Halaman 1 Alur penelitian
BAHA DA METODE Bahan dan Alat
Bahan/bahan yang digunakan adalah propolis kasar Trigona spp asal Pandeglang, bakteri Gram positif (S. aureus dan B. subtilis), bakteri Gram negatif (Salmonella sp dan E. coli), media padat )utrient Agar (NA), media cair )utrient Broth (NB), media padat Peptone Yeast Glucose (PYG), natrium
6
klorida, etanol 70%, maltodekstrin, magnesium stearat, KBr, akuades, dan ampisilin.
Alat/alat yang digunakan adalah autoklaf, shaker orbital, rotavapor, pengering vakum, magnetic stirer, laminar air flow cabinet, wrap, cawan petri, jarum ose, penangas air bergoyang, neraca analitik, vortex, kertas saring, spektrofotometer UV, homogenizer Janke and Kunkel IKA®, High Energy Milling (HEM), Scanning Electron Microscopy (SEM), mikropipet, jangka sorong, dan alat/ alat gelas lainnya.
Metode Ektraksi Propolis
Propolis diekstraksi dengan metode Harbone (1987) serta Matienzo dan Lamonera (2004). Ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan pelarut etanol 70%. Sebanyak 150 gram propolis yang diperoleh dari sarang lebah madu Trigona spp asal Pandeglang direndam dengan etanol 70%, ditutup lalu disimpan dalam ruangan gelap selama 1 minggu. Setiap hari dilakukan pengocokan. Setelah satu minggu, filtrat diambil dan disaring serta sisanya dilakukan ekstraksi kembali. Selanjutnya filtrat diambil setiap hari selama satu minggu hingga pelarut jernih.
Setelah filtrat ekstrak propolis diperoleh, dilakukan pemekatan dengan menggunakan rotavapor pada suhu 40oC. Ekstrak pekatnya ditimbang sehingga dihasilkan nilai rendemen. Ekstrak ini dilarutkan dalam etanol 70% sebanyak satu kali volumenya yang disebut ekstrak etanol propolis (EEP).
Pembuatan anopropolis 5%
Nanopropolis dibuat menggunakan penggabungan metode modifikasi Bhaskar et al. (2009) dengan Sutriyo et al. (2004). Sebanyak 20 gram ekstrak etanol propolis ditambahkan 120 ml etanol 70%. Bahan penyalut maltodekstrin sebanyak 85 gram dilarutkan dalam akuades 80 ml dan ditambahkan 5 gram Mg/stearat lalu diaduk dengan stirer sampai tercampur rata. Campuran maltodekstrin dihomogenisasi pada kecepatan 22000 rpm selama 30 menit. Propolis yang terlarut dengan etanol 70% dicampurkan dengan campuran penyalut dan dihomogenisasi kembali pada kecepatan 22000 rpm selama 30 menit. Larutan dikeringkan dengan pengering vakum pada suhu 40°C. Serbuk yang terbentuk kemudian dihaluskan dan disamaratakan dengan High Energy Milling (HEM) dengan kecepatan 915 rpm dan frekuensi 28,8 Hz selama 15 menit.
Hasil nanopropolis diidentifikasi menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM). Penggunaan HEM dan SEM dilakukan di Laboratorium BATAN, Puspiptek, Serpong.
Karakterisasi SEM anopropolis
Nanopropolis dikarakterisasi dengan alat JSM/6510LA Analytical Scanning Electron Microscope (Jeol) di BATAN, Puspiptek, Serpong. Sebanyak 0.3 gram serbuk nanopropolis dimasukkan ke dalam plat platinum, kemudian permukaannya dilapisi (coating) dengan emas. Plat platinum yang berisi nanopropolis dimasukkan ke dalam alat SEM S500 coating unit selama 15 menit. Selanjutnya, nanopropolis diamati dengan SEM yang telah terhubung dengan komputer. SEM diatur dalam keadaan vakum dengan tegangan 20 kV. Perbesaran diatur berdasarkan visualisasi terbaiknya.
