DAFTAR GAMBAR
PEMBESARAN MINI-PANTLET MINIPLANTLET
D. Indonesia Raya ‘Ina’ Dalam Erlenmeyer 100 mL
10 PEMBAHASAN UMUM
Kebutuhan pasar akan tanaman pot dan bunga potong Dendrobium tergolong sangat tinggi. Peluang pasar tersebut belum dapat dimanfaatkan dengan baik oleh pelaku agribisnis anggrek Dendrobium di Indonesia. Permasalahan utama kurang berkembangnya agribisnis anggrek Nasional, termasuk Dendrobium lokal pada skala komersial adalah ketersediaan benih bermutu yang masih sangat terbatas. Ketidaktersediaan benih tersebut disebabkan oleh belum tersedianya teknologi perbanyakan masal benih Dendrobium bermutu skala komersial yang mampu menjamin ketersediaan benih dalam jumlah besar secara berkesinambungan. Mengingat ketersediaan benih bermutu merupakan faktor kunci dan memiliki kontribusi yang sangat besar dan strategis dalam menunjang kemajuan agribisnis anggrek Dendrobium, maka penyediaan teknologi perbanyakan anggrek yang efektif dan efisien perlu diupayakan secara maksimal, mengingat teknologi perbanyakan klonal anggrek Dendrobium yang ada saat ini memiliki produktivitas yang masih rendah.
Protokol perbanyakan masal benih Dendrobium bermutu melalui pengembangan teknologi embriogenesis somatik berbasis bioreaktor berhasil dilakukan. Protokol tersebut terdiri dari (1) inisiasi kalus embriogenik (KE), (2) proliferasi awal KE, (3) proliferasi KE menggunakan sistem kultur cair dalam erlenmeyer untuk penyiapan kultur starter, (4) produksi masal KE dalam airlift bioreactor, (5) regenerasi KE yang terdiri dari diferensiasi, perkecambahan, pembesaran plantlet, dan (6) aklimatisasi plantlet dan pertumbuhan bibit di rumah kaca. Protokol tersebut dikembangkan dengan memperhatikan banyak faktor pada setiap tahapannya, seperti: genotipe, jenis eksplan, komposisi media, sistem kultur, kondisi inkubasi, umur kultur/periode kultur, kepadatan eksplan, tingkat aerasi, pengeringan kalus, kondisi plantlet dan kondisi lingkungan aklimatisasi. Pada pengembangan protokol ini juga berhasil dipelajari pola pertumbuhan (kurva sigmoid) KE Dendrobium ( Tabel 9.1; Gambar 9.1).
Pada tahap inisiasi, KE optimal diperoleh dengan mengkulturkan tunas pucuk plantlet D. Indonesia Raya ‘Ina’ pada medium IM-3 (medium ½ MS + 1.5 mg L-1 TDZ + 0.5 L-1 BA + 20 g L-1 sukrosa + 2 g L-1 gelrite), menggunakan sistem kultur padat dan diinkubasi pada kondisi terang dengan fotoperiode terang 12 jam di bawah lampu fluoresen dengan intensitas cahaya ~13 µmolm-2 s-1 pada suhu 23.5 ± 1.1 °C. Inisiasi KE berhasil dilakukan dalam waktu yang lebih singkat (kurang dari 10 hari) dengan kemampuan regenerasi eksplan lebih dari 95% dan KE yang berkualitas (kalus remah, hiperhidrik, berwarna hijau segar dengan inisiasi pertumbuhan yang cepat) dan ini menjadi kelebihan tahap ini. Kelebihan ini sangat didukung oleh penggunaan genotipe, eksplan tunas pucuk dan TDZ. Perbedaan susunan gen pada tiap genotipe mempengaruhi kemampuan sel dan jaringan setiap kultivar dalam menyerap dan merespon komposisi media dan zpt yang diberikan untuk menginduksi terjadinya KE. Menurut Wattimena et al. (1992) terdapat sekelompok gen tertentu yang mengatur konsentrasi yang efektif dari zat-zat yang dapat mendorong pertumbuhan dan metabolisme dalam sel, dimana zat-zat pendorong pertumbuhan yang dibutuhkan oleh setiap jenis tanaman bervariasi antar genotipe. Menurut Murthy et al. (1998) TDZ yang ditambahkan dalam media kultur berperan penting dalam modulasi hormon endogen yang menyebabkan keseimbangan hormon untuk proses inisiasi kalus
dan/atau pembentukan embrio mudah terjadi. TDZ ini juga berperan dalam modifikasi membran sel, level energi, penyerapan nutrisi dan asimilasi nutrien yang berdampak pada meningkatnya respon sel dalam morfogenesis. Kombinasi TDZ dan BA memiliki peran dalam menstimulasi pembelahan sel, pembentukan dan pertumbuhan kalus (De Klerk 2012) memegang peranan dalam inisiasi KE. Meski demikian belum seluruh eksplan yang dikultur menghasilkan KE yang tumbuh dengan cepat dan seragam. Lima persen (5%) kalus bersifat organogenik. Selain itu penggunaan eksplan yang sangat muda yang bersifat meristematik dan kompeten juga menjadi faktor utama keberhasilan inisiasi KE.
