Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2008 sampai dengan Januari 2010. Penanaman dilakukan di lahan penelitian Desa Padasuka Kecamatan Ciomas Kabupaten Bogor, Jawa Barat. Analisis laboratorium dilakukan di Laboratorium Produksi Departemen AGH IPB dan Laboratorium Molekuler dan Kloning Departemen AGH IPB.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah biji meniran hasil eksplorasi dari Kabupaten Bangkalan dan Gresik berupa 6 aksesi meniran hijau (A1,A2,A3,A4,A5,A6) dan 1 aksesi meniran merah (A13) yang berasal dari Kabupaten Bangkalan dan 6 aksesi meniran hijau (A7,A8,A9,A10,A11,A12) yang
✱0
berasal dari Kabupaten Gresik. Bahan untuk penanaman adalah pupuk kandang, pupuk NPK, tanah, polibag ukuran (25 x 30) cm, insektisida hayati. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis RAPD antara lain : SIGMA-Aldrich TM Extraction and dellution kit, aquabidestilata, campuran chloroform dan isoamilalkohol (CIA) 24:1, Etanol Absolut, PCR amplification reagents dari Vivantis, DNAladder, primer acak, gel agarose, buffer TAE (Tris Acetic Acid EDTA) 1x, Loading die, dan Ethidium Bromide.
Peralatan budidaya yang digunakan adalah alat budidaya secara umum. Peralatan yang digunakan untuk pengamatan adalah meteran, penggaris, kaca pembesar dan jangka sorong. Peralatan yang digunakan dalam analisis RAPD adalah gunting, oven, water bath, microtube 2 ml, pelampung microtube, mikro pipet 1000 μ l, mikro pipet 100 μ l, rak tip dan microtube, centrifuge, desicator vacuum pump, timbangan analitik, hot plate, labu Erlenmeyer, elektroforesis chamber, sisir gel mesin PCR, mesin elektroforesis dan UVtransiluminator.
Metode Penelitian
Keragaman morfologi tanaman
Penelitian menggunakan rancangan acak kelompok lengkap (RAK) dengan satu faktor yaitu 13 aksesi meniran dengan 3 kali ulangan (kelompok) sehingga terdapat 39 kombinasi percobaan.
Biji meniran yang didapat dari eksplorasi di Kabupaten Bangkalan dan Kabupaten Gresik dikeringanginkan selama 24 jam, kemudian disemai. Media semai berupa campuran antara tanah, sekam dan kompos dengan perbandingan 1:1:1. Biji yang disemai ditutup dengan kompos agar tidak mudah diterbangkan angin. Selanjutnya media disiram air. Untuk menjaga kelembaban, persemaian ditutup dengan plastik bening tembus cahaya. Wadah diletakkan ditempat yang ternaungi. Setelah tumbuh kecambah, tutup plastik dibuka. Dilakukan pemeliharaan sampai bibit siap untuk dipindahkan ke polibag yang berukuran (25 x 30) cm. Bibit yang dipindah telah mempunyai minimal empat daun majemuk.
Kegiatan pemeliharaan tanaman meliputi penyiraman, pemupukan, penyiangan gulma dan pencegahan hama dan penyakit. Penyiraman dilakukan setiap hari pada pagi atau sore hari selama satu bulan pada awal penanaman dengan asumsi tidaak ada hujan. Selanjutnya penyiraman dilakukan sesuai dengan keperluan.
✲✳
Pengendalian hama dan penyakit dengan insektisida organik. Pengendalian gulma dilakukan dengan cara penyiangan.
Pengamatan karakter morfologi
1. Tinggi tanaman (cm) diukur dari pangkal batang sampai ujung pucuk tanaman, diamati setiap 2 minggu.
2. Jumlah daun majemuk, dihitung bila daun telah membuka sempurna, diamati setiap 2 minggu.
3. Jumlah cabang, dihitung setiap 2 minggu.
4. Diameter batang (mm), diamati pada tanaman yang sudah dipanen dengan cara mengukur panjang diameter pada sisi tengah batang dengan menggunakan jangka sorong digital.
