TINJAUAN PUSTAKA
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada proses amplifikasi dengan kit platinum dari Invitrogen, yaitu memerlukan bahan-bahan seperti promotor gen LEAFY, primer
forward spesifik (promLFY F349, promLFY F702, dan promLFY F1041), primer promTcLFY reverse, larutan bufer, MgCl2, dNTPs, Taq polimerase, dan molecular water. Bahan yang digunakan pada proses
rekombinasi dengan sistem
Gateway®Technology yakni BP dan LR Recombination Reaction Protocol (Kit Invitrogen). Proses BP rekombinasi memerlukan bahan-bahan seperti bufer TE 1x pH 8, insert berupa hasil elusi,
pDONR™vektor, dan 5X BP
Clonase™bufer reaksi. Bahan-bahan yang digunakan pada proses LR rekombinasi adalah bufer TE 1x pH 8, klon entri, vektor destinasi khusus promotor gen, dan 5X LR
Clonase™bufer reaksi.
Bahan-bahan yang digunakan dalam elektroforesis yaitu gel agarosa (Sigma), bufer tris-borate-EDTA (TBE) 0.5x, Etidium bromida (EtBr) 5 µg/100ml, loading buffer
(Bromfenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker DNA 1 kb plus ladder (Invitrogen). Tahapan transformasi ke dalam sel kompeten memerlukan bahan media Luria Bertani (LB) agar yang sudah ditambahkan kanamisin 50 ppm, 1 µL proteinase K, dan
sel kompeten Escherichia coli galur XL-1 Blue. Tahap transformasi ke dalam
Agrobacterium tumefaciens membutuhkan media Luria Bertani (LB) agar yang sudah ditambah kanamisin 50 ppm dan rimfapisin 50 ppm, media yeast extract pepton (YEP), dan sel kompeten A. tumefaciens galur AGLO. Tahap konfirmasi dengan PCR koloni setelah reaksi BP, bahan yang dibutuhkan adalah larutan bufer, MgCl2, dNTPs, Taq polimerase, primer M13
Forward, primer M13 Reverse, dan
molecular water.
Alat yang digunakan untuk elektroforesis adalah sisir dan cetakan agar, bak elektroforesis, mikropipet, tabung mikro,
mircowave, adaptor 100 Volt, transluminator ultraviolet (UV) T2201 (Sigma), dan gel documenter. Selain itu alat yang digunakan adalah mesin PCR (ESCO Swift max), DNA
speed vacum 110 savant, inkubator bergoyang (shaker incubator), laminar air flow cabinet, segitiga penyebar, pinset, pisau skalpel, autoklaf, Eppendorf sentrifus 5417R, neraca analitik, dan peralatan-peralatan gelas seperti cawan petri, gelas piala, labu Erlenmeyer, labu takar, dan gelas ukur.
Metode
Amplifikasi promotor Gen LEAFY dengan Primer Spesifik Gateway
Amplifikasi promotor gen LEAFY
menggunakan kit dari Invitrogen (Platinum® Taq DNA Polymerase). Amplifikasi tiga ukuran promotor gen
LEAFY menggunakan tiga pasang primer spesifik gateway yang berbeda yaitu,
Gateway promLFY F1041 dan Gateway
promTcLFY R; Gateway promLFY F702 dan Gateway promTcLFY R; dan Gateway
promLFY F349 dan Gateway promTcLFY R. Proses amplifikasi dimulai dengan menyiapkan campuran reaksi yang terdiri atas 2.5 µL bufer, 1 µL MgCl2, 1 µL dNTPs, 0.2 µL Taq polimerase, dan 14.3 µL
molecular water. DNA cetakan (template) dimasukkan ke dalam tabung mikro sebanyak 1 µL. Reverse primer ditambahkan sebanyak 1 µL ke dalam tabung mikro kemudian ditambahkan pula sebanyak 1 µL
forward primer spesifik ke dalam masing-masing tabung.
Promotor gen LEAFY diamplifikasi pada mesin PCR sebanyak 35 siklus dengan program PCR sebagai berikut: predenaturasi pada suhu 94oC selama 7 menit, denaturasi pada suhu 94oC selama 45 detik,
penempelan primer (annealing) pada suhu 55oC selama 45 detik, pemanjangan primer (extension) pada suhu 72oC selama 2 menit, dan pascapemanjangan pada suhu 72oC selama 5 menit. Verifikasi produk PCR pada gel agarosa 1%.
Membuat Gel Agarosa Konsentrasi 1 % dan Elektroforesis Hasil Amplifikasi
Serbuk agarosa sebanyak 0.6 gram dilarutkan dalam 60 ml larutan TBE 0.5x. Larutan agarosa dipanaskan dalam
microwave sampai larut selama ± 120 detik. Larutan didiamkan sampai terasa hangat, kemudian ditambahkan larutan EtBr sebanyak 3 µL. Hal ini bertujuan agar EtBr tidak rusak karena panas. Larutan dituang ke dalam cetakan dan dibiarkan hingga mengeras membentuk gel. Gel agarosa yang telah mengeras digunakan untuk elektroforesis hasil amplifikasi.
