DAFTAR GAMBAR
PEMBESARAN MINI-PANTLET MINIPLANTLET
3 INISIASI KALUS EMBRIOGENIK DENDROBIUM
3.2 Bahan dan Metode
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Rumah Kaca Anggrek Balai Penelitian Tanaman Hias Segunung, Pacet, Cianjur, mulai bulan Maret hingga Agustus 2013.
3.2.1 Bahan dan Alat
Bahan kimia yang digunakan ialah komponen media MS dan VW (Merck, Germany), zpt (TDZ, BA, NAA, dan Kinetin) (Phytotech, USA), gelrite (Duchefa-Biochemie, Netherland), sukrosa (Merck, Germany), vitamin (niacin, pyridoxine HCl, thiamin, myo inositol) (Phytotech, USA), alkohol 96%, Natrium klorida (NaOCl) (Bayclin-Johnson Home Hygiene Products Ltd, Indonesia), Tween-20 Sigma-Aldrich, St. Gallen, Germany) dan air destilasi.
Alat yang digunakan adalah autoclave (Pressure Sterilizer Model No.1941X, Foundry Co. Inc., WI, USA), laminar air flow cabinet (Labconco, USA), timbangan analitik (Sartorius BP 1200, Germany; Explorer Ohaus, Switzerland), pH meter (Model 420A Thermo Orion, USA), syringe (Sacorex 173, Swiss), hot plate stirer (Heidolph MR 3001 K, Germany), pinset (Yamaco, Japan), pisau kultur (BB511 Aesculap AG & Co. KG AM, Germany), scalpel (Yamaco, Japan), orbital shaker (GFL 3017, Germany), mikroskop epifluoresen (Nikon-Labophot-2, Japan), mikroskop stereo (Stemi SV8 Zeiss, Germany), mikroskop inverted (Belengineering SRL, Italy), lux meter (Lutron LX 101, Taiwan), thermo-hygrometer (Haar-Synth-Hygro, Germany), lampu (SL- Shinyoku, Indonesia), microtome (Kedee, China), dan kamera digital (Nikon DX 40, Japan; Panasonic DMC-FZ7-Lumix, Japan).
Tanaman donor yang digunakan ialah: (1) D. ‘Gradita 10’ (D. Sonia ‘Deep Pink’ x D. aksesi 1265), hasil persilangan pemulia anggrek Balai Penelitian tanaman Hias yang dirilis pada tahun 2010; (2) D. Indonesia Raya ’Ina’ (D. ‘Kim
Bora’ x D. ‘Wee Lian’), hasil persilangan pemulia swasta asal Malang
‘Wirakusumah Silamurti’ yang dirilis pada tahun 2006, diperoleh dari Edward and
Frans Orchids Malang; dan (3) D. Sonia ’Earsakul’ (D. ‘Caesar’ x D. ‘Tommy
Drake’) diperoleh dari Pusat Pengembangan Benih Tanaman Pangan,
Hortikultura, dan Kehutanan Provinsi DKI Jakarta (Gambar 3.1; Lampiran 1,2, dan 3).
(A) D. ‘Gradita 10’, (B) D.Indonesia Raya ’Ina’, dan (C) D. Sonia ’Earsakul’
Gambar 3.1. Tiga kultivar Dendrobium yang digunakan dalam penelitian 3.2.2 Pemeliharaan Tanaman Donor di Rumah Kaca
Tanaman dipelihara dalam pot kecil (diameter 15 cm) berisi campuran arang sekam dan potongan akar pakis (1:1, v v-1) dan ditempatkan di rumah kaca dengan suhu siang 30–37°C dan suhu malam 15–21°C, kelembaban relatif (RH) 60–90% pada siang hari dan 75–90% pada malam hari yang diukur menggunakan thermo- hygrometer , dan pencahayaan 12 jam foto periode dengan intensitas cahaya 175– 350 μmol m-2 s-1 selama musim kemarau (April-Oktober) dan 30-100 μmol m-2 s-1 (November-Maret) yang diukur menggunakan digital lux meter. Tanaman donor dipelihara dengan penyiraman tiap hari dan pemupukan tiap 2 minggu menggunakan pupuk cair yang mengandung 2 g L-1 NPK 20:20:20 dan 2 mL L-1 Bio Sugih. Tanaman berumur 18 bulan dengan pertumbuhan vegetatif yang optimal dan menghasilkan tunas baru yang vigor dan sehat (berukuran 7-10 cm) dipilih sebagai sumber eksplan.
