Berdasarkan hasil isolasi terhadap beberapa varietas padi yang diperoleh, sebanyak 23 isolat bakteri dilakukan reisolasi beberapa kali untuk menduga adanya bakteri B. glumae didalam biji padi yang terinfeksi bakteri. Hasil yang diperoleh dari beberapa lokasi balai padi, dan pengamatan sampel tanaman sakit yang diperoleh dari lahan masyarakat di wilayah Sumatera Utara yang diamati menunjukkan gejala yang hampir sama berupa gabah dan selubung malai berwarna hitam kecoklatan, serta bulir hampa atau kosong karena B.glumae merupakan patogen tular benih sehingga menginfeksi benih serta plumula (daun pertama) selama perkecambahan biji (Gambar 1). Hal ini sesuai dengan literatur Xie et al., (2003) dan Zhu et al., (2010) yang menyatakan gejala malai dapat berupa penghambatan perkecambahan benih, hawar bibit, busuk pelepah, bunga steril, dan bulir kosong, kehampaan pada gabah dan perubahan warna bulir.
Patogen ini menginfeksi benih dan menyerang plumula melalui stomata dan luka serta berkembang biak dalam ruang interseluler dari parenkima selama perkecambahan biji.
Keadaan malai padi yang sudah banyak ditemukan bergejala bakteri hawar malai ini menunjukkan gejala yang amat serius di lapangan yang dipengaruhi praktek-praktek pertanian maupun lingkungan mikro dan makro, sehingga serangan bakteri hawar malai dapat menyebar dan meningkat pesat. Menurut Jeong et al., (2003) meskipun belum jelas mekanisme patogenitasnya, diduga hal ini terjadi karena adanya penanaman yang dilakukan pada lahan yang berdekatan
dengan pertanaman padi yang terserang B. glumae sehingga dapat terjadi infeksi silang dari tanaman padi ke tanaman di dekatnya.
Gambar 1 : Serangan bakteri hawar malai pada bulir padi di lapangan Morfologi Koloni dan Sel Bakteri
Biakan bakteri diamati sebanyak 11 isolat dari 8 varietas padi yang
berasal dari lahan masyarakat yang diperoleh mewakili 6 daerah di Sumatera Utara (Tabel 1). Sedangkan 1 isolat adalah isolat rujukan (type strain)
yang berasal dari DSMZ Culture Collection. Morfologi yang diamati meliputi bentuk koloni, warna, margin dan elevasi. Pengamatan bentuk koloni dan margin dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali, sedangkan pengamatan warna dan elevasi dilakukan secara langsung. Morfologi isolat bakteri diuraikan pada Tabel 2.
Tabel 1. Isolat bakteri yang berasal dari beberapa varietas di beberapa lokasi di No
Sumatera Utara
Kode Isolat Varietas Asal Isolat
1
Kec. Percut Sei Tuan Kec. Percut Sei Tuan Kec. Percut Sei Tuan Kec. Percut Sei Tuan Padang Sidempuan
DSMZ Culture Collection, Jerman
Keterangan: - = tidak diketahui asal varietas bakteri B. glumae
Kode Isolat
Tabel 2. Morfologi koloni isolat bakteri
Bentuk Warna Margin Elevasi
IR64M isolat bakteri memiliki bentuk bulat berwarna krim dengan margin berbentuk rata
dan datar pada elevasinya, termasuk isolat yang berasal dari DSMZ Culture Collection Jerman. Hasil morfologi koloni dilanjutkan dengan pengamatan morfologi sel bakteri dibawah mikroskop dengan perbesaran 1.000 kali setelah dilakukan pewarnaan gram. Pewarnaan gram membedakan bakteri menjadi
kelompok gram positif dengan berwarna biru dan gram negatif berwarna merah.
Uraian mengenai morfologi koloni dan sel bakteri yang diperoleh disajikan pada
Tabel 3. Morfologi koloni dan sel bakteri Tabel 3.
No Kode
isolat
Morfologi koloni dan sel
1
2
3
4
IR64M
CH BJ
TH BJ
ARS
No Kode isolat
Morfologi koloni dan sel
5
6
7
8
9
THAI
SIB
ME PRC
CIH PRC
IRC PRC
Perbesaran mikroskop 1.000 kali
Hasil pengamatan morfologi sel pada benih padi yang merujuk bakteri B. glumae berbentuk sel batang dengan jenis gram negatif, menurut
No
Saddler (1994) menyatakan bahwa B. glumae tergolong bakteri gram negatif, berbentuk batang dengan flagela polar (1-3 flagela polar), non-fuorescent. Oleh karena itu, untuk isolat bakteri yang tidak sesuai dengan kriteria B. glumae tersebut lebih dominan mengarah bakteri gram positif, berbentuk basil, dan gram negatif, berbentuk coccus yang diperoleh dari balai perbenihan padi di Kabupaten Deli
Kode isolat
Morfologi koloni dan sel
10 IC PRC
11 IRP SID
12 DSM 9512T
Serdang , kota Medan dan sekitarnya (Tabel 4) sehingga 12 isolat ini tidak diidentifikasi lebih lanjut secara biokimia..
