Survei penyakit pada tanaman tomat dilaksanakan di daerah Cisarua (Jawa Barat), Magelang, Semarang, dan Boyolali (Jawa Tengah), Kaliurang, Kulonprogo, Bantul, Kulonprogo (D.I Yogyakarta). Sampel tanaman yang menunjukkan gejala terinfeksi virus selanjutnya dibawa ke Laboraatorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB untuk dilakukan deteksi dan identifikasi dengan teknik PCR-RFLP dan selanjutnya dilakukan perbanyakan isolat. Penelitian dilaksanakan dari bulan Juni 2003 sampai Pebruari 2004.
Pengumpulan Sampel Tanaman Tomat yang Terinfeksi
Tanaman yang diduga terserang begomovirus dengan gejala seperti daun keriting, daun menjadi kecil, tepi daun melengkung ke atas, penebalan anak tulang daun, daun menguning atau menunjukkan pola mosaik dikumpulkan dari pertanaman tomat di beberapa tempat di Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat. Selanjutnya dilakukan deteksi dengan teknik PCR. Sampel tanaman yang memberikan hasil yang positif dipelihara di rumah kaca dan perbanyakan isolat begomovirus tersebut dilakukan pada tanaman tomat.
Perbanyakan Sumber Inokulum Begomovirus
Untuk mendapatkan sumber inokulum begomovirus yang murni, dilakukan penularan menggunakan B. tabaci dari tanaman yang terinfeksi di lapang ke tanaman tomat sehat. Hasil penularan digunakan untuk perbanyakan sumber inokulum virus.
Perbanyakan sumber inokulum dilakukan melalui penyambungan bagian tanaman terinfeksi dari sumber inokulum ke tanaman tomat sehat. Penyambungan dilakukan dengan membuat irisan tipis dan pipih pada bagian ujung petiol dari daun tanaman terinfeksi, dan bagian tersebut disisipkan ke dalam sayatan agak serong yang dibuat pada bagian sisi batang tanaman sehat. Bagian sambungan kemudian dibalut dengan menggunakan parafilm dan tanaman dipelihara di rumah kaca. Tanaman yang menunjukkan gejala digunakan sebagai sumber inokulum.
45
Deteksi Begomovirus dari Sampel Tanaman dengan Teknik PCR
Metode ekstraksi DNA untuk PCR disusun berdasarkan metode yang dilakukan oleh Dellaporta et al. (1983). Sampel daun tanaman (±300 mg) diletakkan di dalam tabung mikro, ditambahkan 500 µl bufer [Tris 0. 1 M (pH 8.0), EDTA 0.05M, NaCl 0.5M] dan ditambahkan 5 µl ß -merkaptoetanol, kemudian digerus dengan pistil plastik. Setelah digerus ditambahkan 500 µl campuran fenol: kloroform: alkohol isoamil (25: 24: 1) dan divorteks. Campuran kemudian disentrifugasi pada 12.000 rpm pada suhu 4ºC selama 5 menit. Supernatan dipindah ke tabung mikro yang baru dan ditambahkan 33 µl SDS 20%, divorteks, ke mudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65ºC. Selanjutnya ditambahkan 160 µl potasium asetat (KoAC) 5M, divorteks, dan selanjutnya disentrifugasi pada 12.000 rpm pada suhu 4ºC selama 5 menit. Supernatan diambil, ditambahkan 160 µl KoAC, kemudian divorteks dan disentrifugasi pada 12.000 rpm pada suhu 4ºC selama 5 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan 0. 5 volume isopropanol dingin, kemudian tabung dibolak balik secara perlahan. Selanjutnya disentrifugasi pada 12.000 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit. Pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan menambahkan 500 µl etanol 70% dingin dan disentrifugasi pada 12.000 rpm pada suhu 4ºC selama 5 menit. Etanol dibuang, pelet dikeringkan selama 15 menit dalam vakum, kemudian dilarutkan dalam 50 µl air steril.
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan teknik PCR berdasarkan metode Rojas et al.(1993) menggunakan primer universal begomovirus yaitu PAL1v 1978 (5’GCATCTGCAGGCCCACATYGTCTTYCCNGT3’) dan PAR1c 715 (5’GAT TTCTGCAGTTDATRTTYTCRTCCATCCA3’) yang dirancang berdasarkan pembandingan sekuen DNA beberapa begomovirus pada daerah genom yaitu gen yang menyandikan protein untuk replikasi dan protein selubung (Gambar 3.1). Setiap reaksi PCR (25 µl) terdiri atas 5 µl DNA, 0.5 µl masing-masing primer, 1. 5 unit Taq polymerase, Tris-HCl 10 mM (pH 9.0), KCl 50 mM, MgCl2 1. 5 mM,
setiap dNTP 200 µM (Amersham Pharmacia Biotech). Amplifikasi DNA dilakukan sebanyak 30 siklus yang melalui tiga tahapan yaitu pemisahan utas DNA pada 94°C selama 1 menit, penempelan primer pada 55°C selama 2 menit dan sintesis DNA pada 72°C selama 2 menit (Rojas et al. 1993). Khusus untuk
46 siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 10 menit, kemudian siklus berakhir dengan suhu 4°C.