Promotor gen yang telah diamplifikasi dengan metode PCR selanjutnya dielektroforesis untuk mengetahui hasil amplifikasi. Promotor gen hasil amplifikasi yang akan dielektroforesis dalam gel agarosa terlebih dahulu dicampurkan dengan loading buffer. Setelah dicampurkan dengan loading buffer kemudian campuran dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa dan dielektroforesis dengan tegangan 75 volt selama ± 1 jam.
Ekstraksi dan Pemurnian Promotor Gen
LEAFY
Elektroforegram positif ditunjukkan dengan adanya pita pada gel agarosa setelah diamati dengan transluminator UV. Proses ekstraksi dan purifikasi promotor gen
LEAFY dari gel menggunakan kit dari Invitrogen. Pita yang terang pada gel agarosa dipotong di bawah transluminator UV. Potongan gel tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro dan ditambahkan 3x volume solubilization bufer (L3). Potongan gel diinkubasi pada suhu 50oC selama 10 menit sampai gel tersebut larut dan diinkubasi kembali pada suhu ruang selama 5 menit. Setelah potongan gel larut kemudian dimasukkan ke dalam kolom (Quick Gel Extraction Column) yang berada di atas tube pencuci (Wash Tube) dan disentrifus 1 menit pada 12000 rpm dengan suhu ruang. Sebanyak 500 µL bufer pencuci (Wash buffer) ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifus 1 menit pada 12000 rpm, suhu ruang. Supernatan dibuang dan disentrifus dalam keadaan kosong pada
12000 rpm, 25oC selama 1 menit. Setelah itu, ditambahkan bufer elusi sebanyak 30 µL dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Larutan tersebut disentrifus kembali pada 12000 rpm, 25oC selama 2 menit. Hasil ekstraksi dan pemurnian gel dilihat dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Reaksi Rekombinasi BP dan LR Promotor Gen LEAFY dengan Sistem Gateway
Reaksi rekombinasi BP promotor gen
LEAFY dengan sistem gateway dimulai dengan menyiapkan bufer TE sebanyak 5 µL, 2 µL hasil elusi, dan vektor Donor (pDONRTM221) sebanyak 1 µL. Setelah itu, ditambahkan sebanyak 2 µL BP ClonaseTM II dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 250C. Setelah inkubasi selesai, ke dalam larutan ditambahkan sebanyak 2 µL Proteinase K dan diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 15 menit. Hasil rekombinasi promotor gen LEAFY pada vektor Donor (pDONR) kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten
E. coli untuk perbanyakkan plasmid yang telah membawa promotor gen LEAFY. Koloni bakteri E. coli yang tumbuh pada media LB agar yang mengandung antibiotik kanamisin dikonfirmasi dengan metode PCR koloni. Koloni bakteri rekombinan ditandai adanya pita setelah pengujian dengan metode PCR. Koloni bakteri rekombinan kemudian diisolasi DNA plasmidnya untuk direkombinasikan ke vektor destinasi (pDEST).
Reaksi rekombinasi LR, sebanyak 5 µL bufer TE, 2 µL hasil BP reaksi (klon entri), dan vektor destinasi (pDEST) sebanyak 1 µL. Setelah itu, ditambahkan sebanyak 2 µL LR ClonaseTM II dan diinkbuasi selama 2 jam pada suhu 250C. Setelah inkubasi selesai, ke dalam larutan ditambahkan sebanyak 2 µL Proteinase K dan diinkubasi lagi pada suhu 370C selama 15 menit. Hasil rekombianasi pada vektor destinasi kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli. Koloni bakteri yang tumbuh diisolasi DNA plasmid dan selanjutnya dikonfirmasi dengan metode PCR Koloni. Plasmid rekombinan selanjutnya ditransformasikan ke A. tumefaciens galur AGL-O.
Transformasi Promotor Gen LEAFY ke Escherichia coli
Sebanyak 5 µL hasil rekombinasi BP dan LR ditransformasikan ke dalam 200 µL sel kompeten E. coli XL-1 Blue dan dikocok
perlahan hingga tercampur rata kemudian diinkubasi di dalam es selama 30 menit. Larutan hasil rekombinasi dan sel kompeten diberi kejut panas (heat shock) pada suhu 42oC selama 50 detik yang selanjutnya segera dimasukkan ke dalam es selama 10 menit. Ke dalam larutan hasil rekombinasi dan sel kompeten ditambahkan 800 µL Luria Bertani (LB) + glukosa 20 mM kemudian diinkubasi di dalam shaker incubator selama 1.5 jam pada suhu 37oC dengan kecepatan 150 rpm. Campuran tersebut diambil sebanyak 100 µL (1/10 volume) untuk ditumbuhkan dalam media LB agar yang terdiri atas tripton 10 g/l, yeast extract 5 g/l, NaCl 5 g/l, dan bakto agar 15 g/l. Sisanya sebanyak 9/10 volume disentrifus pada 3500 rpm, 25oC selama 5 menit. Supernatan dibuang ± 800 µL sedangkan sisa supernatan 100 µL dan pelet diresuspensi kemudian ditumbuhkan dalam media LB agar yang mengandung antibiotik kanamisin 50 ppm dan meratakannya dengan segitiga penyebar steril. Media diinkubasi dalam kondisi 37oC selama 16-20 jam kemudian dilihat koloni yang tumbuh.
