Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi SEAFAST Centre, Laboratorium Biokimia Pangan dan Laboratorium Kimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB pada bulan Februari hingga Juli 2010.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun mengkudu (Morinda citrifoliaL.) dengan 2 tingkat ketuaan yaitu daun pangkal berwarna hijau tua dan daun pucuk yang berwarna hijau agak muda (Gambar 1). Bahan kimia diantaranya Na asetat (Merck), asam asetat (Merck), EDTA (Amersham Biosciences), gliserol (Bio Basic Inc), polivinilpirolidon (PVP K 30), , β-mercaptoetanol (Bio Basic Inc), es batu, akuades, akuabides (Ikapharmindo Putramas), silika gel 60 H (Merck), ammonium sulfat (Merck), etanol (Merck), asam fosfat (Merck), asam borat (Amersham Biosciences), boraks (Merck), kasein (Merck), NaOH (Merck), HCl (Merck), tirosin (Merck), TCA (Merck), Na sulfit (Merck), asam sulfat (Merck), CaCl2 (Merck), Na2CO3 (Merck), pereaksi folin ciocalteau (Sigma Aldrich), marker BM rendah (Fermentas SM-0431), yaitu beta galaktosidase 116kDa, bovin serum albumin 66.2kDa, ovalbumin 45kda, laktat dehidrogenase 35kDa, RE ase Bsp 25kDa, beta laktoglobulin 18.4kDa dan lisozim 14.4kDa, akrilamid (Applichem), buffer tris-HCL (Amersham Biosciences-Merck), SDS (Bio Basic Inc), TEMED (N,N,N,N-tetrametilenetilen-diamina), APS (ammonium persulfat), bromophenol blue, BSA serta kasein Hammerstein (Merck), bromophenol blue(Bio Basic Inc), Coomassie Brilliant Blue R-250 (Applichem), Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio Basic Inc).
Peralatan yang digunakan adalah hand blender Aletta A746, sentrifus Hermle Z383K, oven, neraca analitik, seperangkat alat elektroforesis gel mini protean 3 sel (Biorad), kantong dialisis Sigma D9652, freezer, spektrofotometer UV-Vis, Shimadzu seri UV-2450,Quantity one(Biorad), penangas air, pengaduk magnetik, tabung eppendorf, pipet mikro dan alat-alat gelas.
Daun mengkudu ↓
Penyortasian ↓
Pengering-anginan→ analisa proksimat ↓
Penambahan buffer sodium asetat pH 5 ( 5mM EDTA, 14mM 2- mercaptoetanol, 10% PVPP dan 10% gliserol (daun :buffer = 1:5 ; berat daun
10g) ↓
Penggilingan menggunakan blender (4 kali @ 15detik pada kecepatan tinggi) ↓
Penyaringan→Ampas ↓
Sentrifugasi filtrat pada 3775g (4oC), 30 menit→Ampas ↓
Supernatan (Ekstrak enzim kasar) * ↓
Penambahan silika gel 60 H 1.4%, divorteks 5 menit ↓
Sentrifugasi 3775g (4oC), 15 menit→Ampas ↓
Supernatan(Ekstrak Silika) * ↓
Penambahan ammonium sulfat 100% jenuh,diaduk denganmagnetic stirrer,30 menit
↓
Sentrifugasi 1972g (4oC), 30 menit →Supernatan* ↓
Endapan* ↓
Pelarutan dalam jumlah pelarut minimal ↓
Dialisis ↓ Dialisat*
↓
Elektroforesis SDS-PAGE, Zimogram ↓
Pendugaan Kelas Protease Gambar 3. Garis besar kerja penelitian
Ket: *Analisa kadar protein (Bradford, 1976) ) dan aktifitas protease (Bergmeyer dan Grassl, 1983)
Pemurnian Enzim
Tahap pemurnian enzim meliputi ekstraksi enzim kasar, penambahan silika, pemekatan menggunakan garam ammonium sulfat jenuh, dialisis serta fraksinasi enzim menggunakan Sodium Dodecil Sulfat Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dan zimogram untuk mengetahui bobot molekul enzim protease.
