3.1. Kaedah am
3.1.1. Sumber substrat
Batang kelapa sawit(BKS) diperolehi dari dua sumber iaitu dari Institut Penyelidikan Perhutanan (FRIM), Kepong, Selangor dan dari Ladang Perbadanan Kemajuan Negeri Kedah(PKNK), Sera, Kulim , Kedah. Sampel batang kelapa sawit diambil dari pokok yang telah berumur 25 tahun iaitu setelah tamat hayat ekonominya.
3.1.2. Penyediaan substrat BKS
Batang kelapa sawit yang diperolehi dari FRIM telah sedia diasingkan kepada dua bahagian iaitu parenkirna(P) dan berkas vaskular(V).
Batang kelapa sawit yang didapati dari ladang diproseskan dengan membuang kulitnya, dipotong mengikut saiz 2.5 x 2.5 em dan seterusnya dihaneurkan seeara kasar dan kemudian dikeringkan pada suhu 45 OC selama 24 jam(keeuali sampel 5). Setelah kering sampel tersebut diasingkan menjadi 4 sampel berbeza:
1. Parenkima(P)- didapati dengan mengasingkan gentian dari BKS seeara mekanikal.
2. Berkas vaskular(V) ataupun gentian yakni bahagian BKS yang dileraikan dari parenkima (dari langkah 1). Pengikisan dengan pisau dilakukan untuk mendapatkan berkas vaskular yang hampir 90% bebas dari parenkima.
67
3 Seluruh BKS(W1) yang dikisar dengan alat 'Starch Plant Shredder' Model Dietz SM 191 sehingga menjadi sampel kasar berukuran antara 0.5 hingga 1 cm.
4 Seluruh BKS(W2) yang dikisar halus dengan alat' Starch Plant Shredder' Model Dietz SM 191 dan diayak dengan penapis bergegar ('Vibratory Sieve Shaker'-Fritsch, Analysette 3, Germany) untuk mendapatkan sampel bersaiz 0.45 mm.
5 Seluruh BKS (W3) yang tidak dikeringkan juga dikisar dengan alat' Starch Plant Shredder' Model Dietz SM 191 mengikut saiz 0.5 hingga
1 cm.
3.1.3. Kaedah Pensterilan dan Praolahan
PensteFilan dilakukan dengan autoklaf (Hirayama, Japan) pada 1210(:
selama 20 minit. Sampel batang kelapa sawit untuk dikultur substrat pepejal juga diautoklaf sebagai langkah praolahan.
3.1.4. Sumber mikroorganisma
Kulat Aspergillus terreus diperolehi dari Prof. Madya Dr. Azizan Mohd.
Noor dari Pusat Pengajian Sains Kajihayat , USM. Kulat ini pada asalnya telah dipencilkan dari bagas reput di kilang pemprosesan tebu dan dicamkan oleh CAB International Mycological Institute, England.
3.1.5. Media kultur mikroorganisma
3.1.5.1 Medium separa Pejal Agar Kent~g Dekstrosa (PDA).
PDA yang separa pejal ( half stength) didapati paling sesuai untuk pembentukan spora Aspergillus terre us.
Agar ken tang dekstrosa (Oxoid) ditimbang sebanyak 19.5 g. Sebanyak 7.5g agar teknikal No.3(Oxoid) ditimbang dan dimasukkan bersama agar kentang dekstrosa. Air suling ditambah sebanyak 1 liter. Medium ini dididihkan untuk melarutkan agar. Seterusnya medium diautoklaf pada 1210C selama 20 minit.
3.1.5.2. Medium agar kentang- dekstrosa
Sebanyak 39g agar ken tang dekstrosa( Oxoid) ditimbang dan ditambah dengan air suling sehingga menjadi 1 liter. Bahan ini dididihkan untuk dilarutkan dan kemudian disterilkan pada 1210C selama 20 minit.
3.1.6. Pemeliharaan kultur mikroorganisma.
Spora A. terre us dikulturkan dalam agar eondong PDA yang separa pejal.
Agar condong ini dieram pada suhu bilik selama 5 'hari atau sehingga spora terbentuk. Kemudian ia disimpan dalam petisejuk pada. 4OC. Setiap 3 bulan ia disubkultur dengan memotong sekeping keeil agar dan memindahkan kepada agar condong yang baru.
