OPA 15 TTCCGAACCC OPA 17 GACCGCTTGT
Invitrogen Life Technologies®
P1 GGTGCGGGAA P2 GTTTCGCTCC P3 GTAGGCCCGT P4 AAGAGCCCGT P5 AACGCGCAAC P6 CCCGTCAGCA Amershams Biosciences®
Analisis Keanekaragaman B. tabaci
Pola pita DNA hasil PCR-RAPD digunakan untuk mempelajari keanekaragaman B. tabaci yaitu melalui program Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (NTSYS) versi 2.1 dengan metode pengelompokan Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) dan jarak euclidean (Rohlf 2000)
Amplifikasi Gen COI dengan Teknik PCR
DNA hasil ekstraksi juga digunakan untuk PCR yang dilakukan berdasarkan metode Frohlich et al. (1999) menggunakan sepasang primer yang mengamplifikasi gen cytochrome oxidase I (COI) yang ada pada mitokondria yaitu C1-J-2195 MTD-10 (5’ TTG ATT TTT TGG TCA TCC AGA AGT 3’) dan L2-N-3014 MTD-12 (5’ TCC AAT GCA CTA ATC TGC CAT ATT A 3’). Setiap reaksi PCR (25 µl) terdiri atas 5 µl DNA templet, 0.5 µl masing-masing primer, 1.5 unit Taq polymerase, Tris-HCl 10 mM (pH 9.0), KCl 50 mM, MgCl2
1.5 mM, setiap dNTP 200 µM (Biolab). Amplifikasi DNA dilakukan sebanyak 30 siklus yang melalui tiga tahapan yaitu pemisahan utas DNA pada 95°C selama 1 menit, penempelan primer pada 52°C selama 1 menit dan sintesis DNA pada 72°C selama 1 menit (Frohlich et al. 1999). Khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 5 menit, kemudian siklus berakhir dengan suhu 4°C.
Fragmen DNA hasil amplifikasi PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1% dalam bufer Tris-borate EDTA (TBE) 0. 5 X dengan tegangan 75 volt (Maniatis et
a l. 1989) dan diamati dengan UV transiluminator setelah diberi pewarna dengan etidium bromida.
Sekuensing Gen COI
Fragmen DNA hasil amplifikasi selanjutnya disekuensing untuk melihat susunan DNA masing-masing populasi B. tabaci. Sekuensing dilakukan di Lembaga Eijkman, Jakarta menggunakan mesin sekuensing ABI-Prim 377A dan PT. Charoen Pokphand Indonesia, Tbk, Jakarta menggunakan ABI-Prism 3100- Avant Genetic Analyzer
Analisis Filogene tik
Hasil sekuensing gen CO1 selanjutnya dianalisis tingkat kesamaannya menggunakan program ClustalW version 1.82 dari European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) (http://www.ebi.ac.uk/serve/clustalW ).
Analisis kekerabatan dilakukan terhadap populasi B. tabaci yang ditemukan dan dibandingkan dengan sekuen gen COI B. tabaci lain yang ada di GeneBank (Tabel 4.2). Analisis filogenetik dan jarak genetik dilakukan menggunakan program PAUP version 4.0b for 32-bit Microsoft Windows berdasarkan pendekatan UPGMA (Swofford 2001).