Tabel 4. Morfologi koloni isolat bakteri non kriteria B. glumae
Uji Pigmentasi
Pengujian pigmentasi pada isolat dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada media Kings’B. Isolat bakteri yang menghasilkan pigmen pendar fluor ketika diamati dibawah sinar UV menunjukkan reaksi positif, sedangkan yang tidak menghasilkan pigmen pendar fluor menunjukkan hasil negatif. Pada hasil uji pigmentasi dari 12 isolat (termasuk DSM 9512T
No
) yang diduga bakteri B. glumae menunjukkan seluruh isolat tidak dapat menghasilkan pigmen pendar fluor
Strain
(Gambar 2). Sedangkan pigmentasi yang dihasilkan dari media agar King’s B terlihat dari 3 isolat yaitu isolat IRC PRC, IC PRC dan IRP SID yang menghasilkan pigmen hijau-kekuningan, termasuk isolat bakteri DSM 9512T. Sedangkan 8 isolat lainnya tidak menghasilkan produksi pigmen pada media King’s B.
Hal ini menunjukkan bahwa produksi pigmen yang berwarna kekuningan pada media King’s B menghasilkan toxoflavin karena adanya aktifitas toksin yang dihasilkan bakteri dapat bersifat patogen dan ganas (virulen). Menurut Kim et al., (2004) dan Jeong et al., (2003) B.glumae menghasilkan toxoflavin berpigmen kuning cerah dan fervenulin yang isomerid. Toxoflavin dan fervenulin mengakibatkan berkurangnya pertumbuhan daun dan akar pada bibit padi, dan juga menyebabkan gejala klorosis pada malai padi. Yuan (2004) menyatakan jika media selektif yang dipilih untuk B. glumae dan B. gladioli diisolasi pada medium King's B dan diamati untuk melihat bakteri memproduksi pigmen, terlihat jelas bahwa media yang menghasilkan warna pigmen kuning-hijau bersifat toksin yang patogen dan virulen.
Gambar 2: Uji pigmentasi a. Bakteri tidak menghasilkan pigmen pendar fluor (negatif) b. Bakteri memproduksi pigmen kuning pada media King’s B
a b
Sel dari genus Burkholderia memiliki kesesuaian dengan karakteristik umum bakteri Pseudomonas aerobik lainnya. Namun, pigmentasi sama sekali bukan karakter universal burkholderia. Beberapa strain B. cepacia tidak berpigmen, sementara yang lain menghasilkan pigmen phenazine dengan berbagai warna yang beragam saat ditanam pada media kimia padat yang mengandung sumber karbon yang berbeda. Strain berpigmen dari spesies lain dapat dibagi menjadi dua jenis, berdasarkan pigmentasinya ada yang berwarna kuning pada ekstrak yeast glukosa pepton agar dan berbagai pigment seperti coklat, merah, dan ungu pada Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition (Holt et al,. 1994).
Dari hasil penelitian Yuan (2004) isolat bakteri yang dikulturkan pada media King’s B tersebut juga tidak dapat menghasilkan pigmen yang non-virulen, umumnya bersifat non-patogenik dan tanpa memproduksi pigmen dari kedua spesies B. glumae dan B. gladioli yang diidentifikasi pada media. Tentunya media tersebut akan berguna bagi penelitian selanjutnya untuk menentukan apakah produksi toksin dapat dikendalikan jika karakter bakteri tersebut dapat diubah dari kondisi media yang virulen ke non virulen. Ada kemungkinan bahwa gen-gen untuk memproduksi toksin ini dibawa oleh sebuah plasmid yang biasa ditransfer antar Burkholderia spp (Yuan, 2004).
Identifikasi Bakteri
Isolat dengan potensi terbaik diidentifikasi secara biokimia. Setelah dilakukan pengamatan terhadap morfologi koloni dan sel serta uji pigmentasi, selanjutnya dilakukan uji katalase, oksidase, oksidasi-fermentatif (O-F), reduksi
nitrat, hidrolisis pati (Starch), uji penggunaan sumber karbon inositol dan uji sitrat.
