Hasil Amplifikasi Promotor Gen LEAFY dengan Tiga Primer Spesifik Gateway
Tahap pertama yang dilakukan dalam percobaan untuk mengkonstruksi promotor gen LEAFY ke dalam vektor ekspresi adalah dengan mendesain tiga buah primer gateway
yang spesifik. Primer tersebut disusun berdasarkan perancangan primer pada sistem
gateway yang didasarkan pada sekuen promotor gen LEAFY yang telah berhasil diisolasi dari daun kakao dengan metode
Genome Walking™ pada penelitian sebelumnya. Ukuran promotor gen LEAFY
yang diperoleh adalah 1650 pb (Santoso 2010). Dari ukuran 1650 pb, akan dibagi kembali ke dalam tiga ukuran yang berbeda melalui amplifikasi promotor gen LEAFY
dengan primer gateway yang spesifik, yaitu
Gateway F1041, Gateway F702, Gateway
F349, dan satu buah primer reverse
(promTcLFY R). Primer tersebut dirancang berdasarkan aturan perancangan sistem
gateway. Empat basa nukleotida GGGG diikuti situs attB kemudian ditambahkan 18-25 urutan basa nukleotida spesifik promotor gen LEAFY (Invitrogen 2010). Situs attB ini disebut sebagai tempat pengikatan lamda (lamda attachment site) yaitu tempat integrasi DNA lamda ke dalam kromosom
E. coli yang terletak di antara operon gal dan operon biotin (Yuwono 2005).
Pemilihan tiga ukuran yang akan dikonstruksi (1041 pb, 702 pb, dan 349 pb) didasarkan pada pencarian panjang ukuran promotor yang efektif dapat mengekspresikan gen. Pencarian tersebut dilakukan dengan pengujian pada beberapa ukuran promotor gen LEAFY. Pengujian ukuran yang diharapkan adalah ½ panjang promotor gen LEAFY (± 825 pb), ½ dari panjang promotor 825 pb (± 415 pb), dan ½ dari panjang promotor 415 (± 210 pb). Namun, setelah dirancang dengan ketentuan aturan sistem gateway, diperoleh primer yang dapat menempel pada proses
amplifikasi promotor gen LEAFY yang berukuran 1650 pb menjadi 1041 pb, 702 pb, dan 349 pb.
Amplifikasi promotor gen LEAFY
dengan metode PCR bertujuan menggandakan promotor gen tersebut secara
in vitro. Hasil amplifikasi tiga ukuran promotor gen LEAFY dengan primer spesifik
gateway kemudian dielektroforesis dengan konsentrasi gel agarosa 1%. Prinsip elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatannya. DNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah kutub positif selama elektroforesis karena adanya gugus fosfat. Fragmen DNA mempunyai muatan negatif yang sama untuk tiap-tiap ukuran panjang, sehingga pergerakan DNA ini akan memiliki kecepatan yang sama untuk mencapai kutub positif. Pergerakan yang sama antar molekul DNA ini tidak akan dapat digunakan untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya. Hal inilah yang menyebabkan digunakannya gel untuk memperlambat pergerakan DNA. Gel yang digunakan adalah agarosa yang berasal dari ekstrak rumput laut yang telah dimurnikan. Marka atau penanda yang digunakan pada proses running merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda yang digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel (Clark & Christopher 2008). Hasil pengujian dengan elektroforesis agarosa menunjukkan pita berukuran sekitar 1041 pb, 702 pb, dan 349 pb (Gambar 7).
Gambar 7 Elektroforegram amplikon promotor gen LEAFY dengan primer Gateway yang spesifik; (M) marker 1 kb plus DNA Lader, (a)
promotor gen LEAFY
berukuran 702 pb, (b) ukuran 1041 pb, (c) ukuran 349 pb.