Tabel 4.2 Lokasi geografi, biotipe, nomor asesi sekuen gen COI pada GeneBank dan tanaman inang B. tabaci
Lokasi geografi Biotipe No.asesi GEN COI (EMBL) Tanaman Inang Akronim Maroko B AJ 517768 - MarB Maroko :Algeria, Biskra
Q AM176575 Cucurbita sp. Marc-Ccr
Maroko : Alger Q AM176574 - Marc-Q
Maroko : Biougra Q AM176573 Lycopersicum
esculentum
Marc-Les
Perancis : Antibe B AJ550169 Solanum
melongena Fran-Smel France:Golles Houts MS AJ550179 Euphorbia pulcherrima Fran-Ep
Seychelles: Mahe MS AJ550182 Jatropha sp Sey-Jat
Italia Non B AY827599 E. characias Itl-Ec
Israel:Tel Aviv B AF418671 Brassica
oleyracea
Israel-Cabb
Lanjutan Tabel 4.2 Geografi
Lokasi
Biotipe No. asesi mtCOI (EMBL)
Tanaman Inang Akronim
Pakistan:Punjab Non B AJ510061 S. melongena Pak-Smel
Tucson, Arizona B AY057123 E. pulcherrima Ariz-Pst
Argentina Non B AF340213 Phaseolus
vulgaris
Arg-Bn
Meksiko:Sinaloa Non B DQ130059 L. esculentum Mex-Les
Guatemala: Chili
Non B AY057132 - Guatemala
Panama Non B DQ130061 E. heterophylla Pan-Eh
Puerto Rico Non B AY057134 Sida sp. PR-Sida
Colombia:Cali A AJ550168 Chromolaena
odorata
Colb-Co
Mesir B DQ130056 L. esculentum Egypt-Les
Cina: Henan B AY686090 L. esculentum China-Les
Cina: Zhejiang, Jiande
Non B AJ867557 I. batatas China-Ip
Cina Non B AF342777 G. herbaceum China-Ctn
Malaysia Non B AY057137 Malva sp Malay-
Malva
Kuala Lumpur Non B AY686095 Hibiscus
Rosa -sinensis
Malay-Hrs
Singapura Non B AY686095 G. herbaceum Sgpr-Ctn
Thailand Non B AF164673 Cucumber
sativus
Thai-Ccbr Jepang:Hiroshim
a, Fukuyama
Non B AB240967 Lonicera
japonica
Japan-Lj
Turki Non B AY827616 G. hirsutum Tur-CtnA
Turki Non B AF342776 G. hirsutum Tur-CtnB
Turki Non B AY827619 L. esculentum Tur-Les
India: Madras Non B DQ116660 I. batatas India-Ip
Kamerun Non B AF344245 Manihot
utilissima
Cam-Cass
Kenya Non B DQ130057 M. utilissima Ken-Cass
Uganda: Namulonge
Non B AY903577 I. batatas Ugd-Swp
Uganda: Namulonge
Non B AY903574 Cucurbita mixta Ugd-Pk
Uganda: Namulonge B AY903570 Abelmoschus esculentus Ugd-Okra Perancis Trialeurodes vaporariorum
AJ550183 L. esculentum TVA
Uganda: Namulonge
Lanjutan T abel 4.2 Geografi
Lokasi
Biotipe No. asesi mtCOI (EMBL)
Tanaman Inang Akronim
Meksiko: Nay Non B DQ130058 Parthenium
hysterophanus
Mex-Ph Uganda:
namulonge
106
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di rumah kaca Virologi kebun percobaan Cikabayan, Darmaga, Bogor dari September 2004 – Juni 2005.
Perbanyakan Serangga Vektor
Serangga vektor yang digunakan untuk uji penularan merupakan B. tabaci yang berasal dari lokasi dan tanaman inang yang berbeda (Tabel 5.1).