Uji Katalase
Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikrobia yang tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut (Lay, 1994). Seluruh 11 isolat termasuk DSM 9512T menunjukkan hasil positif pada uji katalase, yaitu muncul gelembung udara sekitar koloni (Tabel 5 ).
Gambar 3 :Reaksi positif uji katalase, terbentuk gelembung yang ditunjukkan oleh anak panah
Uji Oksidase
Uji oksidase berfungsi untuk mengetahui adanya enzim sitokrom oksidase yang berperan dalam transport elektron pada jalur metabolisme nitrat bakteri tertentu (Amelia, 2011). Secara umum tes ini berguna untuk membedakan bakteri golongan enterik dan non enterik. Apabila berubah warna ungu kehitaman pada kertas disc yang sudah mengandung reagen oksidase menandakan reaksi positif dan jika tidak ada perubahan warna menandakan reaksi negatif (Gambar 4).
Berdasarkan hasil pengamatan terdapat 5 isolat bakteri yang diidentifikasi
menunjukkan hasil positif pada uji oksidase, dan terdapat 7 isolat yang diidentifikasi menunjukkan hasil negatif, termasuk isolat DSM 9512T
(Tabel 5).
Gambar 4 : Uji oksidase a. Reaksi positif terbentuk warna ungu pada ketas sitokrom, b. Reaksi negatif tidak terbentuk warna ungu
Uji oksidasi – Fermentasi (OF) Metode Hugh and Leifson
Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri mampu menggunakan glukosa sebagai sumber energi. Reaksi asam yang dihasilkan oleh organisme oksidatif akan terjadi pada kondisi aerob yang secara bertahap meluas ke bawah medium yaitu pada tabung yang tidak ditutup dengan parafin liquid dan tidak ada atau sedikit pembentukan asam pada tabung yang ditutupi parafin liquid.
Sedangkan fermentasi terjadi pada bakteri anaerob yaitu tabung yang ditutupi dengan parafin liquid. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning. Asam yang dihasilkan dari fermentasi akan menurunkan pH sehingga indikator media berwarna kuning. Bakteri fakultatif dapat dilihat dari terbentuknya warna kuning pada kedua tabung. Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan dengan cara menusukkan isolat bakteri kedalam 2 tabung yang berisi medium OF (Gambar 5). Setelah dilakukan penginokulasian, salah satu tabung ditutup dengan parafin liquid (IRRI, 1994).
a b
Gambar 5 : Uji oksidasi fermentasi a. Fermentasi positif, b. Oksidasi positif
Pengamatan untuk uji OF dengan membandingkan medium OF dengan atau tanpa parafin liquid yang diinokulasi bakteri terhadap medium kontrol yang berwarna hijau. Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa terdapat 5 isolat bakteri (termasuk DSM 9512T
Uji Reduksi Nitrat
) termasuk organisme oksidatif, sedangkan terdapat 7 isolat bakteri termasuk organisme fermentatif (Tabel 5). Menurut IRRI (1994) organisme oksidatif seperti Pseudomonas dan Xanthomonas memproduksi reaksi asam (hasil dari pemecahan glukosa) pada media yang tidak ditutup parafin liquid, kurangnya produksi asam pada kedua tabung menunjukkan bahwa organisme tersebut tidak mampu untuk menguraikan glukosa atau medium tidak sesuai dengan pertumbuhan organisme. Dan tidak ada perubahan warna pada tabung atau bewarna biru (menunjukkan reaksi alkali) ini mengindikasikan bahwa oksidasi maupun fermentasi tidak terjadi.
Reduksi nitrat oleh beberapa mikroorganisme anaerob fakultatif dan aerob terjadi pada kondisi tidak ada oksigen molekular, suatu proses anaerob. Pada organisme-organisme ini, respirasi anaerob merupakan suatu proses oksidatif.
Dengan proses oksidatif ini, sel menggunakan senyawa-senyawa anorganik, b
a
seperti nitrat (NO3
-) atau sulfat (SO4
-NO
) untuk memasok oksigen yang selanjutnya berperan sebagai akseptor hidrogen akhir pada pembentukan energi (Cappuccino and Sherman, 1999).
