Bahan yang digunakan dalam penelitian diantaranya: Nitrogen cair, larutan ekstraksi DNA yang berasal dari kit isolasi DNA GenElute (Sigma), yaitu lysis solution A, lysis solution B, presipitation solution (PPT), binding solution, column preparation solution, wash solution, elusion solution (TE), larutan bufer PCR, larutan MgCl2, dNTP mix, 14 pasang primer mikrosatelit 1 µM, ddH2O, kit QIAxcel DNA high-resolution, mineral oil, larutan marker DNA 100 bp, 400 bp, dan 1500 bp.
Alat yang digunakan dalam penelitian, diantaranya lumpang porselin (mortar), pipet mikro P-10, P-20, P-100, P-200, dan P-1000, tip pipet biru, tip pipet kuning, tip pipet putih, gunting, spatula stainless, tabung mikro 2 mL,
filtration column in tube (kolom merah), nucleic acid binding column in tube
(kolom biru), tabung mikro PCR 0.2 mL, freezer, sentrifus mikro 200R Hettich- Centrifuge, shaker PCR Thermolyne Amplitron II, waterbath Julabo SW 22, mesin PCR Thermal Cycler Veriti-96 well Applied Biosystem, QIAxcel system.
Tabel 2 Progeny Ortet, kode ortet dan kode klon yang digunakan dalam penelitian
No. Progeny Ortet Kode Ortet Kode Klon*
1 CCPT01 1396 10 E1 : 10.1 10.2 10.3 E2 : 10.4 10.5 10.6 E3 : 10.7 10.8 10.9 2 CCPT01 1399 16 E1 : 16.1 16.2 16.3 E2 : 16.4 16.5 16.6 E3 : 16.7 16.8 16.9 3 CCPT01 658 36 E1 : 36.1 36.2 36.3 E2 : 36.4 36.5 36.6 E3 : 36.7 36.8 36.9 4 CCPT01 106 48 E1 : 48.1 48.2 48.3 E2 : 48.4 48.5 48.6 E3 : 48.7 48.8 48.9 5 CCPT01 670 51 E1 : 51.1 51.2 51.3 E2 : 51.4 51.5 51.6 E3 : 51.7 51.8 51.9 6 CCPT01 164 90 E1 : 90.1 90.2 90.3 E2 : 90.4 90.5 90.6 E3 : 90.7 90.8 90.9 7 CCPT01 752 120 E1 : 120.1 120.2 120.3 E2 : 120.4 120.5 120.6 E3 : 120.7 120.8 120.9 8 CCPT01 781 124 E1 : 124.1 124.2 124.3 E2 : 124.4 124.5 124.6 E3 : 124.7 124.8 124.9 9 CCPT01 934 228 E1 : 228.1 228.2 228.3 E2 : 228.4 228.5 228.6 E3 : 228.7 228.8 228.9 *
Klon berasal dari perkembangan embrioid panen pertama (E1); klon hasil perkembangan embrioid panen kedua (E2); dan klon hasil perkembangan embrioid panen ketiga (E3)
Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap (Gambar 3).
Gambar 3 Bagan alir penelitian
Isolasi DNA
DNA sampel uji yang diketahui kualitas dan kuantitasnya
Amplifikasi DNA
Elektroforesis dengan QIAxcel
Tabulasi alel dan data biner
Sekuen DNA mikrosatelit sesuai dengan primer yang digunakan
Alel-alel pada masing-masing lokus primer mikrosatelit
Data biner dari alel masing-masing lokus primer mikrosatelit
Analisis PAUP ver. 4b.10 (1) Antar ortet
(2) Antara ortet dan klon-klon turunannya
Pohon filogenetik (dendogram) kemiripan genetik
Analisis korelasi tahap panen embrioid terhadap perubahan alel
Nilai korelasi antara tahap panen embrioid terhadap perubahan alel
3.4 Isolasi DNA
DNA genom diisolasi menggunakan metode kit GenElute (Meloscia et al.
2001). Sebanyak 100 mg daun sawit digerus dengan bantuan Nitrogen cair dalam mortar, sampai menjadi bubuk halus. Bubuk sampel dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL yang telah diisi 350 µ L larutan lisis A dan 50 µL lisis B, kemudian divorteks. Campuran diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit, kemudian ditambahkan 130 µ L larutan PPT dan divorteks, kemudian diinkubasi pada suhu - 20°C selama 5 menit.
Campuran disentrifugasi pada kecepatan 14.000 x g selama 5 menit untuk memperoleh supernatan. Supernatan dipindahkan ke dalam kolom biru dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 x g selama 1 menit. Kolom biru dibuang, sedangkan supernatan ditambahkan 700 µL binding solution kemudian divorteks.