Proliferasi kalus merupakan tahap penting setelah KE primer berhasil diinisiasi. Kemampuan proliferasi KE berbeda-beda tergantung pada genotipe, jenis eksplan, komposisi media, sistem kultur, kondisi lingkungan selama periode inkubasi, kepadatan eksplan, dan periode kultur (Rakesh & Chawla 2002; Ferreira et al. 2006; Roy et al. 2007; Zha et al. 2007; Zhao et al. 2008; Gow et al. 2009; Cui et al. 2010; Tao et al. 2011; Rafique et al. 2013; Suarez 2013; Winarto et al. 2013a; Julkiflee et al. 2014; Rachmawati et al. 2014). Tahap ini berhasil mengungkapkan bahwa genotipe, jenis eksplan, media, sistem kultur, umur/periode kultur dan kepadatan kalus memberikan berpengaruh terhadap proliferasi KE.
Proliferasi awal KE terbaik ditemukan pada Thin cross section (TCS) KE primer (umur ± 1 bulan) asal eksplan tunas pucuk plantlet D. Indonesia Raya ‘Ina’ yang dikulturkan pada media IM-3+ (medium ½ MS + 1.5 mg L-1 TDZ + 0.5 mg L-1 BA + 150 mL L-1 air kelapa + 20 g L-1 sukrosa + 2 g L-1 gelrite) dengan menggunakan sistem kultur padat dan diinkubasi pada kondisi terang hingga periode kultur ke 5 dengan interval subkultur 1 bulan. Kalus berproliferasi secara cepat dan mudah dengan kualitas kalus yang baik, tingkat kontaminasi dan pencoklatan KE yang rendah. Tahap proliferasi awal KE masih membutuhkan komposisi media dengan kombinasi dan konsentrasi zpt yang sama dengan tahap inisiasi KE-nya. Penggunaan air kelapa sebagai sitokinin alami pada tahap proliferasi diharapkan mampu memacu pembelahan sel sehingga mengakibatkan pertumbuhan dan proliferasi sel terjadi dengan cepat tanpa munculnya mutan (Jean et al. 2009). Kandungan bahan aktif dengan komposisi yang unik menjadi alasan penggunaan air kelapa pada kultur in vitro berbagai tanaman (Akter et al. 2007; Jean et al. 2009).
Proliferasi KE Dendrobium tidak dapat dilakukan secara terus menerus pada sistem kultur padat, karena sebagian KE beregenerasi menjadi ES, ES berkecambah dan proliferasi KE sulit dipertahankan. Kondisi ini dapat manghambat tujuan perbanyakan benih Dendrobium skala masal, dan menghasilkan benih yang tidak seragam. Oleh karena itu kehati-hatian sangat diperlukan untuk mengetahui saat yang tepat untuk menghentikan subkultur dan memindahkan kultur pada media cair. Keputusan tersebut diperlukan untuk tetap menjaga persentase KE tetap maksimal untuk proses perbanyakan KE tahap berikutnya. Proliferasi kalus menggunakan sistem kultur cair juga dipengaruhi oleh umur kalus/periode kultur, komposisi media, zpt, asam amino dan kepadatan kalus (Roy & Banerjee 2003; Wang et al. 2006; Roy et al. 2007; Khosravi et al. 2008; Winarto 2011, Lizawati 2012; Sharma et al. 2013; Suarez 2013; Winarto et al. 2013a; Rachmawati et al. 2014; Julkiflee et al. 2014). Kesesuaian semua faktor penentu tersebut berpengaruh terhadap keberhasilan proliferasi KE anggrek ini.
