Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Penyakit Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret 2017 sampai dengan selesai.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah berbagai benih varietas padi yang diambil dari Balai Benih Murni Lubuk Pakam, Sang Hyang Seri (varietas Bahgendit, Mekonggah, Cidenok, Inpari 32, Inpari 30, dan Cibogo) dan beberapa benih langsung dari lahan petani kota Padang Sidempuan, Medan dan Binjai (Ciherang, Paktiwi, Thailand, Sintanur, Arias, IR64, IR64 Ciherang, Inpari Cidenuk, dan Mekonggah) media selektif Potato Peptone Glucose Agar (PPGA) + 0.1 % CaCl2 (Matsuda et al.,1988), media King’s B, media NA, Nutrient Broth, alkohol 70%, aquades, kristal violet, iodine, etil alkohol, safranin, reagen oksidase (Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride), media Oksidatif-Fermentatif (Hugh dan Leifson) (Schaad et al., 2001), media pati agar (Schaad et al., 2001), media garam mineral Ayers et al mineral salts medium (IRRI, 1994), media inositol, media Simmon’s Citrate Agar (SCA), reagen asam sulfanilat, larutan α-napthylamine, clorox, larutan sodium klorida, larutan Phosphat Buffer Saline (PBS), type strain B. glumae (DSM 9512T
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah ini adalah cawan petri, beaker glass, timbangan analitik, jarum inokulasi, lampu bunsen, pipet tetes, batang pengaduk, tabung Erlenmeyer, tabung reaksi, Laminar Air Flow Cabinet
) yang berasal dari DSMZ Culture Collection Jerman, label dan bahan lainnya yang mendukung.
(LAFC), autoklaf, water bath, mikroskop compound, rotary shaker, gunting, handsprayer, tali pengikat, saringan nilon, camera, printer, dan alat lainnya yang mendukung.
Metode Penelitian
Metode penelitian yang dilakukan adalah deskriptif dengan cara pengisolasian bakteri yang terdapat pada benih varietas padi.
Pelaksanaan Penelitian Pengambilan Sampel Benih
Pengambilan sampel benih dilakukan di beberapa tempat berbeda. Sampel diambil secara acak sebanyak 500 gram dari balai benih murni Lubuk Pakam, dan balai Sang Hyang Seri, sedangkan sampel dari lahan masyarakat dari kota Padang Sidempuan, Medan, Binjai dan langkat diambil berdasarkan pengamatan gejala visual dilapangan. Masing-masing sampel benih dimasukkan dalam plastik potilen dan diberi label sebagai penanda varietas (nama varietas, lokasi dan tanggal pengambilan) selanjutnya sampel dibawa ke laboratorium untuk dianalisis.
Ekstrasi, Isolasi, dan Purifikasi Sampel Benih
Masing-masing sampel varietas benih yang telah diambil dimasukan ke dalam saringan nilon mesh (secara individu) lalu saringan nilon diikat dengan tali untuk mengamankan benih. Sampel ditempatkan di dalam wadah (plastik atau kaca), dan wadah harus memungkinkan sampel untuk "bergerak". Wadah selanjutnya ditutup dengan saringan nilon dan diikat dengan karet gelang untuk mengamankan sampel didalamnya. Kemudian sampel benih sebanyak 25 g dicuci di bawah air mengalir selama 30 menit dan dikeringkan pada kertas tissue steril, lalu sampel benih dipindahkan ke dalam 50 ml larutan phosphat buffer saline
(PBS). Selanjutnya sampel benih dihancurkan dengan menggunakan mortar steril dan alu hingga 80% dari benih hancur. Suspensi bakteri dibiarkan pada suhu ruang (25-28 °C) selama 1 jam, lalu suspensi dishaker selama 2 jam agar bakteri dapat membelah pada tahap yang dapat dideteksi. Suspensi selanjutnya diisolasi dengan metode serangkaian pengenceran berseri 10-1 hingga 10-8 menggunakan larutan sodium klorida steril (0,85% NaCl). Suspensi diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml larutan garam steril sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran tahap 10-1 lalu di-vortex selama 5 menit, demikian seterusnya sampai dengan pengenceran 10-8. Kemudian masing-masing 0.1 ml suspensi yang berasal dari pengenceran 10-6, 10-7, dan 10-8
Uji Karakteristik Morfologi dan Biokimia
dipindahkan ke dalam cawan petri yang berisi media selektif PPGA dan digores secara merata ke seluruh permukaan agar dengan jarum inokulasi steril, lalu cawan petri diinkubasi pada suhu 28° C selama 2-3 hari (IRRI, 1994). Selanjutnya dipilih koloni tunggal yang seragam kemudian dipindahkan ke media King’s B ke dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu 28°C selama 2-3 hari. Koloni tunggal yang sudah murni selanjutnya digores pada tabung miring yang berisi media King’s B.