69
3.1.7 Penyediaan inokulum
Untuk menyediakan ampaian spora, 10 mL air suling steril dimasukkan ke dalam piring petri agar yang mengandungi spora. Batang kaca berbentuk L digunakan untuk mengadukpermukaan agar secara perlahan untuk membebaskan spora tanpa merosakkan agar. Ampaian(inokulum) spora ini dipindahkan ke dalam botol steril dengan menggunakan pipet Pastuer steril. Kepekatan spora dihitung dengan haemositometer.
3.1.8. Penyediaan medium Toyama untuk kultur substrat pepejal.
Medium yang digunakan adalah medium Toyama (Toyama, 1976) yang mengandungi bahan-bahan berikut:
(NH4 )2!D4, 109; KH2lD4, 30g; MgS04-7H20, 0.5 g; CaC12.2H20, O.5g.
Bahan-bahan ini dicairkan dalam 1 liter air suling dan pH ditetapkan pada pH S. Medium Toyama kekuatan separuh (1/2 X ) dan medium Toyama kekuatan dua kali ganda ( 2 X,) juga disedia berdasarkan formulasi di atas .
3.1.9 Penyediaan ekstrak enzim dari kultur substrat pepejal.
2S mL air suling yang mengandungi 0.1% Tween 80(polietilena sorbitan monooleata) sejenis surfaktan, dimasukkan ke dalam kelalang yang mengandungi kultur . Seterusnya enzim diekstrakkan dengan mengoncang kelalang yang mengandungi kultur selama 1 jam pada suhu ambien. Selepas enzim diekstrak , bahan-bahan terampai dan pepejal
diasingkan dengan pengemparan pada 6,000 g( Jouan MR 14.11,France ) selama 10 min pada suhu ambien . Supernatan cerah diguna untuk kajian selanjutnya.
3.1.10 Penyediaan ekstrak enzim dari kultur tenggelam.
Kultur tenggelam dilakukan dengan menggunakan 1% kanji terlarut(BDH).
Sumber kanji ini tidak dapat dipastikan kerana tidak dinyatakan oleh pembekal. Substrat dilarutkan ke dalam SOOmL medium Toyama, disterilkan dan diinokulasi dari agar condong PDA. Pengeraman dilakukan pada suhu ambien dengan pengadukkan pada kelajuan 175 rpm. Enzim diekstrak dari kultur dengan melakukan pengemparan (6000g selama 10 minit) dan dituras dengan membran. penuras gentian kaca GFI A selepas 10 hari.
Aktiviti K-glukosidase ditentukan seperti dalam Bahagian 3.2.10.
Aktiviti enzim E.-glukosidase dari kultur tenggelam ini adalah rendah oleh itu pemekatan enzim dilakukan dengan menggunakan penuras ultra berpengaduk (Amiconcell,Model 8400) pada tekanan 25 psi menggunakan membran penuras PM 10 (Amicon Corp.,) dengan berat molekul 'eut-ofr 10,000 . lni adalah untuk menyingkirkan molekul glukosa dan lain-lain gula yang bersaiz keeil berbanding dengan K-glukosidase .
71
3.1.11 Kajian Mikroskop elektron penskanan
Alat ini digunakan untuk mengkaji sampel berikut dengan lebih terperinci:
1 Parenkima(P) dan BKS seluruh(W1) yang telah dikultur substrat pepejal selama 3 hari diteliti dengan mikroskop elektron penskanan untuk memerhatikan corak tumbesaran miselium kulat A.terreus . 2 Parenkima(P) dan selulosa mikrohablur(Avicel), sebagai substrat
bandingan diteliti dengan mikroskop elektron penskanan untuk memerhatikan kesan hidrolisis oleh tambahan 2.SU selobiase ataupun 2.SU .&-glukosidase ke atas struktlir kedua substrat terse but . Penyediaan sampel :
Sampel dimantapkan dengan 1% osmium tetroksida selama 4 jam. Selepas itu sampet" dibiarkan semalaman pada suhu -200C. Sampel kemudian dikeringkan secara vakum dan diletakkan ke atas tombol spesimen dengan menggunakan pita dua belah ('double sided tape') dan kemudian disaluti dengan emas. Sampel diskan. menggunakan kuasa 10 kY dengan menggunakan mikroskop elektron penskanan model S-200(Cambridge Instrument Ltd., England) dan mikrograf dihasilkan dalam bentuk hitam-putih.