5. Bobot 1000 biji (g), diamati pada buah yang telah masak, pecah dan biji telah keluar dengan cara menimbang 1000 biji dengan menggunakan timbangan neraca analitik.
6. Produksi biomassa basah (g), diamati pada akhir percobaan dengan cara menimbang dengan timbangan neraca analitik bobot basah akar, daun dan batang.
7. Produksi biomassa kering (g), diamati pada akhir percobaan dengan cara menimbang dengan timbangan neraca analitik bagian akar, daun dan batang yang telah dioven pada suhu 105oC selama 24 jam.
8. Analisis antosianin daun. Sampel daun adalah daun yang telah terbentuk sempurna dan daun yang terkena matahari secara langsung. Cara kerja disajikan pada Lampiran 2.
Penanda Molekuler dengan analisis RAPD Pelaksanaan
Pelaksanaan analisis RAPD dibagi dalam dua kegiatan utama, yakni isolasi DNA dan amplikasi DNA menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction). Analisis RAPD dilakukan pada 13 aksesi meniran dengan menggunakan 10 primer acak. Dari 10 primer yang dipilih secara acak, ada 5 primer menunjukkan hasil yang polimorfik yang selanjutnya digunakan dalam analisis RAPD.
✴✵
Isolasi DNA
Metode yang digunakan adalah metode ekstraksi menggunakan Kit SIGMA yang dimodifikasi. Larutan ekstrak dari kit Sigma yang digunakan sebanyak 100 μ l yang ditempatkan dalam mikrotube 2 ml. Gunting yang akan digunakan dicuci dengan alcohol 70% kemudian dikeringkan dengan tissue. Sampel daun dipotong sebanyak 0.02 gram dan dimasukkan ke dalam microtube yang sudah berisi ekstrak kit. Selanjutnya dipanaskan pada suhu 95oC menggunakan water bath selama 5 menit. Setelah dipanaskan, ke dalam microtube ditambahkan larutandilusisebanyak 100 μ l dan aquabides sebanyak 500 μ l. Selanjutnya cairan dalam microtube diambil tanpa mengikutkan potongan daunnya. Cairan tersebut dimasukkan ke dalam tabung baru yang berukuran 1.5 ml (militube) dan ditambahkan chloroform isoamylalkohol (CIA 24:1) sebanyak 150 μ l kemudian diaduk dengan vortex mix selama kurang lebih 10 detik dan dicentrifuge pada kecepatan 15 000 RPM atau kurang lebih 12 000 G selama 5 menit. Setelah dicentrifuge, supernatant dipindahkan pada microtube 1500μl. Kemudian ditambahkan etanol absolute 2 kali volume supernatant. Jika gumpalan lender tidak terlihat, maka larutan tersebut dimasukkan ke dalam freezer selama 10 menit kemudian dicentrifuge pada kecepatan 7 000 RPM (± 5000 G) selama 5 menit. Kemudian larutan etanol dibuang dan sisa lender yang berupa pellet (DNA) dikeringkan di atas kertas tissue. Jika alkohol sudah tidak ada yang menetes, DNA dikeringkan dengan vacum pump sampai kering. Yang terakhir DNA dilarutkan dengan air double destilate 50-200 μ l. DNA hasil isolasi ini disimpan dalam freezer jika tidak digunakan langsung untuk amplifikasi PCR.
Amplifikasi DNA dengan PCR
Amplifikasi DNA dilakukan dengan PCR reagent dari Vivantis dengan modifikasi konsentrasi taq DNApolymerase 1.5 kali konsentrasi anjuran (Tabel 9). Campuran bahan PCR terdiri dari 10 μ l PCRreagentvivantis, 5 μ l primer acak, dan 5 μ l DNA template. Semua campuran bahan PCR sebanyak 20 μ l tersebut dimasukkan ke dalam PCRtubedan diamplifikasi pada mesin PCR Effendorf.