Karakteristik morfologi diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1.000 kali untuk melihat bentuk bakteri melalui pewarnaan gram. Uji biokimia dilakukan untuk mengidentifikasi yang mengacu pada Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition ( Holt et al., 1994 ).
Uji Morfologi Koloni (warna, bentuk, elevasi, margin)
Isolat bakteri ditumbuhkan pada media King’s B selama 48 jam dan diamati karakter morfologi masing-masing isolat yang meliputi warna, bentuk koloni, elevasi, dan tepi koloni.
Uji Pigmentasi
Uji pigmentasi dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat bakteri yang berumur 24 jam pada medium King’s B, kemudian diinkubasi selama 72 jam.
Reaksi positif terjadi apabila isolat bakteri menghasilkan pigmen pendar fluor ketika diamati dibawah sinar UV (Schaad et al., 2001).
Uji Pewarnaan Gram
Pengamatan sel bakteri dilakukan dengan meneteskan 1 tetes aquades pada kaca preparat ditambahkan 1 ose isolat, lalu difiksasi diatas api. Selanjutnya bakteri diwarnai dengan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, kemudian ditetesi iodine, dibiarkan selama 1 menit dan kembali dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya bakteri ditetesi etil alkohol dan dibiarkan selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir dan ditambahkan safranin kemudian dibiarkan selama 30 detik lalu dicuci lagi dengan air mengalir. Selanjutnya kaca preparat dikeringkan dengan menggunakan kertas serap dan ditambahkan minyak emersi. Bentuk dan warna sel bakteri diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. Bakteri gram negatif berwarna merah atau merah muda dan bakteri gram positif berwarna biru atau lembayung (Schaad et al., 2001).
Uji Katalase
Pengujian aktifitas enzim katalase dilakukan dengan cara menginokulasikan satu ose koloni bakteri pada kaca preparat kemudian ditetesi
dengan larutan H2O2
Uji Oksidase
3%. Timbulnya gelembung gas menunjukkan reaksi positif terhadap uji katalase (Schaad et al., 2001).
Uji oksidase dilakukan dengan menggoreskan satu ose koloni isolat pada kertas disc yang sudah mengandung reagen oksidase. Adanya warna biru atau ungu dalam waktu 10 detik menunjukkan reaksi positif dan jika tidak ada perubahan warna maka reaksi negatif (Schaad et al., 2001).
Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) Metode Hugh dan Leifson
Menyiapkan medium Oksidatif-Fermentatif (Hugh dan Leifson) sebanyak 2 tabung reaksi untuk setiap isolat masing-masing 5 ml. Satu ose bakteri ditusukkan pada 2 medium tersebut, untuk tabung 1 ditutupi dengan minyak parafin dan tabung 2 tidak ditutupi dengan minyak parafin, kemudian masing-masing tabung diinkubasikan selama 7-14 hari dan diamati dengan melihat perubahan warna dari biru menjadi kuning baik pada tabung yang ditutupi parafin maupun yang tidak ditutupi parafin. Apabila seluruh media berwarna kuning maka isolat bakteri bersifat anaerob fermentatif (Schaad et al., 2001).