Pertumbuhan dan proliferasi KE teroptimal dan kultur starter terbaik dalam jumlah banyak berhasil diperoleh pada kalus berumur 9 bulan yang dikulturkan pada medium ½ MS yang ditambah 0.5 mg L-1 TDZ dan 0.1 mg L-1 BA dengan tingkat kepadatan 3 g kalus per 25 mL media cair. Pada tahap ini persentase KE hingga 90.1% dan kecepatan penggandaan mencapai 4.95 dan 5-7% pencoklatan berhasil dipertahankan dengan memperhatikan proses seleksi jenis KE dan kualitasnya.
Pada studi ini juga terbukti bahwa penambahan 150 mg L-1 L-Prolin ke dalam media terseleksi (PM-12; medium ½ MS + 0.5 mg L-1 TDZ + 0.1 mg L-1 BA + 150 mL L-1 air kelapa) secara signifikan meningkatkan kemampuan proliferasi KE D. Indonesia Raya ‘Ina’ menjadi lebih optimal, menghasilkan persentase KE tertinggi (98.2%) dengan 458% pertambahan bobot basah kalus dan 5.58 tingkat multiplikasi kalus, serta mampu menekan pencoklatan kalus hingga 4% dengan kondisi kalus remah, hijau segar, dan tidak hiperhidrik. Aplikasi L-Prolin yang lebih baik pengaruhnya dibanding asam amino yang lain disebabkan peran maksimal asam amino ini dalam mengimbangi ketidak- seimbangan seluler pada saat cekaman lingkungan terjadi, terutama cekaman oksidatif akibat peningkatan reactive oxygen species (ROS) pada kultur yang kekurangan oksigen (Liang et al. 2013). Keberadaan L-Prolin dalam media akan dimanfaatkan oleh sel-sel KE untuk meningkatkan metabolisme sel. Meningkatnya metabolisme sel yang melibatkan enzim glutamat kinase/glutamyl fosfat reductase dan prolin dehydrogenase/P5C dehydrogenase (reduksi-oksidasi) menyebabkan terjadinya penurunan pembentukan ROS. Selanjutnya menurunnya konsentrasi ROS meningkatkan daya tumbuh dan adaptasi sel terhadap cekaman oksidatif lebih baik, karena kerusakan sel/bagian sel/protein sel/DNA dapat
diminimalisasi sekecil mungkin (Şen 2012).
Pada penelitian ini secara khusus dipelajari pola pertumbuhan ‘kurva sigmoid‘ KE Dendrobium. Dari segi praktis informasi ini sangat penting untuk tujuan pengambilan sumber eksplan yang tepat untuk manipulasi genetik, produksi metabolit sekunder, dan mikropropagasi, termasuk pengambilan sumber eksplan yang tepat untuk perbanyakan KE skala masal menggunakan sistem kultur cair dalam bioreaktor. Studi mengenai pola pertumbuhan pada kultur in vitro tanaman masih jarang dilaporkan dan belum ada yang melaporkan secara lengkap pada kultur in vitro anggrek Dendrobium. Penelitian ini berhasil membuktikan bahwa pola pertumbuhan ’kurva sigmoid’ KE Dendrobium sangat dipengaruhi oleh periode kultur (R2=0.99). Ketiga kultivar Dendrobium yang diujicoba menunjukkan pola pertumbuhan KE yang relatif sama, namun dengan laju pertumbuhan yang berbeda. Fase pertumbuhan lambat berlangsung ± 8 bulan dimulai dari tahap inisiasi (PK 1 bulan), proliferasi awal pada kultur padat (PK 2- 5 bulan), dan proliferasi awal pada kultur cair (PK 6-8 bulan), cepat/eksponensial (PK 9-13 bulan), linear (PK 14-15 bulan), deselerasi (PK 16-18 bulan), stasioner (PK 18 dan 19 bulan), dan awal kematian kalus (PK 19 dan 20 bulan). Laju pertumbuhan KE tercepat secara berturut-turut dimiliki oleh D. Indonesia Raya
‘Ina’, D. Sonia ‘Earsakul’, dan D. Gradita ‘10’ dengan proliferasi KE teroptimal terjadi pada periode kultur 9-13 bulan, dimana KE berada fase pertumbuhan cepat dengan laju pembelahan sel yang maksimal dan pertambahan jumlah biomassa yang meningkat tajam. Informasi ini sangat penting terkait penyiapan kultur
starter yang optimal untuk tujuan produksi benih Dendrobium bermutu skala masal secara berkesinambungan.