Fragmen DNA hasil amplifikasi PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1% dalam bufer Tris-borate EDTA (TBE) 0.5 X dengan tegangan 75 volt (Maniatis et a l. 1989) dan diamati dengan UV transiluminator setelah diberi pewarna dengan etidium bromida.
Gambar 3.1 Posisi penempelan primer PAL1v 1978 dan PAR1c 715 pada genom begomovirus. V1: gen penyandi pembentukan
protein selubung virus, penularan malalui serangga vektor dan pergerakan virus di dalam inangnya; V2: gen yang menyandi protein pergerakan virus dalam tanaman yang terinfeksi, C1: gen penyandi protein replikasi, C2: gen penyandi protein transactivating (TrAP), C3: gen penyandi pembentukan
protein replication enhancer (REn), C4: gen penyandi ekspresi gejala
Analisis Pola Pemotongan DNA oleh Enzim Restriksi (PCR-RFLP)
Hasil amplifikasi PCR dipotong dengan menggunakan empat enzim restriksi (HindIII, PstI, EcoRI dan BamHI ). Reaksi pemotongan DNA dengan enzim restriksi terdiri atas: 10 µl DNA hasil amplifikasi dengan PCR, 1.5 µl bufer enzim restriksi (10X), 1 µl enzim restriksi (1 unit/1µl), dan akuabidest ditambahkan sehingga volume akhir menjadi 15 µl (Maniatis et al. 1989). Setelah inkubasi pada 37ºC selama 1-2 jam, hasil pemotongan DNA di visualisasi secara elektroforesis pada gel agarosa 1.5% dengan menggunakan buf er TBE 1X.
PAR1c715 PAL1v1978
47
Analisis Hubungan Keke rabatan Antar Isolat Begomovirus
Analisis hubungan kekerabatan dilakukan dengan membandingkan isolat- isolat begomovirus yang menyerang tanaman tomat yang telah dikumpulkan dalam penelitian ini dan juga dilakukan pembandingan dengan isolat begomovirus tomat hasil penelitian Sudiono et al. (2004). Analisis dilakukan berdasarkan pola enzim restriksi (RFLP) dengan menggunakan program komputer NTSYST versi 2.1 melalui analisis Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) dengan koefisien Euclidean (Rohlf 2000).
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian
Pengumpulan populasi B. tabaci dilakukan dari beberapa jenis tanaman di sekitar pertanaman tomat di Jawa Barat dan Jawa Timur. Perbanyakan serangga dan pengujian kemampuan menginduksi daun labu menjadi keperak-perakan di lakukan di rumah kaca Vir ologi kebun percobaan Cikabayan, Darmaga, Bogor, sedangkan analisis molekuler dilaksanakan di laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, IPB. Penelitian dilaksanakan dari Juni 2003-Juni 2004
Pengumpulan dan perbanyakan B. tabaci
Pengumpulan kutukebul yang merupakan vektor begomovirus dilakukan dengan cara penangkapan langsung imago pada tanaman tomat (Lycopersicon esculentum), mentimun (Cucumis sativus), brokoli (Brassicae juncea), terong (Solanum melongena), edamame (Glycine max), kedelai (Glycine max) dan cabai (Capsicum annuum). Perbanyakan kutukebul yang berasal dari lapangan dilakukan dengan cara memelihara serangga tersebut dalam kurungan serangga. Pertama-tama masing-masing kutukebul tersebut diberi kesempatan meletakkan telur pada tanaman brokoli yang bukan inang begomovirus, kemudian tanaman yang diperkirakan telah mengandung sejumlah telur serangga dipindahkan ke kurungan serangga yang telah berisi brokoli atau tanaman asal kutukebul ditemukan.
Identifikasi Kutukebul
Identifikasi spesies kutukebul dilakukan dengan cara membuat preparat puparium dengan metode Martin (1987). Puparium kutukebul dikumpulkan dalam tabung reaksi yang berisi alkohol 80%. Selanjutnya ditambahkan potassium hydroxide (KOH) 10%, kemudian tabung reaksi dipanaskan pada suhu 90°C hingga kantong pupa menjadi transparan. Selanjutnya puparium dipindahkan ke gelas arloji. Gelas arloji ditutup setelah ditambahkan beberapa tetes asam asetat glasial dan alkohol absolut, kemudian digoyang-goyang selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan carbol xylene dan dibiarkan hingga kantong
pupa bersih dengan sempurna. Larutan dibuang dan ditambahkan beberapa tetes asam asetat glasial dan pewarna asam fuchsin, diinkubasi selama 5 menit. Kemudian larutan dibuang dan ditambahkan asam asetat glasial, digoyang-goyang selama beberapa menit. Setelah itu larutan dibuang dan ditambahkan 3 tetes minyak cengkeh. Setelah diinkubasi selama 5 menit, puparium tersebut dipindahkan ke atas gelas obyek yang telah ditetesi minyak cengkeh. Setelah itu minyak cengkeh dibuang secara hati-hati menggunakan kertas tissue dan canada balsam diteteskan pada puparium dan ditutup dengan gelas penutup kemudian dikeringkan di atas pemanas. Identifikasi dilakukan di bawah mikroskop fase kontras dengan menggunakan kunci identifikasi Martin (1987).