Kolom merah digunakan untuk mengikat DNA dalam membran. Sebanyak 500 µL column preparation solution ditambahkan ke dalam tabung merah, kemudian disentrifugasi pada 12.000 x g selama 30 menit. Selanjutnya larutan bagian bawah dibuang. Sebanyak 700 µL campuran DNA dimasukkan ke dalam kolom merah dan disentrifugasi pada 14.000 x g selama 1 menit. Kegiatan ini diulangi sampai campuran DNA dan binding solution habis. Pada tahap ini dihasilkan DNA yang terikat pada membran kolom merah.
Kolom merah kemudian dibilas dengan menambahkan 500 µ L wash solution dan disentrifugasi pada 14.000 x g selama 1 menit. Pembilasan diulangi dengan menambahkan 500 µ L wash solution dan disentrifugasi pada 14.000 x g selama 3 menit. Kolom merah yang sudah dibilas dipindahkan dalam tabung mikro 2 mL yang baru. DNA yang terikat pada membran dilarutkan dengan menambahkan 100 µL larutan TE hangat dan disentrifugasi pada 14.000 x g selama 1 menit. Kegiatan melarutkan DNA dengan TEdilakukan sebanyak 2 kali, sehingga volume akhir larutan DNA yang di peroleh sebanyak 200 µL.
Kualitas DNA hasil isolasi diuji dengan elektroforesis gel agarosa 0.8% dalam larutan bufer TAE 1x. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,32 g agarosa serbuk di dalam 40 mL TAE 1x. Selanjutnya campuran dipanaskan agar agarosa larut sempurna. Larutan agarosa dituang ke dalam cetakan yang telah
dipasangkan sisir. Setelah membeku, gel agarosa dimasukkan ke dalam alat elektroforesis yang telah berisi larutan bufer TAE 1x. Sebanyak 5 µL larutan DNA dicampur dengan 1 µ L 6x loading dye, dihomogenkan dengan bantuan mikropipet, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesis dilakukan selama 30 menit pada 100 volt. Pewarnaan dilakukan dengan cara merendam gel agarosa dalam larutan ethidium bromida (50 µL/L) selama 10 menit, kemudian dibilas dengan merendam gel agarosa dalam akuades selama 10 menit. Hasil elektroforesis dilihat dan sidokumentasi menggunakan alat Gel doc Universal Hood (Biorad).
Konsentrasi DNA hasil isolasi diuji dengan Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). Larutan yang digunakan sebagai blank dalam mengukur konsentrasi DNA hasil isolasi adalah larutan yang sama yang digunakan sebagai pelarut DNA, yaitu elute solution (TE) dari GenElute kit. Sebanyak 1 µL TE diteteskan pada bagian pedestal (bagian dari alat tempat meletakkan sampel). Konsentrasi DNA akan muncul dalam satuan ng/µL.
3.5 Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA dilakukan terhadap seluruh sampel dengan 14 pasang primer mikrosatelit (Tabel 3, Lampiran 1). Amplifikasi DNA menggunakan volume larutan 15 µL yang mengandung 1x larutan bufer PCR, 0.3 mM untuk setiap primer, 100 µM dNTP mix, 1.5 unit enzim Taq polimerase, 2.5 mM larutan MgCl2, 2µ L DNA sampel 10 ng/µL, dan ddH2O sebagai penyesuai volume. Campuran dimasukkan dalam tabung mikro PCR 0.2 mL, kemudian ditambahkan setetes mineral oil. Amplifikasi DNA dilakukan dengan mesin PCR Thermal CyclerVeriti 96 well (Applied Biosystem) dengan denaturasi awal 95°C selama 1 menit, denaturasi pada 94°C selama 30 detik, penempelan primer pada 51°C selama 60 detik, perpanjangan awal pada 72°C selama 120 detik untuk 35 siklus. Perpanjangan akhir dilakukan pada 72°C selama 8 menit.
3.6 Elektroforesis DNA Hasil Amplifikasi
Elektroforesis dilakukan menggunakan QIAxcel Sistem. Prinsip pemisahan QIAxcel dilakukan dalam kapiler cartridge gel, dimana setiap sampel otomatis masuk di dalam kapiler. DNA yang bermuatan negatif bermigrasi melalui kapiler ke ujung bermuatan positif melewati detektor yang mendeteksi dan mengukur sinyal serta mengubah sinyal emisi ke data elektronik yang kemudian ditampilkan sebagai gambar gel (Gambar 4).
Alat QIAxcel dan komputer yang akan digunakan dihidupkan, kemudian memasukkan QX alignment marker ke dalam tray alat. Sampel hasil amplifikasi dalam tabung mikro PCR 0.2 mL atau plate 96 well diletakkan dalam sampel tray alat. Pada tampilan “Instrumen Control” memerlukan beberapa informasi yang
perlu diisi. Proses elektroforesis akan dimulai setelah mengklik “Run”. Hasil dari elektroforesis dengan alat QIAxcel diperoleh elektrogram dan hasil amplifikasi ditampilkan dalam gambar gel.