Proliferasi KE skala masal dengan peningkatan produktivitas dan skala/kapasitas produksi yang lebih besar salah satunya dapat dilakukan dengan menggunakan sistem kultur cair dalam bioreaktor. Penggunaan sistem ini dapat meningkatkan kecepatan proliferasi sel karena penyerapan nutrisi yang optimal, ketersediaan oksigen yang cukup, pergerakan eksplan yang aktif, serta lebih efisien dalam penggunaan peralatan, biaya produksi, ruang, waktu dan tenaga (Takayama & Akita 2005; Ziv 2005; Berthouly & Etienne 2005; Adelberg & Fari 2010).
Keberhasilan aplikasi bioreaktor untuk perbanyakan in vitro tanaman sangat dipengaruhi oleh banyak faktor, diantaranya yaitu tingkat aerasi yang berpengaruh terhadap pengadukan (agitasi), sirkulasi udara, dan oksigen terlarut (dissolved oxygen; DO), kepadatan kultur, komposisi media, kondisi sel (fase pertumbuhan sel/ umur sel); jenis sel/kalus; dan genotipe (Ziv 2005; Han et al. 2002; Lian et al. 2003; Esyanti & Muspiah 2006; Celiktas et al. 2010; Winarto et al. 2013a; Suarez 2013). Kesesuaian dari faktor-faktor tersebut akan menentukan tingkat keberhasilan proliferasi KE dalam bioreaktor. Kalus yang memasuki fase pertumbuhan eksponensial/cepat akan mampu berproliferasi dengan maksimal jika kondisi lingkungannya mendukung, yaitu dengan ditumbuhkan dalam media tumbuh teroptimasi dengan tingkat aerasi dan kepadatan kalus yang sesuai. Pada penelitian ini pertumbuhan dan proliferasi KE D. Indonesia Raya ‘Ina’ dalam airlift bioreactor 500 mL teroptimal ditemukan pada kalus berumur 9 bulan yang dikulturkan pada medium ½ MS yang ditambah 0.5 mg L-1 TDZ, 0.1 mg L-1 BA dan 150 mg L-1 L-Prolin dengan tingkat aerasi 2.5 vvm dan kepadatan kalus 10 g per 250 mL media. Laju proliferasi dan pertumbuhan KE D. Indonesia Raya ‘Ina’ pada airlift bioreactor lebih cepat dan tinggi dibandingkan dalam erlenmeyer 100 mL, yaitu dengan pertambahan bobot basah kalus mencapai 584.8 % dan tingkat multiplikasi mencapai 6.85, dan dapat mempertahankan KE dalam persentase yang tinggi hingga 94% dengan tingkat diferensiasi KE dan perkecambahan ES yang rendah (2.7% dan 1.3%) dan tingkat malformasi KE yang rendah (6.1%; 3.3% pencoklatan, 1.5% kalus masif dan 1.3% hiperhidrik).
Faktor kritikal yang sangat mempengaruhi keberhasilan proliferasi dan pertumbuhan KE dalam sistem airlift bioreactor adalah kombinasi tingkat aerasi dan kepadatan kalus yang digunakan (Azechi et al. 1985; Paek et al. 2001). Ketidakseimbangan tingkat aerasi dan kepadatan kalus dapat menyebabkan munculnya cekaman lingkungan yang berakibat pada penurunan laju pertumbuhan, penyimpangan/malformasi morfogenesis dan kematian sel (Verpoorte et al. 1993; Ziv 2005; Esyanti & Muspiah 2006; Celiktas et al. 2010).