Ketiga pita tersebut menunjukkan bahwa primer gateway yang dirancang sudah benar. Hal ini didasarkan pada hasil amplifikasi yang sesuai dengan ukuran yang diharapkan yaitu 1041 pb, 702 pb, dan 349 pb. Promotor gen LEAFY yang telah teramplifikasi selanjutnya diekstraksi dan dimurnikan.
Hasil Ekstraksi dan Pemurnian Promotor
Gen LEAFY dari Gel Agarosa
Pita yang terang pada gel agarosa dipotong dengan pisau scalpel di bawah transluminator UV, kemudian dilanjutkan proses ekstraksi dan pemurnian. Ekstrasi dan pemurnian bertujuan untuk memurnikan DNA dari berbagai pengotor yang tidak diinginkan seperti protein dan RNA. Ukuran pita DNA hasil ekstraksi dan pemurnian sama dengan ukuran pita setelah amplifikasi karena proses esktraksi dan pemurnian hanya menghilangkan pengotor yang ada pada DNA. Hasil ekstraksi dan pemurnian divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1 % dan diperoleh pita berukuran 1041 pb, 702 pb, dan 349 pb (Gambar 8). Ukuran pita yang diperoleh sama dengan hasil amplifikasi, sehingga proses ekstraksi dan pemurnian sudah berhasil dilakukan. Hasil ekstraksi dan pemurnian ini kemudian direkombinasikan ke dalam vektor donor menggunakan sistem gateway.
Gambar 8 Elektroforegram ekstraksi dan pemurnian promotor gen
LEAFY dari gel; (a) promotor gen LEAFY berukuran 1041 pb, (b) ukuran 702 pb, (c) ukuran 349 pb, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.
Hasil Reaksi Rekombinasi BP dan LR Promotor Gen LEAFY dengan Sistem Gateway
Pengklonan bertujuan memperbanyak DNA yang tersisip pada sel kompeten (E.coli). Tahapan pengklonan pada sistem
gateway pada dasarnya bergantung pada dua
reaksi, yaitu BP rekombinasi dan LR rekombinasi. Hasil ekstraksi dan pemurnian (elusi) sebanyak 2 µL dicampurkan dengan 1 µL vektor donor (pDONRTM221) melalui reaksi BP. Reaksi BP adalah upaya menyisipkan hasil elusi (fragmen promotor gen LEAFY) ke dalam vektor donor. Promotor gen LEAFY hasil amplifikasi yang memiliki situs attB1 dan attB2 akan direaksikan dengan vektor donor (pDONRTM221) yang memiliki situs attP1 dan situs attP2 sebagai tempat rekombinasi. Adanya situs untuk rekombinasi ini menyebabkan kemungkinan tidak adanya kesalahan orientasi gen yang direkombinasikan. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim campuran BP klonase yang memindahkan DNA sisipan ke dalam vektor donor yang menghasilkan suatu klon entri (pENTR) dan diikat oleh dua situs attL. Reaksi BP pada sistem gateway dapat dilihat pada lampiran 4. Setelah BP rekombinasi, selanjutnya di transformasikan ke dalam sel kompeten E. coli galur XL1-Blue. Sel kompeten adalah sel yang mampu menyerap DNA karena telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia. Sel dapat dibuat kompeten dengan perlakuan garam CaCl2, LiCl2, atau RbCl2 (Howe 1995). Garam CaCl2 dapat meningkatkan porositas dinding sel sehingga afinitas sel terhadap DNA juga meningkat.