Konfirmasi Koloni Transforman dengan Teknik PCR Koloni
Koloni yang tumbuh dipindahkan ke dalam media LB agar yang baru untuk membuat duplikat koloni. Setelah proses duplikasi, koloni yang tumbuh juga dipindahkan ke dalam tabung mikro yang berisi molecular water (MW) untuk persiapan PCR koloni. Pemindahan koloni dilakukan secara steril dalam laminar air flow cabinet. PCR koloni setelah reaksi rekombinasi BP dilakukan dengan menyiapkan komponen mix yang terdiri atas, 2.75 µL molecular water (MW), 1.5 µL
buffer complete, 0.3 µL dNTP’s, 0.15 µL
M13F, 0.15 µL M13R, dan 0.15 µL taq polymerase.
PCR koloni setelah reaksi rekombinasi LR dilakukan dengan menyiapkan komponen mix yang terdiri atas, 2.75 µL
molecular water (MW), 1.5 µL buffer complete, 0.3 µL dNTP’s, 0.15 µL masing -masing primer forward spesifik gateway
yang berbeda yaitu, Gateway promLFY F1041, Gateway promLFY F702, Gateway
promLFY F349, 0.15 µL masing-masing primer Gateway promTcLFY R, dan 0.15 µL taq polymerase. Tahap pertama PCR adalah program lisis 96oC selama 5 menit, 50oC selama 1 menit 30 detik, 96oC selama 1 menit 30 detik, 45oC selama 1 menit 30
detik, 96oC selama 1 menit, 40oC selama 1 menit. Program dihentikan sejenak untuk penambahan sebanyak 5 µL komponen mix
ke dalam masing-masing tabung. Kemudian program PCR dilanjutkan kembali dengan program PCR yakni, 94oC selama 30 detik, 45oC selama 1 menit, 72oC selama 2 menit. Setelah perbanyakan koloni transforman dengan teknik PCR selesai kemudian pengujian dengan elektroforesis gel agarosa 1 %.
Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas)
Isolasi DNA plasmid dilakukan berdasarkan hasil PCR koloni yang diketahui mengandung plasmid terinsersi fragmen yang diinginkan. Plasmid diisolasi dengan Fermentas GeneJet Plasmid Miniprep Kit. Sampel yang positif mengandung plasmid terinsersi disentrifus 12000 rpm terlebih dahulu. Pelet dihomogenisasi dengan penambahan 250 µL
resuspension solution. Setelah itu, ditambahkan 250 µL lisis solution, 350 µL
neutralization solution, dan setiap penambahan larutan dalam tabung dibolak-balik sebanyak 6x, kemudian disentrifus selama 5 menit, 12000 rpm pada suhu ruang. Pengikatan DNA dilakukan dengan memindahkan supernatan ke dalam kolom dan disentrifus selama 1 menit. Kolom dicuci dengan 500 µL wash solution dan disentrifus selama 1 menit (dilakukan sebanyak 2x). Kolom dalam keadaan kosong disentrifus kembali selama 1 menit. Kolom dipindahkan ke dalam tabung mikro baru dan ditambahkan 30 µL elution buffer tepat di tengah membran kolom. Setelah itu, diinkubasi selama 2 menit dan disentrifus kembali selama 2 menit. Hasil isolasi DNA plasmid diverifikasi dengan visualisasi elektroforesis gel agarosa 1%.
Transformasi ke dalam Agrobacterium
tumefaciens galur AGL-O
Sejumlah 10 µL DNA plasmid dimasukkan ke dalam A. tumefaciens stain AGL-O, didiamkan di dalam es selama 15 menit. Selanjutnya diinkubasi kembali di dalam N2 cair selama 5 menit dan pada suhu 37oC selama 5 menit. Sejumlah 1 ml YEP (Yeast Exctract Pepton) ditambahkan ke dalamnya dan dikocok selama 3 jam pada suhu 28oC. Larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 3 menit.
Sejumlah 100 µL supernatan diresuspensi dengan pelet yang terbentuk,
dipipet, dan dimasukkan ke dalam media LB yang telah diberi antibiotik kanamisin 50 ppm dan rimfapisin 50 ppm. Inkubasi dilakukan selama 2 hari pada suhu 28oC dan dalam kondisi gelap. Hasil yang diperoleh dikonfirmasi dengan PCR koloni dan isolasi plasmid. Setelah itu, promotor gen LEAFY
siap untuk dintransformasikan ke tanaman melalui A. tumefaciens.