Kombinasi tingkat aerasi yang tinggi dengan kepadatan kalus yang tinggi menimbulkan pergesekan antar kalus yang mengakibatkan pelukaan pada permukaan kalus. Pelukaan ini menimbulkan terjadinya stress dan menyebabkan senyawa fenolik yang berada diarea permukaan yang rusak, khususnya vakuola sel, akan segera dioksidasi membentuk senyawa quinon oleh enzim fenol osidase dan ketersediaan oksigen dalam media. Senyawa quinon ini bersifat sangat reaktif dan toksik terhadap sel dan jaringan tanaman (Titov et al. 2006) Akumulasi senyawa inilah yang kemudian menyebabkan sel tidak mampu menyerap nutrisi, pencoklatan terjadi, yang pada akhirnya menyebabkan kematian sel. Sementara
tingkat aerasi yang rendah dengan kepadatan yang rendah juga menimbulkan pertumbuhan KE yang bermasalah. Pada kondisi ini komunikasi sel ke sel KE tidak terjadi secara maksimal dan lingkungan mikro optimal yang saling memberi pengaruh positif antar sel KE juga tidak tercapai (Neitzel & Rasband 2014). Hal ini disebabkan setiap sel berinteraksi dalam memberikan dan menerima sinyal baik dari sel lain maupun lingkungannya. Dampaknya sel juga mengalami cekaman sebagai akibat jumlah oksigen yang rendah. Cekaman oksidatif ini menyebabkan konsentrasi ROS meningkat (Liang et al. 2013). Peningkatan ROS
menyebabkan terjadinya kerusakan sel, bagian sel, protein dan DNA (Şen 2012).
Kerusakan tersebut pada akhirnya menyebabkan pencoklatan KE yang berujung pada kematian KE
Lebih lanjut kepadatan kalus yang tinggi dikombinasikan dengan tingkat aerasi yang rendah menyebabkan masalah dalam pengaduk/agitasi, sirkulasi udara, dan jumlah oksigen terlarut (dissolved oxygen; DO2) karena udara tidak
mampu mengangkat agregat sel, akibatnya pergerakan aktif sel tidak terjadi dan sel mengendap pada permukaan bawah bioreaktor. Pada kondisi ini akan terjadi penurunan laju pertumbuhan dan kematian sel karena tidak tersedianya oksigen yang terlarut dalam jumlah yang cukup, sehingga kultur mengalami kekurangan oksigen (Taticek et al. 1991). Kultur sel mengalami stress oksidatif sebagai
dampak meningkatnya jumlah ROS (Şen 2012). Konsentrasi oksigen yang terlarut (DO2) selama kultur cair memiliki pengaruh kuat dalam aktivitas mitosis dan laju
pertumbuhan sel (McHale et al. 1987). Pertumbuhan kultur sel tumbuhan tidak membutuhkan oksigen tinggi, bahkan pada konsentrasi oksigen yang terlalu tinggi dapat menghambat pertumbuhan dan laju pembelahan sel (McHale et al. 1987; Ziv 2005), namun demikian keberadaan oksigen tetap diperlukan untuk pertumbuhan sel. Oleh karena itu, penyediaan jumlah oksigen yang cukup (di atas DO2 kritis) merupakan perhatian utama dalam scale-up bioreaktor dalam rangka
produksi benih skala masal. Inilah titik kritikal yang perlu mendapatkan perhatian serius saat menggunakan biorektor untuk tujuan perbanyakan KE. Kesesuaian antara tingkat aerasi dan kepadatan eksplan memegang peranan yang sangat penting untuk menunjang keberhasilannya, termasuk menurunkan cekaman oksidatif, peluang terjadinya malformasi eksplan yang dikultur didalamnya.
Menurut Ziv (2005) dan Chakrabarty et al. (2007) jaringan/organ tanaman yang terendam akan menunjukkan cekaman oksidatif dengan meningkatnya konsentrasi oksigen reaktif yang terasosiasi dengan perubahan aktivitas enzim antioksidan. Dua aktivitas enzim antioksidan yang diuji dalam penelitian ini yaitu katalase (CAT) dan guaiacol peroksidase (G-POD) memperlihatkan aktivitas yang menurun, sedangkan aktivitas enzim lipid peroksidase (LP) cenderung meningkat pada kalus yang mengalami cekaman oksidatif/malformasi morfologi. Cekaman oksidatif menyebabkan kerusakan oksidatif lipid (peroksidasi lipid) yang dapat dideteksi dengan peningkatan aktivitas enzim LP atau peningkatan Malondialdehyde (MDA) dalam sel (Forman et al. 2010). Terjadinya peroksidasi lipid akan menyebabkan kerusakan oksidatif sel dalam berbagai jaringan seperti hilangnya integritas dan permeabilitas membran (Geva et al. 1998; Pokorny et al. 2001). Perubahan tersebut mempengaruhi anatomi dan fisiologi tanaman dan kemampuan hidupnya yang terekspresi dengan munculnya penyimpangan pertumbuhan/ malformasi morfogenesis pada kultur. Namun demikian, tingkat abnormalitas regeneran hasil kultur in vitro sangat tergantung pada kesesuaian
dari faktor-faktor yang berpengaruh. Oleh karena itu sangat penting untuk memperhatikan/mengoptimasi semua faktor yang terlibat di dalam proses penyediaan benih Dendrobium bermutu skala masal melalui embriogenesis somatik berbasis bioreaktor.