Penelitian ini menggunakan buffer asetat pH 5, dicampur dengan EDTA 5mM, Polyvinyl pyrrolydone (PVP K 30) 10%, gliserol 10% dan β- merkaptoethanol 14mM. Buffer yang diperlukan untuk ekstraksi disiapkan pada hari yang sama dengan hari ekstraksi.
Sampel daun (10g) dipotong-potong dan ditambah buffer ekstraksi bersuhu 4oC (daun : buffer ekstraksi = 1 : 5), kemudian diblender dengan kecepatan tinggi (4 x 15 detik) dengan wadah yang dikelilingi oleh es batu, selanjutnya disaring menggunakan kain saring (2 lapis) dan filtrat disentrifus dingin 4oC 3775g (5900 rpm) selama 30 menit sehingga dihasilkan supernatan ekstrak enzim kasar. Supernatan yang didapat ditambah dengan silika 1,4% dan divorteks selama 5 menit dan disentrifus 4oC pada 3775g (5900 rpm) selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan adalah ekstrak hasil penambahan silika (ekstrak silika).
Supernatan yang didapat selanjutnya diendapkan menggunakan ammonium sulfat 100% jenuh. Ammonium sulfat yang ditambahkan 100% dengan tujuan untuk mengendapkan semua protein yang ada. Endapan enzim dipisahkan menggunakan sentrifus dingin 4oC 1972,2g (3500 rpm). Endapan enzim selanjutnya didialisis menggunakan kantung dialisis atau membran selulosa Sigma seri D9652 dengan diameter 21mm, panjang 10cm.
Sebelum melakukan dialisis, kantung selulosa dipersiapkan terlebih dahulu. Sepanjang 10cm kantung dialisis dicuci dengan air mengalir selama 3-4 jam, kemudian direndam dalam larutan Na sulfit 0.3% selama 1 menit pada suhu 80oC. Kantung dialisis dicuci menggunakan air bersuhu 60oC selama 2 menit dan diasamkan dengan larutan asam sulfat 0,2%. Sisa asam dihilangkan dengan cara membilas kantung dialisis menggunakan air bersuhu 60oC. Dialisis endapan enzim dilakukan selama 5 jam dengan wadah dikelilingi dengan es batu. Setiap 1 jam buffernya diganti dan selanjutnya sampel difraksinasi dengan SDS-PAGE dan
zimogram untuk mengetahui bobot molekul protease (Bollag dan Edestein, 1991).
Setiap tahap pemurnian diukur massa yang masuk dan massa keluar dan massa yang hilang (Gambar 4). Kehilangan massa terbesar terjadi pada saat pemblenderan dan penyaringan karena ampas tertinggal di dalam blender dan kertas saring.
Pengamatan Kadar Air (AOAC, 1999)
Sejumlah sampel (1-2g) dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105oC hingga diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan berdasarkan berat basah dengan menggunakan rumus :
Kadar air ( %b/ b) = a − b
c × 100%
Dimana :
a = berat cawan dan sampel awal (g) b = berat cawan dan sampel akhir (g) c = berat sampel awal (g)
Kadar Protein (AOAC, 1999)
Sejumlah sampel (100-250mg) ditimbang ke dalam labu Kjeldahl. Kemudian ditambahkan 1.9 ± 0.1g K2SO4, 40 ± 10mg HgO dan 2 ± 0.1ml H2SO4. Sampel dididihkan selama 1-1.5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan menjadi jernih, lalu didinginkan. Sejumlah kecil akuades diteteskan secara perlahan lewat dinding labu kemudian labu digoyang pelan agar kristal yang terbentuk larut kembali. Isi labu kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas 5-6 kali dengan 1-2ml akuades. Selanjutnya ditambahkan 8-10ml larutan 60% NaOH-5% Na2S2O3ke dalam alat destilasi. Erlenmeyer yang berisi 5ml H3BO3 dan 2 tetes indikator metilen red-metilen blue diletakkan di bawah kondensor dengan kondisi ujung kondensor terendam di bawah larutan H3BO3.
