen pada kontrol (cm), R1 = Jari-jari pertumbuhan jamur patogen pada perlakuan (cm),

P = Persentase daya hambat (%).

R0 R1

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Keparahan Penyakit Layu Stroberi di Kawasan Bedugul

Penyakit layu stroberi semenjak tahun 2017 menjadi permasalahan penting bagi petani stroberi di Kawasan Bedugul.

Tanaman stroberi yang menunjukkan gejala kelayuan di Desa Pancasari, Kecamatan Sukasada, Kabupaten Buleleng adalah 90% dan di Desa Candikuning, Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan adalah 82%. Gejala penyakit layu tanaman stroberi di Desa Pancasari selain menunjukkan gejala kelayuan, pada bagian tanaman diatas permukaan tanah seperti: daun, memiliki bercak yang kemudian melebar ke seluruh permukaan daun sehingga daun tampak berwarna merah serta mengalami kekeringan (Suryawan et al. 2017; Sari et al. 2018; Wirya et al. 2020).

Gambar 4

Gejala layu stroberi pada bagian tanaman di atas dan di bawah permukaan tanah. (A) Gejala layu bagian tanaman di atas permukaan tanah. (B) Perakaran tanaman yang mengalami gejala kelayuan, 1. Tanaman sehat;

2. Tanaman terserang ringan; tanaman terserang berat

B ¹ ² ³

25 Batang, mengalami bercak berwarna coklat yang selanjutnya akan menyebar ke seluruh batang sampai dengan pangkal batang dan mengalami kebusukan. Bagian tanaman di bawah permukaan tanah menunjukkan perakaran tanaman yang pendek dan mengalami kebusukan (Gambar 4.B). Kebusukan pada perakaran tanaman mengakibatkan terganggunya proses penyerapan zat makanan dari akar sehingga menyebabkan tanaman layu. Demikian pula kebusukan pada pangkal batang dan batang mengakibatkan terganggunya proses transportasi bahan makanan dari perakaran ke bagian atas tanaman, sehingga tanaman mengalami layu dan kematian. Gejala-gejala pada tanaman stroberi seperti di atas belum pernah dilaporkan di Bali sebelumnya.

Penyakit layu pada tanaman stroberi di Indonesia pernah dilaporkan terjadi di Berastagi, Sumatera Utara yang disebabkan oleh Fusarium oxysporum (Dwiastuti dkk, 2015). Gejala penyakit layu akibat infeksi F. oxysporum di Berastagi ditandai dengan adanya perubahan warna pada bagian pucuk tanaman yang terserang menjadi cokelat kemerahan, kemudian bagian tersebut akan menjadi layu. Kelayuan tanaman dapat terjadi secara bertahap pada beberapa daun dan akan berkembang ke seluruh bagian tanaman. Gejala tanaman yang terserang parah ditandai oleh tanaman layu, mati secara cepat dan akar tanaman sakit mengalami pembusukan (Alex, 2012; Dwiastuti dkk, 2015).

F. oxysporum juga dilaporkan oleh Phillips & Hossein (2008) menyebabkan penurunan produksi buah stroberi sampai dengan 70% di Australia Barat.

Penyakit layu pada tanaman stroberi selain disebabkan oleh Fusarium, juga didilaporkan di California, Amerika Serikat disebabkan oleh Verticillium (Gordon, et al 2008). Penyakit Layu Verticillium sering muncul pada tanaman yang baru ditanam. Infeksi oleh Verticillium pada tanaman stroberi mengakibatkan daun tanaman bagian luar dan tua terkulai, layu pada pinggiran daun, serta

diantara tulang daun mengalami kekeringan dan menjadi kuning kemerahan atau coklat tua. Infeksi pada daun yang baru terbentuk mengakibatkan pertumbuhan daun terlambat dan mengalami layu.

Tanaman yang terinfeksi Verticillium sp. seringkali kerdil dengan warna daun yang berubah menjadi kekuningan, nampak seperti tanaman yang menderita kekurangan air. Pada stolon dan tangkai daun, terdapat bercak coklat atau hitam kebiruan. Akar yang baru tumbuh dari batang utama seringkali mengalami kekerdilan dan menghitam. Garis-garis berwarna kecoklatan juga biasanya terjadi di dalam pangkal batang utama dan pada akar yang membusuk.