Pada tahap regenerasi KE dan perkecambahan ES terdapat beberapa faktor penting yang berperan, yaitu waktu dan suhu pengeringan KE dan media. Pada penelitian ini terbukti bahwa perlakuan pengeringan KE selama 7 hari pada suhu 18 ± 2 °C paling sesuai untuk regenerasi dan perkecambahan ES D. Indonesia
Raya ‘Ina’. Penelitian tentang perlakuan pengeringan kalus/ES untuk tujuan menstimulasi regenerasi dan perkecambahannya pada anggrek khususnya pada Dendrobium belum pernah dilakukan. Penelitian pada tanaman lain membuktikan bahwa perlakuan pengeringan/penurunan kadar air KE dan/atau ES berpengaruh terhadap regenerasi dan perkecambahan ES (Puhan & Rath 2012; Singh 2014; Srinivas et al. 2006; San & Dumanoglu 2007). Penurunan kadar air jaringan kalus diduga penting dalam proses pendewasaan terkait dengan persiapan KE dan/atau ES untuk beregenerasi dan berkecambah secara efektif (Etienne et al. 2006). Tahap ini adalah puncak dari akumulasi cadangan karbohidrat, lipid dan protein, dehidrasi embrio dan penurunan respirasi selular, dan ekspresi gen protein late embryogenic abundant (LEA) (Srinivas et al. 2006; Zhu 2014).
Kemampuan regenerasi dan perkecambahan ES juga sangat ditentukan oleh komposisi media yang digunakan (Martin & Madassery 2006; Kaur & Bhutani 2009; Khatun et al. 2010; Winarto et al. 2013a; Rachmawati et al. 2014; Shroti & Upadhyay 2014). Hasil penelitian ini menginformasikan bahwa kemampuan regenerasi KE menjadi ES D. Indonesia Raya ‘Ina’ terbaik ditemukan pada medium MK-2 padat (medium ½ MS + 0.05 mg L-1 BA + 20 g L-1 gula + 7 g L-1 agar). Secara umum regenerasi dan perkecambahan ES D. Indonesia Raya ‘Ina’ lebih optimal pada media dasar ½ MS dibandingkan pada media dasar 2 g L-1 Growmore (32N:10P:10K) pada semua kombinasi perlakuan zpt. Hasil ini membuktikan bahwa untuk mendapatkan kemampuan regenerasi dan perkecambahan ES D. Indonesia Raya ‘Ina’ yang optimal masih diperlukan ketersediaan hara yang cukup tinggi/memadai dan kehadiran zpt meskipun dalam konsentrasi sangat rendah.
Persiapan plantlet yang sehat, vigor dan berkualitas merupakan salah satu aspek penting penunjang keberhasilan aklimatisasi. Pada plantlet yang masih berukuran kecil, kurang sehat dan vigor, maka pembesaran pertumbuhan (pembesaran) mini plantlet menjadi plantlet yang siap aklimatisasi sangat diperlukan. Pertumbuhan plantlet D. Indonesia Raya ‘Ina’ terbaik ditemukan pada mini-plantlet (kecambah ukuran ± 1 cm) asal medium MK-2 (medium ½ MS + 0.05 mg L-1 BA) yang dikulturkan pada media pupuk AM-5 (2 g L-1 Hyponex® dengan penambahan 20 g L-1 gula, 7 g L-1 agar, dan 2% arang aktif). Hasil penelitian ini membuktikan bahwa untuk pertumbuhan mini-plantlet D. Indonesia
Raya ‘Ina’ menjadi plantlet sudah tidak membutuhkan media dengan kandungan
hara lengkap dan penambahan zpt sudah tidak diperlukan. Selanjutnya pemanfaatan media pupuk lebih disarankan untuk menggantikan media MS.