Gambar 4. Diagram Neraca Massa selama Tahapan Pemurnian (DM : daun pucuk, DT : daun pangkal)
Pemblenderan dan penyaringan Sentrifugasi Pengendapan Daun mengkudu DM :10g; DT:10g Buffer asetat pH 5 DM : 50g; DT: 50g Ampas DM: 3.30g; DT:3,57g Filtrat DM:49.21g; DT:48.49g Ampas DM:1.70g; DT:1.63g
Garam ammonium sulfat DM:21.46g; DT:21.06g Dialisis Dialisat Ekstrak kasar DM:46.66g;DT:46.03g Endapan DM:6.92g; DT:7.42g Hilang (loss) DM:7.49g; DT:7.94g Hilang (loss) DM:0.71g; DT:2.86g Hilang (loss) DM:4.81g; TK4:5.36g Sentrifugasi DM:2.82g; DT:2.91gAmpas Hilang (loss) DM: 2.17g; DT:2.26g Ekstrak silika DM:42.30;DT:41.5 DM:17.8mL; DT:17.5mL Silika 1.4% DM:0.63g; DT:0.64g Supernatan DM:52.03g; DT:49.78g
Buffer diganti setiap 1 jam selama 5 jam DM:21.46g; DT:21.06g
Destilasi dilakukan hingga diperoleh destilat sebanyak ±15ml. Destilat yang diperoleh selanjutnya diencerkan hingga ± 50ml dan dititrasi dengan HCl terstandar sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Perhitungan kadar protein dilakukan dengan rumus :
%N = [(ml HCl-ml blanko)
mg sampel × N HCl ×14.007 × 100
Kadar protein g protein
100g bahan basah = %N × 6.25 Kadar Abu (AOAC, 1999)
Sampel ditimbang 3.0g dalam cawan pengabuan, sampel diarangkan sampai tidak berasap di oven. Sampel yang sudah menjadi arang dimasukkan pada tanur 600oC. Sampel yang sudah menjadi abu didinginkan dalam desikator dan ditimbang.
Kadar abu ( %b b) =
berat abu
berat sampel × 100
Kadar Lemak (AOAC, 1999)
Labu lemak dikeringkan dengan oven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang sebelum digunakan. Sampel ditimbang 3.0g, dibungkus dengan kertas saring dan diekstraksi soxhlet menggunakan pelarut heksan selama 6 jam. Labu lemak hasil ekstraksi dioven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai tercapai berat konstan.
Kadar lemak ( %b b) =
berat lemak berat sampel×100
Aktifitas Enzim (Bergmeyer dan Grassl, 1983)
Aktifitas protease diukur mengikuti prosedur seperti pada Tabel 4. Pereaksi disiapkan terlebih dahulu. Supernatan yang sudah diwarnai diukur absorbansinya pada 578nm. Aktifitas protease dihitung berdasarkan rumus :
Aktiitas protease ( U mL) =
A sampel − Ablanko)
Dimana : A : absorbansi
T : waktu inkubasi (35 menit) FP: faktor pengenceran
Satu unit aktifitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1µmol produk tirosin per menit pada kondisi pengukuran.