Profil Spektrum FTIR anopropolis Serbuk nanopropolis ditimbang sebanyak 1.5 gram dan dicampur dengan 300 gram KBr. Campuran ini kemudian dihaluskan dengan mortar sampai tercampur rata. Selanjutnya bahan yang telah tercampur dimasukkan ke dalam cetakan dan ditutup rapat. Cetakan sampel dimasukkan ke dalam alat pres yang tersambung dengan pompa tekan. Penakanan sampel menggunakan pompa tekan dilakukan selama 15 menit sampai terbentuk pelet. Pelet yang terbentuk selanjutnya dianalisis menggunakan FTIR di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, Bogor.
Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumur agar (Hadioetomo 1990). Kontrol positif yang digunakan yaitu ampisilin tablet 500 mg dengan konsentrasi 10 mg/ml dan kontrol negatifnya digunakan akuades.
Regenerasi Bakteri Uji. Sebelum digunakan, bakteri yang akan dipakai harus diregenerasikan terlebih dahulu. Bakteri yang berasal dari kultur primer mula/mula dibiakkan ke dalam agar miring NA. Sebanyak satu ose bakteri digoreskan ke agar miring NA lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Biakan ini merupakan aktivitas awal stok bakteri yang disimpan pada suhu 4/5oC.
Uji Pendahuluan Aktivitas Antibakteri. Sebanyak satu ose bakteri dari stok biakan diambil lalu diinkubasi ke dalam 10 ml NB selama 18/24 jam pada penangas air
7
bergoyang dengan suhu 37oC. Setelah itu dari biakan diambil sejumlah bakteri yang disebarkan di dalam cawan petri, lalu dituangkan 20 ml media PYG bersuhu ± 45oC, lalu cawan digoyangkan agar bakteri tersebar merata. Selanjutnya didiamkan pada suhu kamar sampai media agar memadat. Setelah padat, agar dilubangi dengan diameter ± 5 mm. Ke dalam lubang tersebut dimasukkan ekstrak nanopropolis sebanyak 50 µl lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Daerah bening yang terlihat di sekeliling lubang menandakan adanya aktivitas antibakteri pada sampel. Volume bakteri yang diambil berdasarkan nilai absorban yang terukur pada panjang gelombang 600 nm sengan spektrofotometer UV. Jika nilai absorban yang terukur kurang dari 1,000 maka volume bakteri yang diambil sebanyak 100 µl. Jika nilai absorban yang terukur lebih dari 1,000 maka volume yang diambil sebanyak 50 µl (Hadioetomo 1990).
Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum
Penentuan KHTM dilakukan setelah diketahui bahwa ekstrak propolis memiliki aktivitas antibakteri. Tahap pertama yaitu pengenceran nanopropolis dengan akuades sehingga didapatkan 10 konsentrasi (0.009% sampai 5% v/v). Setiap konsentrasi sebanyak 50 µl dimasukkan ke dalam lubang media PYG padat yang mengandung bakteri uji, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Aktivitas antibakteri diperoleh dengan mengukur diamter zona bening di sekitar lubang sampel menggunakan jangka sorong. Analisis Statistik
Analisis statistik yang digunakan dalam pengolahan data adalah rancangan percobaan dua faktor dalam rancangan acak lengkap. Berikut ini merupakan model rancangannya (Mattjik & Sumertajaya 2002)
Yij = + τi + εij
Yij = Pengamatan pada perlakuan ke/I
dan ulangan ke/j = Pengaruh rataan umum τ = Pengaruh perlakuan ke/i
ε = Pengaruh acak pada perlakuan ke/i ulangan ke j
Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (Analysis of variance) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf α 0.05. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan. Seluruh data dianalisis dengan menggunakan program SPSS 16.0.
HASIL DA PEMBAHASA