3.2. Analisis kimia
Analisis kimia dilakukan ke atas substrat batang kelapa yang dikaji iaitu sampel parenkim(P) ,berkas vaskular(Y) dan sampel seluruh(Wl) kerana sememangnya diketahui bahawa substrat mempunyai kaitan rapat dengan penghasilan enzim. Terdap'at banyak faktor yang boleh mempengaruhi .
penghasilan enzim dan komposisi kimia substrat merupakan suatu faktor penting. Antara analisa komposisi kimia yang dilakukan ialah penentuan kandungan lembapan ( Bahagian 3.2.2), abu (Bahagian 3.2.3), lignin (Bahagian 3.2.4), holoselulosa (Bahagian 3.2.5), selulosa (Bahagian 3.2.6), dan kanji (Bahagian 3.2.7).
Bahan-bahan kimia yang bergred analitikal telah digunakan dalam kaedah kaedah penentuan disepanjang kajian ini kecuali jika dinyatakan.
3.2.1 Larutan Tampan
(i) Larutan Tampan Asetat
Penyediaan larutan stok adalah seperti di bawah iaitu berdasarkan Colowick dan Kaplan ,( 1955).
A : 0.2 M Larutan asid asetik B: 0.2 M Larutan natrium asetat
Jadual 3.1 menunjukkan kuantiti percampuran bagi kedua-dua larutan stok untuk penyediaan larutan pada pH yang diperlukan.
Jadual 3.1: Penyediaan larutan tampan asetat
A(mL)
Larutan stok A (mL) dicampurkan dengan larutan stok B (mL) dan dicairkan dengan air suling kepada 100 mL di dalam kelalang volumetrik akan menghasilkan pH yang dinyatakan di dalam jadual 3.1.
ii. Larutan Tampan Fosfat
Penyediaan larutan stok adalah seperti berikut iaitu berdasarkan Colowick dan Kaplan ,(1955):
c:
0.2 moliL kalium hidroksidaD: 0.2 moliL kalium dihidrogen fosfat
Jadual 3.2 menunjukkan kuantiti pencampuran bagi kedua-dua larutan stok untuk penyediaan pH yang diperlukan.
Jadual 3.2 : Penyediaan larutan tampan fosfat.
c
(mL) D(mL) pH3.5 50.0 5.8
5.8 50.0 6.0
9.1 50.0 6.2
13.0 50.0 6.4
18.0 50.0 6.6
24.0 50.0 6.8
30.0 50.0 7.0
40.0 50.0 7.4
43.0 50.0 7.6
Larutan stok C (mL) dicampurkan dengan larutan stok D (mL) dan ditambah dengan air suling menjadi 100 mL di dalam kelalang volumetrik akan menghasilkan pH yang dinyatakan di dalam ]adual 3.2.
3.2.2. Penentuan kandungan lembapan
Kandungan lembapan ditentukan dengan menggunakan kaedah AOAC 925.10 (1990). Satu piring petri aluminium berpenutup dipanaskan dalam ketuhar pada suhu 1300C selama 1 jam , disejukkan ke suhu bilik dan ditimbang. Sampel BKS sebanyak2 g ditimbang dan diletakkan dalam ketuhar selama 4 jam ,disejukkan serta ditimbang / dan kandungan lembapan didapati dari peratus kehilangan berat dari sampel asal.
Penentuan dibuat dalam triplikat.
Cara pengiraan :
Berat piring petri aluminium Berat piring petri + sampel
3.2.3. Penentuan kandungan abu
= ( m2-m1) - ( m2-m3)
= (m2-m1l - ( m2-m3l ( m2-m1)
Penentuan kandungan abu ditentukan untuk mendapatkan jumlah mineral yang terkandung di daiam sesuatu sampel. Penentuan adalah berdasarkan kaedah AOAC 923.03 (1990). Sebanyak 2 g batang kelapa sawit ditimbang dan dimasukkan ke dalam mangkuk silika . Sampel dipanaskan
7S
dalam kebuk wasap sehingga dikarbonkan dan seterusnya dipindahkan ke relau mufel dan pembakaran diteruskan selama 2 jam pada suhu 550 0 C sehingga tiada bara (lni menandakan semua zarah -zarah karbon dibakar).