Aklimatisasi adalah tahap penting diakhir proses perbanyakan tanaman secara in vitro dan dipengaruhi oleh banyak faktor (Kaur & Bhutani 2009; Lesar et al. 2012; Vijayakumar et al. 2012; Pant & Thapa 2012; Winarto et al. 2013a; Winarto & Teixera 2015). Keberhasilan aklimatisasi yang tinggi sangat
berpengaruh terhadap penyediaan benih berkualitas. Kriteria plantlet dan kondisi lingkungan aklimatisasi yang sesuai menjadi faktor penentu keberhasilan hidup plantlet. Pada kondisi yang sesuai plantlet dapat tumbuh dan berkembang menjadi benih normal secara optimal. Pada penelitian ini keberhasilan hidup plantlet yang tinggi (lebih dari 90%) dan benih tumbuh sehat dan vigor ditemukan pada plantlet dengan perakaran yang baik, memiliki 3-5 daun dan tinggi 3-5 cm yang dihardening selama ± 1 bulan di luar ruang inkubasi kultur (suhu 25-27 oC dengan kelembaban 50-60%), ditumbuhkan secara kompotan sebanyak 50 plantlet per pot berdiameter 15 cm atau 100 plantlet pada tray plastik (29 cm x 23 cm x 7 cm) berisi media potongan akar pakis dan diinkubasi di atas rak di dalam rumah kaca pada intensitas cahaya 100–120 µmol m-2 s-1, temperatur 23-25 ° C dengan kelembaban 70-80%.
Pada skala percobaan produksi masal KE menggunakan sistem kultur cair dalam airlift bioreactor 500 mL menunjukkan produktivitas yang lebih tinggi daripada kultur cair konvensional dan semi konvensional. Sistem bioreaktor mampu meningkatkan proliferasi KE hingga 6x, menghasilkan 94% benih normal dengan abnormalitas yang rendah (6%). Persentase abnormalitas tersebut bukan merupakan nilai mutlak, namun nilai hasil proses seleksi bertahap, mengingat pada setiap tahap penelitian ditemukan kalus organogenik, pencoklatan dan malformasi yang tidak ditambahkan dalam perhitungan. Persentase kalus organogenik (KO), pencoklatan dan malformasi pada tiap tahap perbanyakan adalah 5% (KO) dan 4% pencoklatan pada tahap proliferasi awal; 1.8% (KO) dan 4% pencoklatan pada tahap proliferasi erlenmeyer; 1.5-7.8% kalus masif, 0.2- 8.0% kalus sukulen, 3.3% pencoklatan pada tahap proliferasi bioreaktor.
Jumlah benih Dendrobium bermutu yang dihasilkan berada dalam jumlah yang sangat banyak (276x dibanding sistem konvensional dan 103x dibandingkan semi konvensional), yaitu ± 195 juta plantlet atau 160 juta bibit kompotan atau 145 juta bibit individu per 100 eksplan per periode produksi (± 2 tahun) (Tabel 9.1 dan 9.2; Lampiran 12 dan 13). Berdasarkan estimasi analisis finansial adopsi teknologi ini untuk tujuan penyediaan benih Dendrobium skala industri dinilai sangat efisien dan menguntungkan (R/C =3.32 atau B/C = 2.32 > 1) (Tabel 9.3; Lampiran 15 dan 16). Teknologi ini memiliki potensi tinggi untuk diterapkan dalam rangka penyediaan benih bermutu (sehat, vigor, dan seragam/true to type) skala komersial jenis Dendrobium lain. Namun demikian, pengembangan protokol pada skala komersial perlu dikonfirmasi/dikaji lebih lanjut untuk program adopsi kepada produsen dan petani penangkar di sekitar lokasi pengembangan kawasan produksi, serta perlu diverifikasi sesuai dengan analisis visibilitas, nilai ekonomis, permintaan pasar, tujuan pasar dan pemain pasar dari jenis Dendrobium yang dipilih.
Aplikasi lebih lanjut teknologi ini diharapkan dapat menjadi alat yang efektif dan efisien untuk penyediaan benih Dendrobium bermutu produk asli Indonesia. Dengan semakin banyaknya jenis Dendrobium produk asli Indonesia yang disiapkan ketersediaan benih berkualitasnya diharapkan dapat memberikan manfaat dan dampak yang nyata terhadap perkembangan dan kemajuan agribisnis Dendrobium di Indonesia bagi semua pelakunya. Pada gilirannya Dendrobium produk-produk Nasional dapat menjadi tuan di negeri sendiri dan meningkatkan pertumbuhan ekonomi nasional melalui peningkatan aktivitas agribisnis anggrek yang makin tinggi dan ekspor produk anggrek yang makin besar ke luar negeri.