Tabel 5.1 Biotipe B. tabaci yang digunakan dalam uji penularan tiga strain begomovirus
Kode populasi
Asal tanaman inang
Asal lokasi Biotipe BtBsBJB Brokoli Baranangsiang, Bogor, Jawa
Barat
B BtCkBJB Cabai Cikabayan, Dramaga, Bogor,
Jawa Barat
Non B BtKKJT Terung Kencong, Kediri, Jawa timur Non B
Populasi B. tabaci tersebut diidentifikasi berdasarkan kemampuan menginduksi daun labu menjadi keperak-perakan, analisis PCR-RAPD dan sekuen gen COI (BAB IV ). Perbanyakan masing-masing populasi dilakukan dengan cara memelihara serangga tersebut dalam kurungan serangga. Serangga diberi kesempatan meletakkan telur pada tanaman brokoli, kemudian tanaman yang diperkirakan telah mengandung sejumlah telur serangga dipindahkan ke kurungan serangga baru yang telah berisi tanaman brokoli atau kapas berturut- turut untuk B. tabaci biotipe B dan biotipe non B. Setelah beberapa hari akan terbentuk imago baru yang merupakan imago yang bebas virus dan dapat digunakan sebagai serangga vektor. Serangga yang bebas virus tersebut digunakan untuk studi penularan terhadap tiga strain begomovirus
Perbanyakan Sumber Inokulum
Begomovirus yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari tanaman tomat yang terinfeksi di daerah Kaliurang, D.I. Yogyakarta (GVPSlm), Boyolali, Jawa Tengah (GVABy) dan Bogor , Jawa Barat (GVCBgr). Hasil identifikasi menggunakan teknik PCR-RFLP membuktikan bahwa ketiga strain begomovirus tersebut merupakan strain yang berbeda (BAB III). Ketiga strain begomovirus
107 tersebut diperbanyak pada tanaman tomat kultivar Arthaloka melalui penularan dengan serangga vektor dan dua bulan setelah inokulasi tanaman digunakan sebagai sumber inokulum.
Studi Karakteristik Hubungan Strain Begomovirus dengan Serangga Vektor B. tabaci
Untuk mempelajari kemampuan beberapa populasi B. tabaci dalam menularkan strain begomovirus yang berbeda, maka dilakukan beberapa percobaan terhadap periode makan akuisisi (PMA), periode makan inokulasi (PMI) dan jumlah serangga. Setiap unit percobaan terdiri atas sepuluh tanaman uji dan lima tanaman kontrol. Serangga vektor yang digunakan untuk setiap unit percobaan adalah sepuluh ekor per tanaman, kecuali pada percobaan jumlah serangga
a. Periode Makan Akuisisi
Untuk mengetahui PMA minimum B. tabaci dalam menularkan masing- masing isolat begomovirus, imago masing-masing biotipe B. tabaci diberi perlakuan periode makan pada tanaman tomat terinfeksi virus selama ¼, ½, 1 , 3 dan 6 jam, kemudian diberi perlakuan PMI selama 48 jam pada tanaman uji. Pada pengujian ini diamati jumlah tanaman yang terinfeksi pada setiap perlakuan dan masa inkubasi virus dalam tanaman. Pengamatan dilakukan sampai satu bulan setelah perlakuan.
b. Periode Makan Inokulasi
Untuk mengetahui PMI minimum B. tabaci dalam menularkan isolat begomovirus tomat serangga vektor diberi perlakuan PMI selama ¼, ½, 1 , 3 , 6, dan 12 jam pada tanaman tomat yang sehat setelah melalui perlakuan PMA selama 24 jam pada tanaman tomat yang terinfeksi. Pada pengujian ini diamati jumlah tanaman yang terinfeksi pada setiap perlakuan dan masa inkubasi virus dalam tanaman. Pengamatan dilakukan sampai satu bulan setelah perlakuan.
c. Jumlah Serangga
Untuk mengetahui jumlah minimum masing-masing biotipe B. tabaci yang mampu menularkan isolat begomovirus tomat dilakukan penularan dengan menggunakan jumlah serangga yang berbeda yaitu 1 , 3 , 5 , 10 , 15 dan 20 ekor
108 setiap tanaman. Masing-masing serangga diberi perlakuan PMA 24 jam dan PMI 48 jam. Pada pengujian ini diamati jumlah tanaman yang terinfeksi pada setiap perlakuan dan masa inkubasi virus dalam tanaman. Pengamatan dilakukan sampai satu bulan setelah perlakuan.
BAHAN DAN METODE