Infeksi patogen yang berat mengakibatkan sebagian besar tanaman layu dan segera mengalami kematian. Kematian stroberi akibat infeksi Verticillium, biasanya terjadi pada kondisi tanaman yang mengalami stres akibat panas, kekeringan, atau kelebihan air.

Infeksi Verticillium terkadang tidak mengakibatkan kematian pada keseluruhan tanaman, dimana ketika tanaman induk mati, satu atau lebih stolon tanaman tetap bertahan dan tidak menunjukkan gejala (Gordon, et al 2008).

4.2 Isolasi dan identifikasi mikroba yang berasosiasi dengan stroberi bergejala layu

Hasil penelitian Sari et al. (2018) mengisolasi dan mengamati perkembangan tanaman stroberi yang bergejala layu secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan secara makrokopis dilakukan dengan melihat bentuk dan warna koloni.

Secara mikroskopis, dengan melihat bentuk hifa dan bentuk spora patogen. Hasil dari isolasi, satu jenis jamur dapat diisolasi dari perakaran tanaman stroberi yang menunjukkan gejala sakit.

Pada media PDA pertumbuhan jamur cepat, koloni jamur yang berwarna putih mulai tumbuh pada hari ketiga setelah inokulasi, selanjutnya pada hari kelima koloni berubah warna menjadi coklat tua kehitaman (Gambar 5). Pada hari ke tujuh media PDA sudah terisi penuh oleh koloni jamur.

Gambar 5

Jamur hasil isolasi dari tanaman stroberi layu dibiakkan pada media PDA. (A) Tampak bawah koloni jamur pada 3 hari setelah isolasi (hsi); (B) Tampak atas koloni jamur pada 3 hsi; (C) Tampak bawah koloni jamur pada 5 hsi, koloni

berwarna merah kehitaman; (D) Tampak atas koloni jamur pada 5 hsi.

Gambar 6

Makrokonidia dan mikrokonidia jamur hasil isolasi dari tanaman stroberi layu di Desa Pancasari

A B

C D

Hasil pengamatan secara mikroskopis jamur yang berasosiasi dengan tanaman stroberi memiliki 2 jenis konidia yaitu makrokonidia dan mikrokonidia. Makrokonidia berbentuk tabung memanjang dengan bagian ujung yang meruncing dan memiliki 2 – 6 sel, Warna dari konidia jamur ini hialin atau terang.

Mikrokonidia berbentuk lonjong dapat terdiri dari 1 sel atau 2 sel. Miselium dari jamur yang tumbuh pada media bersekat dan membentuk percabangan (Suryawan et al. 2017; Sari et al. 2018;

Sanjaya, 2018).

Hasil pengamatan bentuk dan warna koloni jamur hasil isolasi yang telah dibiakan pada media PDA kemudian dicocokkan dengan buku CMI description of pathogenic fungi & bacteria (1981). Jamur hasil isolasi memiliki kesamaan dengan warna dari koloni patogen Fusarium oxysporum. CMI description of pathogenic fungi & bacteria, (1981) melaporkan F. oxysporum pada media sintetis awalnya berwarna putih tapi kemudian menjadi ungu, dengan sporodokia oranye, tampak pada beberapa strain. Konidiospora, sarana di mana F. oxysporum aseksual bereproduksi, adalah monofialida yang tunggal, berbentuk labu yang kemudian disusun menjadi kelompok bercabang padat.

Konidia berbentuk lonjong, sedikit melengkung, mengarah ke ujungnya, kebanyakan terdiri dari tiga septa, sel basal pedicellate, 23-54 x 3-4,5 μm. Mikrokonidia berlimpah, tidak pernah berbentuk berantai, kebanyakan tidak berseptate, berbentuk silindris, lurus atau melengkung, berukuran 5-12 x 2.3-3.5 μm. Dari hasil pengamatan mikroskopis dan makroskopis hasil isolasi mikroba yang berasosiasi dengan tanaman stroberi yang mengalami kelayuan, kemungkinan mikroba yang berhasil diisolasi adalah Fusarium sp. Untuk memastikan spesies dari Fusarium penelitian dilanjutkan dengan identifikasi secara molekuler dengan PCR dan sequencing.