Hasil rekombinasi promotor gen LEAFY
pada vektor donor (pDONRTM221) kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli galur XL-1 Blue dengan perlakuan kejut panas (heat shock). Heat Shock menyebabkan pori membran sel terbuka dan protein Hsp (heat shock protein) aktif. Kejut panas yang diberikan menyebabkan membran sel kompeten menjadi permeabel terhadap molekul asing sehingga memudahkan plasmid rekombinan masuk ke dalam E. coli. Bakteri E. coli
merupakan bakteri yang paling sering digunakan sebagai inang dalam kloning gen baik sebagai sel inang sementara maupun sel inang tetap. Bakteri ini dipilih karena sifat-sifat fisiologi dan genetika jasad ini telah banyak diketahui. Selain itu, pertumbuhan
E. coli cepat dan mudah (Brown 2000). Hasil transformasi ditumbuhkan pada media LB agar yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm. Penambahan antibiotik kanamisin dilakukan karena vektor donor yang digunakan mempunyai marka seleksi yang resisten terhadap antibiotik tersebut. Peta marka seleksi vektor donor pDONRTM221 dapat dilihat pada
Lampiran 3. Koloni yang tumbuh dengan sistem pengklonan gateway semuanya berwarna putih (Gambar 9). Koloni yang diduplikasi setelah reaksi BP sebanyak 10 koloni dari setiap cawan petri. Koloni putih yang tumbuh pada media seleksi diduga kuat klon entri yang membawa promotor gen
LEAFY, sedangkan by product yang tersisipi ccdB akan mati dan tidak tumbuh sebagai koloni putih. Koloni berwarna putih yang tumbuh diduplikasi dan dikultur untuk memperbanyak jumlah plasmid rekombinan. Selanjutnya koloni hasil duplikasi yang tumbuh diambil dengan menggunakan tusuk gigi steril untuk PCR koloni.
Plasmid rekombinan yang telah diikat oleh situs attL1 dan attL2 direkombinasikan ke dalam vektor destinasi yang membawa situs attR1 dan attR2. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim campuran LR klonase sehingga dalam sistem gateway reaksi rekombinasi ini disebut reaksi LR (LR reaction). Mekanisme reaksi LR dapat dilihat pada Lampiran 5. Vektor destinasi yang telah tersisipi promotor gen LEAFY (klon ekspresi) ditransformasikan ke E. coli galur XL-1 Blue.
Gambar 9 Koloni yang tumbuh setelah reaksi BP pada promotor gen
LEAFY yang berukuran (a) 349 pb, (b) 702 pb, (c) 1041 pb.
Hasil rekombinasi ke dalam vektor destinasi yang ditransformasikan ke sel kompeten E. coli galur XL-1 Blue ditumbuhkan pada media LB agar. Ke dalam media tersebut ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm. Hal ini dikarenakan pada vektor destinasi mengandung marka seleksi resisten terhadap antibiotik tersebut sehingga seleksi transforman dilakukan
dengan melihat koloni yang dapat tumbuh pada media tersebut. Koloni putih yang tumbuh setelah reaksi LR lebih sedikit jumlahnya dibandingkan dengan koloni yang tumbuh setelah reaksi BP. Setelah reaksi LR, pada cawan petri promotor gen
LEAFY ukuran 349 pb hanya 3 koloni, pada 702 pb sebanyak 5 koloni, dan pada 1041 pb sebanyak 4 koloni yang diduplikasi dan di PCR koloni. Hal ini terjadi karena koloni rekombinan telah mengalami penyeleksian pada tahap sebelumnya (Gambar 10). Koloni putih yang tumbuh pada media LB agar setelah reaksi LR juga diduplikasi untuk menyimpan duplikat koloni yang telah membawa fragmen promotor gen sisipan agar koloni tidak terkontaminasi dan menghindari terjadinya pertumbuhan bertumpuk (overgrowth) yang mengakibatkan koloni tidak tunggal lagi.
Gambar 10 Koloni yang tumbuh setelah reaksi LR pada promotor gen
LEAFY yang berukuran (a) 349 pb, (b) 702 pb, (c) 1041 pb.
Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi BP dengan Teknik PCR Koloni
Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke dalam E. coli dikonfirmasi dengan teknik PCR koloni untuk memastikan koloni tersebut mengandung plasmid rekombinan. Pengujian koloni yang mengandung plasmid rekombinan setelah reaksi BP dengan metode PCR koloni menggunakan sepasang primer universal M13. Penggunaan primer ini karena pada peta pDONRTM221 terlihat bahwa amplifikasi dengan PCR koloni memerlukan primer M13 Forward dan M13 Reverse
setelah reaksi BP pada promotor gen LEAFY
yang berukuran 349 menunjukkan bahwa hanya tujuh dari sepuluh koloni yang diujikan mengandung promotor gen LEAFY. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita berukuran sekitar 349 pb setelah elektroforesis (Gambar 11). Berbeda dengan hasil PCR koloni pada promotor berukuran 702 pb, dari sepuluh koloni hanya tiga koloni yang positif (Gambar 12), sedangkan promotor yang berukuran 1041 pb, dari sepuluh koloni hanya dua koloni yang positif mengandung promotor gen LEAFY
ukuran 1041 pb (Gambar 13).
Gambar 11 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi promotor gen
LEAFY ukuran 349 pb pada vektor donor; (1-10) koloni bakteri, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.
Gambar 12 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi promotor gen
LEAFY ukuran 702 pb pada vektor donor; (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (1-10) koloni bakteri.
Gambar 13 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi promotor gen
LEAFY ukuran 1041 pb pada vektor donor; (1-10) koloni bakteri, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.
Keberhasilan proses PCR koloni dapat diamati dari ukuran klon transforman. Ukuran pita yang ditunjukkan ketiga gambar hasil PCR koloni menunjukkan ukuran sekitar 349 pb, 702 pb, dan 1041 pb, maka dapat dipastikan bahwa proses penyisipan fragmen promotor gen LEAFY sudah berhasil dilakukan ke dalam vektor donor (pDONRTM221). Koloni yang positif sudah tersisip fragmen promotor gen LEAFY
dikultur dalam media LB cair yang mengandung kanamisin 50 ppm untuk perbanyakkan koloninya, setelah itu dilakukan proses isolasi plasmid rekombinan untuk konfirmasi penyisipan fragmen promoter gen pada vektor donor. Media Luria Bertani (LB) cair sebagai sumber nutrisi untuk membantu pertumbuhan bakteri. Media LB merupakan media kompleks yang terdiri atas tripton, ekstrak khamir, dan NaCl. Tripton berfungsi menyediakan asam amino dan peptida pendek sedangkan ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen, gula, dan nutrisi organik maupun anorganik.
Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi BP dengan Teknik Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas)
Hasil kultur bakteri yang ditumbuhkan dari media LB cair kemudian diisolasi DNA plasmidnya untuk rekombinasi ke vektor destinasi. Isolasi DNA plasmid dilakukan berdasarkan hasil PCR DNA koloni yang diketahui mengandung plasmid terinsersi fragmen yang diinginkan. Plasmid diisolasi dengan Fermentas GeneJet Plasmid Miniprep Kit. Hasil isolasi DNA plasmid dielektroforesis pada gel agarosa 1% sehingga dapat diamati pita-pita DNA-nya.
M1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10M
Elektroforegram menunjukkan bahwa pita berada sekitar 5110 pb, 5463 pb, dan 5802 pb (Gambar 14). Elektroforegram ini menunjukkan ukuran promotor gen sisipan ditambah dengan ukuran vektor donor (pDONRTM221) sebesar 4761 pb yang berada pada plasmid rekombinan. Fragmen promotor gen LEAFY yang berukuran 349 pb ditambah dengan ukuran vektor pDONRTM221 sebesar 4761 pb sehingga ukuran plasmid rekombinan menjadi sekitar 5110 pb, fragmen promotor gen LEAFY
ukuran 702 pb ditambah ukuran pDONRTM221 menjadi sekitar 5463 pb, dan pada fragmen ukuran 1041 pb ditambah ukuran vektor donor diperoleh plasmid rekombinan sekitar 5802 pb. Isolasi plasmid rekombinan dari ketiga koloni telah berhasil dilakukan. Hal ini dibuktikan dengan terlihat pita pada ukuran yang sudah sesuai dengan teori perhitungan plasmid rekombinan. Hasil positif dari konfirmasi dengan isolasi DNA plasmid rekombinan menunjukkan bahwa proses transformasi ke dalam E.coli telah berhasil dilakukan dengan baik.