3.2.3 Persiapan Eksplan, Pengkulturan, dan Inkubasi Kultur
Tunas dari lapangan (± 7–10 cm) yang sehat, vigor, dan bebas hama penyakit disterilisasi menggunakan 10, 5, dan 1% NaOCl dengan penambahan 0.2% tween-20 masing-masing selama 10, 5, dan 1 menit dan dibilas menggunakan akuadest steril. Mata tunas lateral (0.5–1.0 cm) dipotong berbentuk kubus dan dikulturkan pada medium Winarto-Teixeira (WT) (Winarto et al. 2011) yang mengandung 2 mg L-1 TDZ, 0.5 mg L-1 BA dan 0.02 mg L-1 NAA. Proses regenerasi mulai dari inisiasi kalus hingga terbentuk plantlet dengan 3-4 daun dan tinggi 3-5 cm yang siap digunakan sebagai donor/sumber eksplan disajikan pada Gambar 3.2. ( A) (B) (C) (A) (A)
(A) kriteria tunas yang digunakan sebagai eksplan (tunas sehat dan vigor dengan tinggi 7-10 cm), (B) isolasi mata tunas lateral, (C) & (D) pengkulturan mata tunas untuk inisiasi kalus dan/atau plbs, (E) &(F) proliferasi plbs pada media cair, (G) pemanenan plbs, (H) regenerasi plantlet pada media padat, (I) pemanenan plantlet umur ± 3 bulan, dan (J) kriteria plantlet yang digunakan sebagai sumber eksplan.
Gambar 3.2. Proses regenerasi/pembentukan plantlet dari eksplan mata tunas lateral tanaman Dendrobium untuk sumber eksplan.
(A). Plantlet sebagai sumber eksplan (umur ± 3 bulan dengan 3-4 daun dan tinggi 3-5 cm, (B) daun termuda plantlet (DP), dan (C) tunas pucuk (TP) dan tunas lateral (TL) plantlet.
Gambar 3.3. Kriteria dan bagian plantlet yang digunakan sebagai eksplan untuk inisiasi KE Dendrobium.
Bagian plantlet tiga kultivar Dendrobium (D. ‘Gradita 10’, D. Indonesia
Raya ’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’) (umur ± 3 bulan) dengan 3-4 daun dan tinggi 3-5 cm diisolasi dengan cara membuang daun terluar satu per satu menggunakan pisau kultur dengan menyisakan daun termuda/bagian dalam/pucuk daun di bawah mikroskop stereo. Selanjutnya tiga jenis eksplan [tunas pucuk (TP) (± 0.3 mm), mata tunas lateral (TL) (± 2 mm), dan daun termuda (DP) (± 4 mm)] dikulturkan
(A) (B) (C) (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) (H) (I) (J) (C) (C)
ke dalam botol kultur (Ø 2.5 cm dan tinggi 5.5 cm) yang berisi 2.5 mL media perlakuan untuk inisiasi KE (IM) (Gambar 3.3).
Kultur diinkubasikan sesuai dengan perlakuan, yaitu pada kondisi gelap dan fotoperiode 12 jam terang dengan intensitas cahaya 13 μmol m-2 s-1 pada suhu 23.5 ± 1.1 ºC dengan kelembaban 60-70% hingga terbentuk KE. Khusus untuk kultur cair dikocok di atas orbital shaker dengan kecepatan ± 100 rpm. Kalus- kalus yang terinisiasi diamati pertumbuhannya hingga ± 1 bulan dan kemudian diseleksi untuk mendapatkan galur-galur sel/kalus unggul. Kalus embriogenik (KE) yang memiliki pertumbuhan yang cepat, seragam dengan penampilan hijau segar dan remah digunakan pada tahap percobaan selanjutnya.
3.2.4 Kegiatan Penelitian
3.2.4.1 Pengaruh Kultivar dan Jenis Eksplan Terhadap Inisiasi KE Dendrobium
Tujuan : mendapatkan kultivar dan jenis eksplan terbaik untuk inisiasi KE Dendrobium. Plantlet (umur ± 3 bulan) dengan 3-4 daun dan tinggi 3-5 cm digunakan sebagai sumber eksplan (Gambar 3.3). Percobaan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) faktorial dua faktor dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah tiga jenis eksplan [TP (± 0.3 mm), TL (± 2 mm), dan DP (± 4 mm)] dan faktor kedua adalah tiga kultivar Dendrobium [D. ‘Gradita 10’, D.
Indonesia Raya ’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’]. Setiap ulangan terdiri dari 10 eksplan, sehingga terdapat 270 satuan percobaan sebagai satuan amatan. Setiap satu eksplan dikulturkan dalam botol kultur (Ø 2.5 cm; tinggi 5.5 cm) berisi 2.5 mL media semi-solid IM-3 (medium ½ MS + 1.5 mg L-1 TDZ + 0.5 mg L-1 BA + 20 g L-1 sukrosa + 2 g L-1 gelrite) dengan pH media 5.8. Kultur diinkubasi pada kondisi terang hingga terbentuk KE.
3.2.4.2 Pengaruh Kultivar dan Sistem Kultur Terhadap Inisiasi KE Dendrobium
Tujuan : mendapatkan kultivar dan sistem kultur yang paling sesuai untuk inisiasi KE Dendrobium. TP plantlet (± 0.3 mm) digunakan sebagai sumber eksplan. Percobaan menggunakan RAK faktorial dua faktor dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah tiga kultivar Dendrobium [D. ‘Gradita 10’, D. Indonesia
Raya ’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’] dan faktor kedua adalah dua sistem kultur (padat/semi-solid dan cair). Setiap ulangan terdiri dari 10 eksplan, sehingga terdapat 180 satuan percobaan sebagai satuan amatan. Setiap satu eksplan dikulturkan dalam botol kultur (Ø 2.5 cm; tinggi 5.5 cm) berisi 2.5 mL media IM- 3 (medium ½ MS + 1.5 mg L-1 TDZ + 0.5 mg L-1 BA+ 20 g L-1 sukrosa) dengan pH media 5.8. Kultur diinkubasi pada kondisi terang hingga terbentuk KE. Khusus untuk kultur cair digoyang di atas orbital shaker dengan kecepatan ± 100 rpm (Rachmawati et al. 2014).