29 4.3 Uji patogenitas hasil isolasi patogen penyebab penyakit

layu stroberi

Untuk mengetahui patogenitas dari Fusarium yang telah diisolasi dari tanaman stroberi, penelitian (Suryawan et al.

2017; Sari et al. 2018) berhasil menguji daya patogenitasnya.

Uji patogenitas dilakukan dengan menginokulasikan tanaman sehat dengan mikroba hasil isolasi. Tanaman stroberi yang diinokulasi dengan isolat jamur kemudian diamati selama 6 minggu atau sampai tanaman memperlihatkan gejala layu. Gejala akibat infeksi Fusarium sp. mulai terlihat pada akar tanaman stroberi 2 minggu setelah infeksi. Infeksi oleh Fusarium pada minggu ke-2 setelah inokulasi mengakibatkan perubahan warna akar menjadi hitam dan mulai menampakkan gejala kebusukan.

Pada minggu ke-3 dan 4 setelah inokulasi, pada batang dan daun stroberi yang diinokulasi Fusarium mulai menampakkan bercak berwarna coklat. Pada minggu ke-6 setelah inokulasi tanaman yang sebelumnya mengalami kelayuan menjadi mati karena terganggunya proses fisiologis tanaman akibat infeksi patogen penyakit layu. Sedangkan Tanaman kontrol yang diinokulasikan dengan air steril pada minggu ke-6 masih sehat tidak ada tanda kelayuan pada tanaman. Gejala sakit pada tanaman stroberi pada uji patogenitas ini serupa dengan gejala penyakit yang ditemukan pada stroberi di lapang.

Gambar 7

Hasil reinokulasi isolat jamur hasil isolasi pada tanaman stroberi. (A) Tanaman bergejala penyakit layu di lapangan; (B) Tanaman kontrol yang diinokulasikan air; (C) Tanaman stroberi yang diinokulasi dengan jamur hasil isolasi, menunjukkan gejala yang sama dengan gejala tanaman sakit di lapang.

A B C

Jamur hasil uji patogenitas diisolasi kembali dan dibiakkan pada media PDA untuk mendapatkan biakan jamur murni penyebab penyakit. Biakan jamur murni kemudian diamati secara mikroskopis. Hasil pengamatan secara mikroskopis menunjukkan jamur hasil uji patogenitas memiliki konidia yang sama dengan konidia yang ditemukan pada tanaman stroberi layu di lapang. Jamur memiliki du tipe konidia yaitu mikrokonidia dan makrokonidia. Makrokonidia berbentuk tabung memanjang dengan bagian ujung yang meruncing dan memiliki 2 - 6 sel, Warna dari konidia jamur ini hialin atau terang. Mikrokonidia berbentuk lonjong dapat terdiri dari 1 sel atau 2 sel. Miselium dari jamur yang tumbuh pada media bersekat dan membentuk percabangan. Sehingga dapat dipastikan mikroba yang berhasil diisolasi dari tanaman stroberi sakit, yaitu Fusarium adalah patogen yang menginfeksi tanaman stroberi di Desa Pancasari (Sari et al. 2018). Untuk mengetahui spesies dari Fusarium, yang telah dipastikan sebagai patogen penyebab penyakit layu stroberi, penelitian dilanjutkan dengan mengidentifikasi Fusarium secara molekuler.

4.4. Identifikasi secara Molekuler Patogen penyebab Layu Stroberi

Jamur patogen hasil isolasi dari tanaman stroberi yang layu dari Desa Pancasari setelah dideteksi dengan PCR menggunakan primer universal ITS1F (5’ TCCGTAGGTGA ACCTGCGG 3’) dan ITS4R (3’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 5’) berhasil teramplifikasi. Isolat tersebut berhasil terdeteksi dengan produk PCR 544 bp, sesuai dengan primer yang digunakan, dengan patokan ukuran DNA menggunakan 1kb DNA Ladder (Promega, USA) (Wirya et al. 2020). Hasil tersebut dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8

Visualisasi pita DNA jamur hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer ITS1F dan ITS4R. M, Penanda DNA 1 kb (Promega USA); 1, isolat jamur

yang diisolasi dari stroberi layu di Pancasari.

DNA hasil PCR kemudian disekuen dan dicari tingkat kesamaannya dengan data sequence daerah Internal Transcribed Spacer (ITS) isolat Fusarium dan Verticillium pada GeneBank.