Residu disejukkan serta dilembapkan dengan beberapa titis air jika pembakarannya kurang berkesan dan seterusnya ia di panaskan semula.
Mangkuk dan residu dipindahkan kedalam desikator dan ditimbang.
Penentuan dibuat secara triplikat.
Cara pengiraan :
BeTat Tesidu (g) 00
Abu (%) = xl
BeTat sampel (g)
3.2.4. Penentuan kandungan lignin (Kaedah Klason)
Penentuan Klason lignin adalah menurut TAPPI T 222 (Anonymous, 1978).
Sampel BKS yang digunakan ialah sampel yang telah diekstrak dengan etanol- toluena (1:1). Sampel ini dimasukkan kedalam bikar 50 mL. Asid sulfurik pekat 75% (w/w) sebanyak 15 mL ditambah secara sedikit demi sedikit kedalam sampel dan dikacau dengan batang kaca. Sampel ini dikawal suhunya (200 C) dengan perendaman dalam air ais selama 2 jam sambil dikacau mengikut masa tertentu. Seterusnya campuran dimasukkan kedalam kelalang Erlenmeyer (1 liter) dan air suling (560 ml) ditambahkan. Sampel direfluks selarna 4 jam dan didinginkan serta dimendapkan. Sampel seterusnya dituras dengan pam vakum menggunakan cawan turas ( 'fritted glass') berporositi 3 yang telah ditimbang beratnya. 500 mL air panas digunakan untuk membasuh sehingga turasan menjadi neutral. Kemudian cawan turas dikeringkan dalam ketuhar yang bersuhu 1050 C sehingga beratnya malar.
Cara pengiraan :
Lignin (%) =
Berat baki
- - - x
100Berat sampe\ asal
3.2.5. Penentuan kandungan holoselulosa
Kaedah penentuan kandungan holoselulosa adalah mengikut kaedah Browning(1967) yang telah dimodifikasi . Sebanyak 5 g sampel dimasukkan ke dalani 250 mL kelalang Erlenmeyer. Natrium klorit ( NaCI02) sebanyak 1.5g dilarutkan ke dalam 160mL air suling dan dicampurkan dengan 10mL asid asetik dan kelalang ditutup. Sampel ini dioksidakan dengan merendamkan kelalang dalam kukus air 7 SoC dan disertakan dengan pengocakkan pada masa tertentu. Selepas 1 jam , proses pengoksidaan diteruskan dengan menambah 1.5g NaCI02 dan 10mL asid asetik. Kaedah ini diulangi tiga kali. Campuran disejukkan dengan merendam dalam air ais dan dituras dengan corong 'Buchner' . Sampel dibasuh dengan air sehingga neutral dan dikeringkan diudara atau pada 600C. Sampel kering ditimbang sehingga beratnya malar.
Cara pengiraan:
Holosel ulosa( %) BeTat sam pel kering
---...;...---=-x 100 % Berat sampel asal
Holoselulosa yang dihasilkan dari kaedah ini akan digunakan seterusnya dalam penentuan kandungan selulosa seterusnya.
77
3.2.6. Penentuan kandungan selulosa.
Kaedah penentuan kandungan selulosa adalah· mengikut kaedah Browning( 1967) yang telah dimodifikasi . Sebanyak 5 g holoselulosa
,
- dimasukkan ke dalam 250 mL bikar dan ditambahkan 50 mL 17.5% (w/v) NaOH. Sampel dikacau dengan batang kaca selama 2 jam untuk memastikan percampuran yang seragam dan hidrolisis yang lengkap . Selepas 2 jam bald sampel dituras dengan penuras 'fritted glass' dan dibasuh dengan air suling sehingga sampel neutral. Sampel dikeringkan pada 600C sehingga beratnya malar.
berat selulosa
Selu10sa = x 100%
berat holoselulosa
3.2.7. Penentuan kandungan kanji
Penentuan kanji dilakukan ke atas sampe1 parenkima , berkas vaskular dan BKS seluruh dengan menggunakan kaedah Karkalas (1985). Sampel perlu dikeringkan pada suhu 450C sebelum ditentukan kandungan kanjinya.