3.2.4.3 Pengaruh Kultivar dan Kondisi Inkubasi Terhadap Inisiasi KE Dendrobium
Tujuan : mendapatkan kultivar dan kondisi inkubasi terbaik/paling sesuai untuk inisiasi KE Dendrobium. TP plantlet (± 0.3 mm) digunakan sebagai sumber
eksplan. Percobaan menggunakan RAK faktorial dua faktor dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah tiga kultivar Dendrobium [D. ‘Gradita 10’, D. Indonesia
Raya ’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’] dan faktor kedua adalah dua kondisi kultur [terang dan gelap] pada 23.5 ± 1.1 °C. Setiap ulangan terdiri dari 10 eksplan, sehingga terdapat 180 satuan percobaan. Setiap satu eksplan dikulturkan dalam botol kultur (Ø 2.5 cm; tinggi 5.5 cm) berisi 2.5 mL media semi-solid IM-3 (medium ½ MS + 1.5 mg L-1 TDZ + 0.5 mg L-1 BA+ 20 g L-1 sukrosa + 2 g L-1 gelrite ) dengan pH media 5.8. Kultur diinkubasi sesuai perlakuan.
3.2.4.4 Pengaruh Kultivar dan Media Terhadap Inisiasi KE Dendrobium Tujuan : mendapatkan kultivar dan media teroptimasi untuk inisiasi KE Dendrobium. Bahan tanaman yang digunakan adalah TP plantlet (± 0.3 mm). Percobaan menggunakan RAK faktorial dua faktor dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah tiga kultivar Dendrobium [D. ‘Gradita 10’, D. Indonesia Raya
’Ina’, dan D. Sonia ’Earsakul’] dan faktor kedua adalah delapan komposisi media (IM) (Tabel 3.1). Setiap ulangan terdiri dari 10 eksplan, sehingga terdapat 720 satuan percobaan sebagai satuan amatan. Setiap satu eksplan dikulturkan dalam botol kultur (Ø 2.5 cm; tinggi 5.5 cm) berisi 2.5 mL media semi-solid perlakuan yang ditambah 20 g L-1 sukrosa + 2 g L-1 gelrite dengan pH media 5.8. Kultur diinkubasi pada kondisi terang hingga terbentuk KE.
Tabel 3.1. Komposisi media untuk inisiasi KE Dendrobium Media inisiasi
(IM) Media dasar
Zat pengatur tumbuh (mg L-1)
TDZ BAP Kinetin IM-1 ½ MS 1.0 0.5 - IM-2 ½ MS 1.0 1.0 - IM-3 ½ MS 1.5 0.5 - IM-4 ½ MS 1.5 1.0 - IM-5 VW 2.0 - 1.0 IM-6 VW 2.0 - 0.5 IM-7 VW 1.0 - 1.0 IM-8 VW 1.0 - 0.5
Media ½ MS (½ unsur makro dan mikro dengan vitamin penuh : 100 mg L-1 myo-inositol, 0.1 mg L-1 thiamine-HCl, 0.5 mg L-1 Pyridoxine HCl, 0.5 mg L-1 Nicotinic Acid, 2 mg L-1 glycine) (Modifikasi
Murashige & Skoog 1962); VW (Vacin & Went 1949).
3.2.5 Peubah Pengamatan
Peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah : (1) waktu inisiasi KE (hari setelah kultur/hsk), (2) kemampuan regenerasi eksplan (%), (3) persentase KE (%), (4) bobot basah KE (g), dan (5) volume KE (mm3). Pengamatan berkala dilakukan untuk memantau perubahan eksplan dalam merespon media kultur hingga pembentukan KE selama inkubasi. Waktu inisiasi KE dihitung dari awal eksplan dikulturkan hingga terbentuk KE. Persentase regenerasi eksplan dan pembentukan KE dihitung dengan menghitung jumlah eksplan yang beregenerasi dan membentuk KE dibagi dengan total eksplan yang dikulturkan dikalikan dengan 100 % dan diamati 4 minggu setelah inkubasi. Bobot basah dan volume KE diukur satu bulan sejak KE terinisiasi.
3.2.6 Analisis Data
Data yang terkumpul dari setiap tahapan penelitian dianalisis menggunakan analysis of varian (anova) dengan pengolah data SAS Release Window 9.12. Adanya perbedaan nyata nilai rata-rata perlakuan diuji lebih lanjut menggunakan Duncan’s New Multiple Range Test (DMRT) taraf kepercayaan 95% (Mattjik & Sumertajaya 2006). Data ditampilkan dalam bentuk tabel dan grafik.