Proses amplifikasi DNA dibagi dalam tiga bagian yaitu : 1) denaturation (penguraian utas ganda DNA menjadi utas tunggal) selama 5 menit pada suhu 95oC, 2)anneling (penempelan primer) selama 30 detik pada suhu annealing (TM(melting
✶✷
temperature) primer -4oC) dan 3) elongation (pemanjangan utas DNA primer yang komplemen dengan DNA template menggunakan enzyme taq DNA Polymerase) selama 1 menit pada suhu 72oC. Proses amplifikasi PCR dilakukan sebanyak 45 siklus.
Tabel 9 Bahan reaksi PCR analisis RAPD keragaman 13 aksesi meniran
Bahan reaksi PCR Konsentrasi
(stock solution)
Volume yang diambil (per reaksi)
10 x VivantisBufferA 400 μ l 2 μ l
2 mM dNTPmix 160 μ l 0.8 μ l
50 mM MgCl2 120 μ l 0.6 μ l
Taq DNApolymerase 48 μ l 0.24 μ l
Double destilate water 1.272 μ l 6.36 μ l
Primer 1 000 μ l 5 μ l
DNA 1 000 μ l 5 μ l
Volume total 4 000 μ l 20 μ l
Elektroforesis
Fragmen DNA hasil amplifikasi menggunakan PCR dapat dilihat melalui elektroforesis. Media yang digunakan adalah gel yang dibuat dari agarose sebanyak 0.6 gram yang ditambah dengan TAE 1x sebanyak 40 ml. Gel ditempatkan pada alat elektroforesis dan dibuat sumur untuk menempatkan DNA hasil amplifikasi kemudian ditambah TAE 1x hingga rata menutupi gel. Campuran DNA yang dielektroforesis adalah 9 μ l hasil reaksi PCR dicampur dengan 1-2 μ l loading dye. Kemudian 5 μ l dari 1000 bp DNA ladder disimpan pada salah satu sumur untuk mengukur pita-pita DNA yang dihasilkan dari masing-masing aksesi meniran. Elektroforesis dilakukan selama 90 menit pada 90 Volt. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan Ethidium bromide selama 15 detik kemudian direndam dalam aquades selama 30 menit. Selanjutnya gel yang telah diwarnai divisualisasikan di atas ultra violet transluminator dan didokumentasikan dengan kamera.
Analisis Data
Analisis gerombol. Metode pengerombolan yang digunakan adalah metode aglomeratif dan ukuran ketidakmiripan yang digunakan adalah jarak euclide.
✸✹
Peubah yang menjadi dasar pengerombolan adalah peubah yang telah direduksi dari hasil analisis komponen utama. Pengolahan data ini dibantu oleh program MINITAB 15.0.
Analisis komponen utama. Analisis komponen utama (Principal Componen Analysis) dilakukan untuk menyederhanakan variabel yang baru menjadi lebih sedikit, namun informasi tidak berubah. Analisis ini memberikan gambaran berupa besarnya pengaruh persentase nilai keragaman dari beberapa komponen utama (biasanya 3 komponen utama) yang dapat dibentuk dari minimal 70% keragaman yang dimiliki oleh karakter-karakter pada populasi yang dikarakterisasi (Nasution 2008). Pengolahan data dibantu oleh program MINITAB 15.0
Data hasil RAPD diskoring berdasarkan ada tidaknya pita. Skor 0 jika tidak ada pita dan skor 1 jika ada pita pada tingkat migrasi yang sama antar aksesi meniran. Setiap profil pita DNA berhubungan dengan lokus yang mengandung alel tertentu. Pita hasil amplifikasi pada posisi yang sama pada laju elektroforesis yang sama untuk setiap tanaman meniran, dianggap sebagai satu lokus homolog. Selanjutnya data hasil skoring dianalisis menggunakan Seguential Agglomerative, Hierarchical and Nested (SAHN)-UPGMA (Unweighted pair-group method, arithmetic average) pada program NTSYSpc untuk menganalisis kemiripan antar aksesi (matriks jarak genetik). Hasil analisis disajikan dalam bentuk dendrogram.
✺✺