Uji Reduksi Nitrat
Bakteri yang telah berumur 24 jam diambil 1 ose dan diletakkan pada medium nitrat dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasikan selama 3 hari.
Setelah 3 hari media tersebut ditetesi dengan reagen asam sulfanilat ditambah dengan 1 ml α-napthylamine. Apabila terjadi perubahan warna medium dari kuning menjadi merah maka bakteri bersifat positif (IRRI, 1994).
Uji Hidrolisis Pati (Starch)
Uji hidrolisis pati dilakukan dengan menginokulasikan isolat pada media pati agar (Schaad et al., 2001) dalam petridis lalu diinkubasi pada suhu 28° C selama 5 hari. Hasil inkubasi kemudian ditetesi dengan larutan iodin untuk memperlihatkan terbentuknya zona berwarna disekitar koloni. Reaksi positif jika media tersebut ungu-biru dengan sedikit kuning atau zona berwarna (zona hidrolisis) sekitar atau di bawah pertumbuhan bakteri. Dalam hal ini, pati benar-benar dihidrolisis oleh bakteri. Reaksi negatif jika media dan daerah sekitar pertumbuhan bakteri berwarna biru ungu. Hal ini menunjukkan bahwa pati masih ada, dan tidak ada terjadi hidrolisis, bakteri tidak memiliki kemampuan untuk menghidrolisis pati. Hidrolisis parsial telah terjadi jika coklat kemerahan terjadi di sekitar zona pertumbuhan, menunjukkan adanya dekstrin, bakteri yang tidak mampu menyelesaikan hidrolisis pati (IRRI, 1994).
Uji Penggunaan Sumber Karbon Inositol
Untuk mempelajari kemampuan bakteri dalam mendegradasi dan memfermentasikan karbohidrat yang disertai produksi asam organik. Media garam mineral Ayer et al mineral salts medium disterilisasikan dengan cara meng-autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit. Sumber karbon ( inositol ) di-filter-sterilisasi dan ditambahkan pada media garam mineral Ayer et al mineral salts medium yang sudah disterilkan dan didinginkan (pada suhu 45° C) pada konsentrasi akhir 0,5% (berat/volume). Media dituang ke dalam piring petri dan dibiarkan menjadi padat. Isolat yang diuji digores per piring petri. Sebagai kontrol, disiapkan satu piring petri tanpa sumber karbon (inositol). Isolat diinkubasi pada suhu 28° C dan diamati pada hari ke-3, ke-7 dan ke-14. Amati
ada tidaknya pertumbuhan isolat bakteri pada media dengan kandungan inositol (IRRI, 1994).
Uji Sitrat
Uji sitrat dilakukan untuk menunjukkan bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Pengamatan uji sitrat dilakukan pada medium Simmon’s Citrate Agar (SCA) yang diinokulasikan isolat bakteri berumur 24 jam dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Sebagai pembanding disiapkan media tanpa inokulasi bakteri sebagai kontrol. Perubahan warna dari hijau menjadi biru maka bakteri bersifat positif (Lay, 1994).
Uji Patogenitas pada Umbi Bawang secara in vitro
Uji patogenitas pada umbi bawang secara in vitro dilakukan untuk mengetahui apakah isolat bakteri mampu menunjukkan patogenisitasnya pada umbi bawang. Isolat bakteri yang berumur 24 jam dipanen dan diambil suspensi nya dengan media Nutrient Broth, kemudian dilakukan dengan metode infectivity titration, yaitu dengan melukai bagian permukaan umbi bawang bombay yang sudah di sterilisasi permukaannya dimasukkan tip yang berisi 10– 20 μl suspensi bakteri (1 x 106 CFU/ml) ke bagian lubang tersebut (Schaad et al., 2001).
HASIL DAN PEMBAHASAN