Reduksi nitrat dapat diketahui dengan menumbuhkan organisme di dalam media kaldu nitrat, media yang digunakan pada dasarnya adalah nutrient broth yang diberi tambahan kalium nitrat (KNO3) 0.1 % sebagai substrat nitrat. Selain itu, media dibuat semisolid dengan penambahan agar 0.1 %. Kondisi semisolid menghalangi difusi oksigen kedalam media sehingga mendukung persyaratan konsisi anaerob yang diperlukan untuk reduksi nitrat (Cappuccino and Sherman, 1999).
Hasil pengujian menunjukkan 9 isolat bakteri (termasuk DSM 9512T) bereaksi positif pada uji reduksi nitrat yang ditandai dengan timbulnya warna merah muda setelah ditetesi reagen asam sulfanilat + larutan α-napthylamin.
Sedangkan 3 isolat bereaksi negatif setelah ditetesi dengan reagen (Tabel 5), terbentuknya warna merah mengindikasikan adanya nitrit yang dihasilkan dari kemampuan bakteri mereduksi nitrat. Menurut Cappucino dan Sherman (1999) kemampuan organisme mereduksi nitrat menjadi nitrit ditentukan dengan menambahkan dua pereaksi: larutan A yaitu asam sulfanilat, dengan larutan B yaitu ɑ-napthylamine. Setelah reduksi, penambahan larutan A dan larutan B akan segera menghasilkan warna merah ceri (Gambar 6).
Gambar 6 : Uji reduksi nitrat a. Warna merah menunjukkan reduksi nitrat (positif), b. Tidak ada perubahan menunjukkan tidak terjadi reduksi nitrat (negatif)
Uji Hidrolisis Pati (starch)
Pati adalah suatu polimer bercabang berbobot molekul tinggi yang tersusun atas molekul- molekul glukosa yang saling terikat oleh ikatan glikosidik.
Pemecahan makro- molekul ini mula-mula membutuhkan adanya enzim ekstraseluler amilase untuk menghidrolisis pati menjadi polisakarida yang lebih pendek, misalnya dekstrin, dan akhirnya menjadi molekul-molekul maltosa.
Hidrolisis akhir pada disakarida ini, yang dikatalisis oleh maltase, menghasilkan molekul-molekul glukosa yang larut dalam air dan berbobot molekul rendah, molekul glukosa inilah yang dapat ditranspor kedalam sel dan digunakan untuk produksi energi melalui proses glikolisis (Cappuccino dan Sherman, 1999).
Uji hidrolisis pati pada bakteri menunjukkan seluruh isolat reaksi negatif yang ditandai dengan warna hitam pada area yang ditumbuhi oleh bakteri setelah ditetesi reagen iodin (Tabel 5). Menurut Cappuccino dan Sherman (1999) agar pati (agar amilum) digunakan untuk menunjukkan aktivitas hidrolisis eksoenzim.
Media yang digunakan adalah nutrient agar yang ditambah dengan pati, yang berperan sebagai substrat polisakarida. Deteksi aktivitas hidrolisis setelah periode
a b
pertumbuhan dilakukan dengan uji pati untuk menegtahui ada atau tidaknya pati didalam media. Jika ditambahkan iodin, pati akan memberikan warna biru-hitam pada media, yang mengindikasikan ketidakberadaan enzim pemecah pati dan menunjukkan hasil negatif. Jika pati telah dihidrolisis, suatu zona hidrolisis yang bening akan terlihat di sekeliling pertumbuhan organisme. Ini menandakan hasil positif (Gambar 7).
Gambar 7 : Uji hidrolisis pati (starch) menunjukkan hasil negatif Uji Penggunaan Sumber Karbon: Inositol
Bakteri memiliki kemampuan yang berbeda- beda dalam menggunakan karbohidrat untuk metabolisme. Penggunaan inositol termasuk salah satu parameter penentu pada uji fermentasi karbohidrat. Hasil akhir dari fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat mikroba, media yang digunakan, serta faktor lingkungan berupa pH dan suhu. Isolat yang diuji digores kedalam piring petri yang berisi media garam mineral Ayers at al mineral salts medium dan tambahan inisitol sebagai sumber karbon yang diuji, sebagai pembanding disiapkan juga media tanpa sumber karbon inositol. Hasil pengujian seluruh isolat yang diidentifikasi menunjukkan hasil positif pada uji penggunaan sumber karbon
Kemampuan organisme memanfaatkan sumber karbon inositol terlihat adanya pertumbuhan bakteri dalam media, sebaliknya kemampuan bakteri tanpa sumber karbon tidak menunjukkan pertumbuhan (Gambar 8). Hal sesuai dengan literatur IRRI (1994) yang menyatakan Pseudomonas syringae dan B. glumae dapat tumbuh pada sumber karbon inositol dan tidak tumbuh pada sumber karbon trehalose, Pseudomonas fuscovaginae dapat tumbuh hanya di sumber karbon trehalose, serta Pseudomonas avena tidak dapat tumbuh pada kedua sumber karbon.