Uji B. tabaci Biotipe B Menggunakan Tanaman Indikator
Untuk melihat keanekaraga man populasi B. tabaci yang ditemukan, maka dilakukan uji kemampuan masing-masing serangga dalam menginduksi daunlabu menjadi keperak-perakan menggunakan metode Yokomi et al. (1990). Sebanyak 100 imago B. tabaci dari tiap-tiap populasi diinfestasikan seca ra terpisah ke tanaman labu (C. pepo DC.Var. Blackjack) yang mempunyai dua hingga tiga daun. Imago dibiarkan selama 3 hari untuk meletakkan telur, kemudian imago dimatikan dan tanaman yang terinfestasi telur dipelihara untuk diamati perkembangan daunnya. Sebagai kontrol digunakan tanaman labu yang tidak diinfestasi imago B. tabaci. Pengujian diulang masing-masing sebanyak 3 kali.
Kajian Keanekaragaman Kutukebul dengan Teknik PCR -RAPD
Imago kutukebul B. tabaci hasil perbanyakan yang telah diidentifikasi digunakan sebagai bahan analisis. Ekstraksi total DNA kutukebul dilakukan menggunakan serangga tunggal dengan metode Goodwin et al. (1994). Serangga ditempatkan pada tabung ep pendorf dan ditambahkan ke dalamnya 125 µl bufer ekstraksi CTAB [CTAB 2%, NaCl 1. 4 M, Tris-HCl 100 mM, EDTA 20 mM dan Polyvinylpyrrolidone (PVP-40) 1%]. Serangga digerus dengan pistil mikro plastik, divorteks dan diinkubasi pada 65°C selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 125 µl kloroform : isoamil alkohol (24:1) dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 20 menit sebelum disentrifugasi pada 800 rpm selama 5 menit.
Supernatan dipindahkan (90 µl) pada tabung baru dan ditambahkan 10 µl NaOAc 3 M (pH 5.2) dan 250 µl etanol absolut (-20°C) kemudian diinkubasikan selama 30 menit pada suhu –20°C. Supernatan dibuang setelah sentrifugasi 11500 rpm selama 15 menit. Pelet dicuci dengan 200 µl etanol 70% (-20°C) dan disentrifugasi pada 11500 rpm selama 2 menit. Etanol dibuang kemudian pelet dikeringkan di dalam pompa vakum selama 10 menit selanjutnya pelet diresuspensi dengan 10 µl air steril.
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan teknik PCR berdasarkan metode Gawel & Bartlet (1993). Seleksi primer dilakukan terhadap B. tabaci biotipe B dan Biotipe Q (berasal dari Department of Virus Research, Colney L, John Innes Centre, Norwich, UK) menggunakan 11 primer yaitu OPA 8, OPA 11, OPA 13, OPA 15, OPA 17 (Invitrogen), Primer 1, Primer 2, Primer 3, Primer 4, Primer 5, Primer 6 (Amershams Pharmacia) (Tabel 4.1). Primer yang dapat membedakan antara kedua kutukebul tersebut akan digunakan dalam analisis keanekaragaman kutukebul yang dikumpulkan dari beberapa tanaman.
Setiap reaksi PCR (25 µl) terdiri atas 5 µl DNA templet, 1µl primer random (10 µM), Taq polymerase, Tris-HCl 10 mM (pH 9.0), KCl 50 mM, MgCl2
3 mM, setiap dNTP 400 µM (Amersham Pharmacia Biotech). Amplifikasi DNA dilakukan sebanyak 45 siklus yang melalui tiga tahapan yaitu pemisahan utas DNA pada 92°C selama 1 menit, penempelan primer pada 35°C selama 1 menit dan sintesis DNA pada 73°C selama 2 menit (Gawel & Bartlett 1993). Khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 7 menit, kemudian siklus berakhir dengan suhu 4°C.
Fragmen DNA hasil amplifikasi PCR dielektroforesis pada gel agarosa 2% dalam bufer TBE 1X dengan tegangan 60 volt dan diamati dengan UV transiluminator setelah diberi warna dengan etidium bromida (Maniatis et al. 1989) .
Tabel 4.1 Primer random yang digunakan untuk seleksi primer PCR-RAPD
Primer Sekuen (5’– 3’) Sumber
OPA 8 GTGACGTAGG
OPA 11 CAATCGCCGT