Gambar 14 Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan setelah reaksi BP; (1) plasmid rekombian berukuran sekitar 5110 pb, (2) ukuran sekitar 5463 pb, (3) ukuran sekitar 5802 pb, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.
Isolasi DNA plamid dengan kit ini, pada prinsipnya sama dengan pemisahan plasmid berdasarkan ukuran. Proses pemisahan plasmid berdasarkan ukuran dimulai dengan pembuatan ekstrak sel. Jika sel dipecah secara perlahan pada kondisi terkendali DNA kromosom yang putus hanya sebagian kecil, sehingga fragmen DNA kromosom berukuran jauh lebih besar dari ukuran plasmid dan dapat dipisahkan dari plasmid dengan cara mengendapkan DNA kromosom bersama serpihan sel (debris) melalui sentrifugasi. Cara ini dapat meminimalkan kerusakan DNA kromosom
dan supernatan (larutan jernih) hasil sentrifugasi yang hampir seluruhnya mengandung DNA plasmid. DNA plasmid yang telah berhasil diisolasi selanjutnya direkombinasikan ke dalam vektor destinasi khusus untuk promotor, yaitu vektor destinasi yang memiliki marka gen.
Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi LR dengan Teknik PCR Koloni
PCR koloni dapat mengkonfirmasi sel transforman yang sudah tersisipi DNA rekombinan. Melalui tahapan ini, promotor gen LEAFY yang disisipkan ke dalam vektor destinasi diamplifikasi menggunakan primer spesifik. Program PCR koloni yang terlebih dahulu harus dilakukan adalah program lisis sel yang diawali dengan pemanasan pada suhu 96oC selama 5 menit, 50oC selama 1 menit 30 detik, 96oC selama 1 menit 30 detik, 45oC selama 1 menit 30 detik, 96oC selama 1 menit, dan 40oC selama 1 menit. Program lisis sel E. coli dilakukan untuk memecah sel sehingga DNA sel transforman dapat digunakan dalam proses PCR untuk konfirmasi sel transforman. Setelah program lisis dihentikan, komponen mix ditambahkan ke dalam masing-masing tabung. Kemudian program PCR dilanjutkan kembali dengan program PCR yaitu, 94oC selama 30 detik, 45oC selama 1 menit, 72oC selama 2 menit. Hasil visualisasi PCR koloni dapat dilihat dengan elektroforesis gel agarosa 1 %.
Elektroforegram PCR koloni setelah reaksi LR pada promotor gen LEAFY yang berukuran 349 menunjukkan bahwa dari tiga koloni yang diujikan, semua koloni mengandung promotor gen LEAFY ukuran tersebut. Hal ini ditunjukkan dengan pita yang terang pada ukuran sekitar 349 pb (Gambar 15). Lima koloni hasil transformasi pada promotor gen LEAFY ukuran 702 pb diambil untuk diuji, sedangkan promotor gen LEAFY ukuran 1041 diambil empat koloni untuk diuji. Dari semua koloni yang diuji pada ukuran 702 pb, semua koloni menunjukkan hasil positif dengan pita yang menunjukkan ukuran yang sama, yaitu 702 pb (Gambar 16). Elektroforegram pada promotor gen LEAFY ukuran 1041 pun menunjukkan hasil positif, yaitu pita berada pada ukuran sekitar 1041 pb (Gambar 17). Keseluruhan dari semua koloni yang diuji menunjukkan hasil positif, maka dapat dipastikan bahwa proses penyisipan fragmen promotor gen LEAFY sudah berhasil dilakukan ke dalam vektor destinasi.
Gambar 15 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi promotor gen
LEAFY ukuran 349 pb pada vektor destinasi; (1-3) koloni bakteri, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.
Gambar 16 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi promotor gen
LEAFY ukuran 702 pb pada vektor destinasi; (1-5) koloni bakteri, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.
Gambar 17 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi promotor gen
LEAFY ukuran 1041 pb pada vektor destinasi; (1-4) koloni bakteri, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.
Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi LR dengan Teknik Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas)
Koloni E. coli yang positif mengandung sisipan promotor gen LEAFY, selanjutnya dikonfirmasi kembali dengan teknik isolasi DNA plasmid rekombinan. Secara umum, isolasi plasmid mirip dengan isolasi DNA total, yaitu melibatkan proses pembiakan sel pembawa plasmid, pemanenan sel, pembuatan ekstrak sel, penghilangan protein dan RNA, dan pemekatan DNA dengan presipitasi etanol. Pembiakan sel pembawa plasmid rekombinan dilakukan dengan membiakkannya dalam media LB cair yang sudah ditambahkan antobiotik kanamisin 50 ppm. Penambahan antibiotik kanamisin 50 ppm dilakukan untuk menyeleksi koloni transforman, maka hanya koloni yang mengandung DNA rekombinan yang akan tumbuh dan dapat dibiakkan. Pembiakan sel dilakukan dalam inkubator bergoyang dengan suhu 37oC selama 16 jam. Hasil dari proses pembiakkan, yaitu larutan dalam botol yang diinkubasi dan dikocok menjadi keruh. Setelah inkubasi, dilakukan pemanenan sel untuk selanjutnya diisolasi DNA plasmidnya. Pemanenan bakteri dilakukan secara steril di dalam laminar air flow cabinet. Sebanyak 1-5 ml E. coli hasil pemanenan siap diisolasi DNA plasmid.
Isolasi DNA plasmid rekombinan setelah reaksi LR dengan menggunakan kit dari Fermentas. Elektroforegram DNA plasmid menunjukkan pita berukuran sekitar 7310 pb, 7663 pb, dan 8002 pb (Gambar 18). Ukuran ini menunjukkan ukuran promotor gen sisipan (349 pb, 702 pb, dan 1041 pb) ditambah dengan ukuran vektor destinasi khusus promotor (pDEST) yang berukuran 6961 pb. Penambahan ukuran fragmen promotor gen LEAFY 349 ditambah dengan 6961 pb ukuran vektor menghasilkan plasmid rekombinan sebesar 7310 pb. Perhitungan pada promotor gen LEAFY
ukuran 702 pb dan 1041 pb juga sudah sesuai dengan teori, yaitu 702 pb ditambah dengan 6961 pb menjadi 7663 pb dan 1041 ditambah dengan vektor menjadi 8002 pb. Hasil visualisasi isolasi plasmid menunjukkan bahwa proses isolasi plasmid rekombinan dari ketiga koloni yang mengandung DNA rekombinan telah berhasil dilakukan. Hasil positif dari konfirmasi dengan isolasi DNA plasmid rekombinan menunjukkan bahwa proses transformasi ke dalam sel kompeten E.coli
telah berhasil dilakukan dengan baik.
M 1 2 3 4 1 2 3 4 5 M 1 2 3 M
Gambar 18 Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan setelah reaksi LR; (1) plasmid rekombian berukuran sekitar 7310 pb, (2) ukuran sekitar 7663 pb, (3) ukuran sekitar 8002 pb, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.
Hasil Transformasi Klon Ekspresi ke dalam Agrobacterium tumefaciens Galur AGL-O
Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) bertujuan untuk menguji ekspresi pengaruh promotor gen tersebut ke tanaman. Sel Agrobacterium
yang membawa plasmid rekombinan digunakan untuk menginfeksi protoplast tanaman. Penggunaan A. tumefaciens galur AGL-0 dikarenakan galur ini mempunyai virulensi yang tinggi dibandingkan galur
Agrobacterium lainnya. DNA plasmid setelah rekombinasi pada vektor destinasi diisolasi kemudian ditransformasikan ke dalam A. tumefaciens dengan metode kejut dingin. Hal ini dikarenakan terjadi lonjakan suhu es 0oC ke nitrogen cair yang bersuhu sekitar -196oC. Lonjakan suhu tersebut akan menjadikan membran sel Agrobacterium
menjadi tidak selektif terhadap molekul asing sehingga DNA sisipan dapat masuk. Hasil transformasi ke dalam A. tumefaciens
dapat dilihat setelah inkubasi selama ± 2 hari. Pada saat proses inkubasi, koloni dalam cawan petri dibungkus dengan kertas agar kondisi menjadi gelap. Hal ini dilakukan agar koloni A. tumefaciens dapat menyesuaikan kondisinya selama hidup di dalam tanah (akar). Koloni yang tersisipi oleh promotor gen LEAFY ukuran 349 pb hanya ada dua koloni, sedangkan koloni yang tersisipi oleh promotor ukuran 702 dan 1041 hanya satu koloni saja (Gambar 19).