Gambar 8 : Uji penggunaan karbon a. Bakteri mampu tumbuh pada sumber karbon inositol (positif), b. Bakteri tidak tumbuh pada media tanpa sumber karbon inositol (negatif)
Uji Sitrat
Menurut Lay (1994) uji sitrat digunakan untuk melihat mikrobia menggunakan sitrat sebagai satu-satu nya sumber karbon dan energi dengan menggunakan medium Sitrat agar yang berupa media padat. Simmon-Sitrat agar merupakan media sintetik dengan Na sitrat sebagai salah satunya sumber karbon, NH4+
sebagai sumber N dan bromthymol blue sebagai indikator pH. Bila mikrobia mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari
a b
medium biakan sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru.
Dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa bakteri yang diidentifikasi terdapat 7 isolat mengalami perubahan warna pada media menjadi biru termasuk isolat DSM 9512T, dan 5 isolat tidak mengalami perubahan warna (Gambar 9).
Perubahan warna mengindikasikan bakteri positif mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan sebaliknya (Tabel 5). Mengacu pada Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition (Holt et al., 1994) pemanfaatan sumber karbon pada beberapa spesies Burkholderia dalam kategori asam sitrat menunjukkan hasil positif pada spesies B. glumae.
Gambar 9 : Uji sitrat, a Bakteri mampu menggunakan sitrat (positif), b. Bakteri tidak mampu menggunakan sitrat (negatif)
Tabel 5. Hasil uji biokimia pada isolat bakteri
Kode Isolat Katalase Oksidase O-F Reduksi Nitrat
Hidrolisa pati (starch)
Penggu-naan sumber
Sitrat
a b
inositol
Uji Patogenitas pada Umbi Bawang secara in vitro
Uji patogenitas dilakukan secara in vitro sebanyak 11 isolat termasuk isolat DSM 9512T yang telah diisolasi selama masa 3 hari inkubasi pada umbi bawang bombay. Hasil pengujian menunjukkan terdapat 5 isolat bakteri dan isolat DSM 9512T menyebabkan gejala yang muncul pada umbi bawang bombay mengalami pembusukan sehingga isolat bersifat patogen pada umbi bawang bombay, sedangkan 6 isolat bakteri tidak ada tanda terjadi pembusukan pada umbi bawang bombay (Gambar 10). Pada penelitian Aflaha et al., (2017) menyatakan teknik identifikasi cepat, akurat dan sederhana bakteri B.glumae pada tanaman padi dapat dilakukan dengan uji patogenitas pada umbi bawang, terjadinya gejala pembusukan pada potongan umbi bawang memberi bukti yang lebih menyakinkan
akan keberadaa bakteri B.glumae pada padi. Uji patogenitas secara in vitro pada umbi bawang diuraikan pada tabel 6.
Gambar 10 : a. Umbi mengalami pembusukan (positif), b.
Umbi tidak mengalami pembusukan (negatif)
Tabel 6. Uji Patogenitas pada Umbi Bawang secara in vitro
No Kode isolat Asal isolat Uji patogenitas pada umbi Bawang Kec. Percut Sei Tuan Kec. Percut Sei Tuan Kec. Percut Sei Tuan P.Sidempuan
Berdasarkan hasil identifikasi morfologi sel, morfologi koloni, dan uji biokimia pada 12 isolat bakteri termasuk bakteri pembanding B.glumae DSM 9512T dapat disimpulkan bakteri yang teridentifikasi B.glumae mengarah pada isolat CH BJ, IRC PRC, dan IC PRC. Hasil menunjukkan bahwa sel berbentuk
a b
batang, bersifat gram negatif, oksidasi aerob, warna koloni krim, positif terhadap uji katalase, penggunaan sumber karbon inositol, dan sitrat dan positif patogenitas pada umbi bawang secara in vitro, Sedangkan untuk uji oksidase dan reduksi nitrat pada beberapa literatur isolat B. glumae menunjukkan hasil yang bervariasi (Holt et al., 1994). Walaupun isolat TH BJ dan ARS menunjukkan patogenitas pada umbi bawang secara in vitro, tetapi dari hasil uji biokimia isolat bakteri termasuk fermentatif anaerob, positif katalase, reduksi nitrat, penggunaan sumber karbon inositol, tetapi hasil uji oksidase dan sitrat bervariasi.