Tabel 2

Tingkat kesamaan hasil sekuen Internal Transcribed Spacer (ITS) patogen penyebab penyakit layu dengan isolat jamur lainnya.

M 1

No Homologi

Isolat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1. PLSPs_01 ID 99% 90% 90% 85% 84% 91% 91% 91% 92% 90% 57%

2. DQ452448 99% ID 90% 91% 85% 84% 91% 92% 91% 93% 91% 57%

3. U61679 90% 90% ID 99% 83% 82% 89% 90% 85% 91% 86% 60%

4. U34580 90% 91% 99% ID 84% 83% 90% 91% 86% 91% 86% 59%

5. NR_121457 85% 85% 83% 84% ID 96% 84% 85% 81% 90% 81% 52%

6. NR_121203 84% 84% 82% 83% 96% ID 83% 83% 80% 86% 80% 53%

7. NR_120263 91% 91% 89% 90% 84% 83% ID 99% 86% 88% 86% 56%

8. NR_120262 91% 92% 90% 91% 85% 83% 99% ID 87% 88% 87% 56%

9. NR_111142 91% 91% 85% 86% 81% 80% 86% 87% ID 88% 99% 58%

10. AY213655 92% 93% 91% 91% 90% 86% 88% 88% 88% ID 89% 57%

11. AY213654 90% 91% 86% 86% 81% 80% 86% 87% 99% 89% ID 58%

12. AB585937 57% 57% 60% 59% 52% 53% 56% 56% 58% 57% 58% ID

PLSPs01 = Jamur Pancasari; DQ452448 = Fusarium oxysporum; U61679 = Fusarium concolor;

34580 = Fusarium polyphialidicum NRRL13459; NR121457 = Fusarium equiseti; NR121203 = Fusarium boothii; R120263 = Fusarium circinatum; NR120262 = Fusarium bactridioides; NR111142

=Fusarium acutatum; AY213655 = Fusarium chlamydosporum AY213654 = Fusarium annulatum;

AB585937 = Verticillium dahlia var.longisporum

Pengujian tingkat homologi antar isolat menunjukkan patogen yang diisolasi dari tanaman stroberi yang menunjukkan gejala layu stroberi di Pancasari menunjukkan kesamaan sebesar 99% dengan Fusarium oxysporum; 93% dengan F.

Hubungan kedekatan antara sekuen nukleotida jamur yang diisolasi dari tanaman stroberi layu di Desa Pancasari dengan nukleotida yang ada pada geneBank ditunjukkan dengan Jarak Genetik pada Tabel 3.

Tabel 3

Matrik jarak genetik hasil sekuen Internal Transcribed Spacer (ITS) patogen penyebab penyakit layu dengan isolat jamur lainnya

Berdasarkan analisa jarak genetik pada Tabel 3, jamur yang diisolasi dari tanaman stroberi layu di Desa Pancasari, memiliki jarak genetik yang paling rendah dengan Fusarium oxysporum

PLSPs01 = Jamur Pancasari; DQ452448= Fusarium oxysporum; U61679= Fusarium concolor;

U34580= Fusarium polyphialidicum NRRL13459; NR121457= Fusarium equiseti; NR121203 = Fusarium boothii; NR120263 = Fusarium circinatum; NR120262 = Fusarium bactridioides; NR111142

=Fusarium acutatum; AY213655 = Fusarium chlamydosporum; AY213654 = Fusarium annulatum;

AB585937 = Verticillium dahlia var. longisporum

33 (DQ452448) sebesar 0,005. Rendahnya jarak genetik ini menunjukkan bahwa kesamaan gen antara kedua jamur tersebut sangat tinggi. Jarak genetik Fusarium yang diisolasi dari stroberi sakit di Pancasari dengan Verticillium dahlia var. longisporum (AB585937) sebesar 0,286. Nilai jarak genetik dari isolat tersebut tergolong cukup tinggi yang menandakan antara kedua spesies jamur memiliki kesamaan genetik yang rendah.

Jarak genetik dari Jamur Fusarium yang diisolasi dari

Dalam dokumen Penyakit Layu pada Stroberi di Bali dan Pemanfaatan Trichoderma sp. untuk Pengendaliannya (Halaman 33-0)