Specific Activity(Harris dan Angal, 1989)
Specific activityatau aktifitas spesifik dihitung berdasarkan persamaan :
Speciic activity ( U mg) =
Aktiitas enzim ( U) total protein ( mg)
Recovery(%)(Harrris, 1989)
Recovery(%) dihitung berdasarkan persamaan :
Recover y % = total aktiitas enzim tahap ( n)
total aktiitas enzim tahap ( n − 1)
Purification fold(Harris, 1989)
Purification folddihitung berdasarkan persamaan berikut :
Pur ii cat i on fold = speciic activity tahap ( n)
speciic activity tahap ( n − 1)
Neraca Massa(Toledo, 1991)
Neraca massa dihitung berdasarkan prinsip jumlah massa yang masuk sama dengan jumlah massa yang keluar. Neraca massa dihitung berdasarkan persamaan berikut :
Tabel 4. Pengujian Aktifitas Enzim Metode Bergmeyer dan Grassl (1983)
Pereaksi Sampel (mL) Blanko (mL) Standar (mL)
Bufer borat pH 8 Bufer kasein HCl 0.02 M
Larutan enzim protease Akuades Tirosin 5 mM 1 1 0.2 0,2 - - 1 1 0.2 - 0.2 - 1 1 0.2 - - 0.2 Inkubasi 35 menit, 37oC TCA 0.1 M CaCl2 2 0.2 2 - 2 - Inkubasi 37oC, 10 menit dilanjutkan dengan sentrifus 1448.9g selama 10 menit Supernatan Na2CO30.4 M Pereaksi Folin-Ciocalteau 1.5 5 1 1.5 5 1 1.5 5 1 Inkubasi 37oC, 20 menit dan diukur absorbansi pada 578 nm
Kadar Protein ( Bradford, 1976)
Sebelum mengukur absorbansi sampel, terlebih dahulu dipersiapkan blanko dan standar sehingga dapat dibuat kurva standar yang digunakan untuk menghitung konsentrasi protein sampel. Standar yang digunakan adalah BSA.
Untuk blanko, sebanyak 100ul akuades ditambahkan 5ml pereaksi Bradford dan diukur absorbansinya pada 595nm. Pembuatan standar BSA untuk pembuatan kurva standar adalah sebanyak 100ul larutan BSA (100-1000ug/ml) dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10cm. Kemudian ditambahkan 5ml pereaksi Bradford. Larutan divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada λ= 595nm setelah 5 menit. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel daun pucuk dan daun pangkal.
Sampel yang akan dianalisa diambil sebanyak 100µL ditambah 5mL pereaksi bradford, divortek dan didiamkan selama 5 menit, kemudian diukur absorbansi sampel dan dihitung kadar protein.
Elektroforesis Gel dan Zimogram SDS-PAGE
Untuk mengetahui bobot molekul protein yang terdapat pada endapan enzim maka digunakan elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodecil Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Komposisi gel untuk SDS-PAGE dan zimogram dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan SDS-PAGE dan Zimogram
Bahan Gel Pemisah 12% Gel Penahan 5% Zimogram
Aqua bidestilata 3.5mL 2.3mL 2.1mL Akrilamid 30% 4.0mL 0.67mL 4.2mL 1.5M tris HCl pH 8.8 2.5mL - 2.5mL 0.5 M tris HCl pH 6.8 - 1.0mL - Kasein 1% - - 1.0mL Ammonium persulfat 50µL 30µL 100µL TEMED 5µL 5µL 10µL Jumlah ~10mL ~4mL 10mL Pembuatan Gel
Disiapkan sepasang gel elektroforesis, yang terdiri dari gel pemisah (separating gel) dan gel penahan (stacking gel). Bahan kimia yang diperlukan untuk gel pemisah
disiapkan, dicampur, diaduk dengan pengaduk magnet, dan dengan cepat diisikan ke dalam plat pembentuk gel. Gel akan terbentuk setelah 30-45 menit.Larutan- larutan untuk gel penahan disiapkan, dicampur dan diaduk dengan pengaduk magnet dan diisikan pada plat pembentuk gel, di atas gel pemisah. Sisir disiapkan pada larutan gel penahan yang akan mengalami polimerisasi untuk membentuk sumur-sumur elektroforesis. Gel terbentuk setelah 15-30 menit.
Penyiapan Larutan Sampel dan Protein Marker
Protein sampel dan protein penanda masing-masing 40µL dicampur dengan buffer sampel sebanyak 10µL dimasukkan dalam tabung eppendorf dan dipanaskan pada penangas air mendidih selama 5 menit. Protein sampel yang
diinjeksikan sebanyak 10µL dan 7µL untuk protein penanda.Protein sampel dan penanda dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis menggunakan Syringe Hamilton.
RunningElektroforesis
Gel yang diisi dengan larutan sampel dan protein penanda dipasang pada piranti elektroforesis. Sebanyak 400mL buffer elektroforesis dituangkan pada tempatnya, sehingga permukaan gel terendam sedalam kira-kira 2cm. Elektroforesis dijalankan dengan mengalirkan arus listrik 70V untuk dua gel. Elektroforesis dihentikan setelah warna biru BPB mencapai kira-kira 0.5cm dari batas bawah gel pemisah. Gel hasil elektroforesis dilepas dari plat menggunakan spatula dan siap dilakukan pewarnaan protein.