Seleksi transforman yang sudah ditransformasikan ke dalam A. tumefaciens
dilakukan dengan cara menumbuhkannya di
dalam media LB agar yang mengandung antibiotik kanamisin 50 ppm dan rifampisin 50 ppm. Sel transforman akan tumbuh membentuk koloni berwarna putih. Antibiotik kanamisin digunakan karena vektor destinasi (pDEST) yang digunakan membawa marka seleksi berupa gen resistensi terhadap antobiotik kanamisin, sedangkan rifampisin digunakan untuk membunuh E. coli. Koloni yang tumbuh dimedia seleksi lebih sedikit (1 sampai 2 koloni) dibandingkan dengan koloni yang tumbuh saat transformasi ke E. coli (sepuluh koloni). Hal ini dikarenakan A. tumefaciens
memiliki jumlah salinan yang lebih sedikit (low copy number) dibandingkan E. coli.
Gambar 19 Koloni Agrobacterium tumefaciens yang tumbuh setelah reaksi LR pada promotor gen LEAFY
yang berukuran (a) 349 pb, (b) 702 pb, (c) 1041 pb.
Koloni yang tumbuh diisolasi DNA plasmidnya untuk menguji plasmid rekombinan yang sudah tersisipi di dalam koloni A. tumefaciens yang tumbuh tersebut. Hasil isolasi DNA plasmid menunjukkan pita yang terlihat berukuran sekitar 7310 pb, 7663 pb, dan 8002 pb (Gambar 20). Ukuran tersebut sama dengan ukuran hasil isolasi plasmid rekombinan setelah reaksi LR. Ukuran hasil isolasi DNA plasmid menunjukkan ukuran promotor gen sisipan (349 pb, 702 pb, dan 1041 pb) ditambah dengan ukuran vektor destinasi khusus promotor (pDEST) yang berukuran 6961 pb, oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa plasmid rekombinan di dalam vektor ekspresi dapat ditransformasikan ke dalam
A. tumefaciens dan siap ditransfer ke dalam tanaman.
Gambar 20 Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan setelah transformasi Agrobacterium tumefaciens; (1) plasmid rekombian berukuran sekitar 7310 pb, (2) sekitar 7663 pb, (3) sekitar 8002 pb, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Tiga ukuran promotor gen LEAFY, yaitu 349 pb, 702 pb, dan 1041 pb telah berhasil disisipkan pada vektor ekspresi dengan sistem gateway. Ukuran promotor gen
LEAFY pada plasmid rekombinan setelah reaksi BP sekitar 5110 pb, 5463 pb, dan 5802 pb. Setelah reaksi LR hasil isolasi DNA plasmid menunjukkan pita yang terlihat berukuran sekitar 7310 pb, 7663 pb, dan 8002 pb. DNA plasmid dalam vektor ekspresi telah berhasil ditransformasikan ke
Agrobacterium tumefaciens galur AGL-O dan siap ditransfer ke dalam tanaman.
Saran
Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui ekspresi promotor gen
LEAFY melalui tanaman tembakau sebagai tanaman model dengan menggunakan reporter gen seperti GUS (β-glukoronidase).
DAFTAR PUSTAKA
Alvim PT, AD Machado, F Vello. 1974.