Pewarnaan ProteinComassie Blue
Gel pemisah hasil elektroforesis direndam dalam larutan pewarna gel selama 20 menit sambil digoyang konstan pada mesin penggoyang. Kelebihan warna dihilangkan dengan larutan peluntur warna sampai diperoleh pita-pita protein berwarna biru dengan latar belakang jernih. Bobot molekul (BM) protein-protein dalam sampel ditentukan dengan menghitung nilai Rf dari masing-masing pita yang nampak, kemudian diplotkan pada kurva standar log BM terhadap Rf protein penanda.
Pewarnaan dengan Silver Stain(Moertzet al. 2001)
Pewarnaan silver disebutkan 20-200 kali lebih sensitif dibanding pewarnaan dengan comassie (CBB). Pewarnaan ini bisa mendeteksi 0.05-0.1ng/mm2 gel protein (Harris dan Angal, 1989).
Zimogram Pembuatan Gel
Disiapkan sepasang gel elektroforesis, yang terdiri dari gel pemisah dan gel penahan. Komposisi gel pemisah dan gel penahan seperti pada Tabel 5. Bahan
kimia yang diperlukan untuk gel pemisah disiapkan, dicampur, diaduk dengan pengaduk magnet, dan dengan cepat diisikan ke dalam plat pembentuk gel. Gel akan terbentuk setelah 30-45 menit.
Larutan-larutan untuk gel penahan disiapkan, dicampur dan diaduk dengan pengaduk magnet dan diisikan pada plat pembentuk gel, di atas gel pemisah. Sisir disiapkan pada larutan gel penahan yang akan mengalami polimerisasi untuk membentuk sumur-sumur elektroforesis. Gel terbentuk setelah 15-30 menit. Penyiapan Larutan Sampel dan Protein Marker
Protein sampel dan protein penanda masing-masing 40µl dicampur dengan buffer sampel sebanyak 10µl dimasukkan dalam tabung eppendorf. Protein sampel yang diinjeksikan sebanyak 18µL dan 15µL untuk protein penanda.Protein sampel dan penanda dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis menggunakan Syringe Hamilton.
RunningElektroforesis
Gel yang diisi dengan larutan sampel dan protein penanda dipasang pada piranti elektroforesis. Sebanyak 400mL buffer elektroforesis dituangkan pada tempatnya, sehingga permukaan gel terendam sedalam kira-kira 2cm. Elektroforesis dijalankan dengan mengalirkan arus listrik 70V untuk dua gel. Elektroforesis dihentikan setelah warna biru BPB mencapai kira-kira 0.5cm dari batas bawah gel pemisah. Gel hasil elektroforesis dilepas dari plat menggunakan spatula dan siap dilakukan pewarnaan protein.
Inkubasi
Gel pemisah hasil elektroforesis direndam dalam larutan Triton X-100 2.5% selama 1 jam sambil digoyang pada mesin penggoyang. Setelah itu gel direndam didalam larutan buffer asetat pH 5 dan diinkubasikan selama 1 jam dan semalaman.
Pewarnaan ProteinComassie Blue
Gel pemisah hasil elektroforesis direndam dalam larutan pewarna gel selama 20 menit sambil digoyang konstan pada mesin penggoyang. Kelebihan warna dihilangkan dengan larutan peluntur warna sampai diperoleh pita-pita protein berwarna biru dengan latar belakang jernih. Bobot molekul (BM) protein-protein dalam sampel ditentukan dengan menghitung nilai Rf dari masing-masing pita yang nampak, kemudian diplotkan pada kurva standar log BM terhadap Rf protein penanda.
Pendugaan Kelas Protease Daun Mengkudu
Tahap ini dilakukan untuk menduga kelas protease dari daun mengkudu. Pendugaan dilakukan menggunakan literatur, studi pustaka dan bank data yang tersedia.