Sebanyak 100 mg sampel ditimbang ke dalam tabung uji dan ditambah dengan 2 mL air suling dan 0.2 mL u-amilase (Termamyl) daripada Bacillus licheniformes serta dicampurkan. Seterusnya 6 mL air ditambah ke dalam campuran tersebut. Sampel ditindakbalas pada suhu 850C selama 30 minit dan seterusnya disejukkan kepada suhu 200C . Sampel dipindahkan ke dalam kelalang 100 mL volumetrik dan ditambah dengan air suling sehingga 100mL. Apabila kanji mengalami hidrolisis oleh u-amilase, hanya separuh dari pecahan amilopektin diuraikan. Penambahan glukoamilase adalah perlu untuk meneruskan hidrolisis. Untuk itu, 30 mg
glukoamilase atau AMG (Amiloglucosidase Novo) daripada Aspergillus niger dilarutkan ke dalam 15 mL larutan tampan asetat pada pH 4.6. Setelah 1 rnL enzim AMG ditambah ke dalam 1 mL sampel, tindakbalas diteruskan dengan pengerarnan pada suhu 600C selarna 30 rninit dan setelah itu sarnpel disejukkan ke suhu 20 °C dan kernudian 8 rnL air suling ditarnbah serta dicampurkan. Seterusnya sampel dituras dengan penuras gentian kaca GFI A . Turasan yang dihasilkan digunakan untuk penentuan glukosa.
Kanji didapati dengan rnenggunakan faktor penukaran 0.9 untuk rnenukar glukosa kepada kanji. Kurva piawai disediakan dari glukosa dalam julat 0 -100 rng/mL. Penentuan dibuat secara duplikat.
3.2.8. Penentuan protein larut .
Penentuan protein terlarut ditentukan mengikut Kaedah Lowry (Lowry et aL,1951).
Reagen yang digunakan adalah seperti berikut:
Larutan A: 1%CuS04. 5 H20 Larutan B: 2 % Na IK tartrat
Larutan C: 2 % NaC03 dalam 0.1 M NaOH
Larutan 1 terdiri dari 1 % larutan A + 1 % Larutan B + 98 % Larutan C.
Larutan 2 ialah larutan Folin - Ciocalteau ( 1 : 1 )
0.1 mL sampel dicampur dengan 0.9 ml air suling , kemudian 5 mL larutan I ditambahkan, diaduk dan dibiar pada suhu bilik selama 10 minit. Selepas itu 0.5 mL larutan Folin- Ciocalteau dirnasukkan dan diadukkan. Campuran ini dieram selama 30 rninit pada suhu bilik. Absorbans ditentukan pada jarak gelornbang 750 nrn dengan rnenggunakan alat spektrofotorneter (Shimadzu Model UV-160 A). Kawalan (blank) disediakan dengan
79
menggantikan sampel dengan air suling. Kepekatan protein ditentukan daripada lengkuk piawai yang menggunakan serum albumin bovin yang berj ulat kepekatan dart 0 hingga ZOO ~lg / asai. ( lampiran 5)
3.2.9. Penentuan gula penurun
Dalam penghasilan enzim melalui kultur substrat pepejal , proses hidrolisis juga berlaku ke atas substrat yang dikultur. Penentuan gula penurun dilakukan untuk memastikan samada substrat yang dikaji iaitu parenkima(P), berkas vaskular(V) dan BKS seluruh (WI) menunjukkan perbezaan tahap hidrolisis. Kehadiran gula penurun juga berkait rapat dengan mekanisme pengaruhan(induction) dan perencatan (repression) di dalam proses penghasilan enzim selulase dan ~-glukosidase.
Dalam" kajian ini kandungan gula penurun ditentukan mengikut kaedah Miller (1959) yang telah diubahsuaikan . Kebanyakkan monosakarida dart bahan selulosik dikelaskan sebagai gula penurun kerana kebolehan menurunkan reagan ToUen's( yang mengandungi Ag (NH3)Z )ataupun reagen Fehling's (mengandungi CuZ+ beralkali). Oleh itu kandungan gula penurun merupakan suatu asai yang mudah dan sesuai digunakan sebagai pengukuran kuantitatif degradasi selulosa.
Larutan asid dinitrosalisilik (DNS) disediakan dengan melarutkan 5 g DNS kedalam 400 mL air. Kemudian ZOO mL Z N NaOH ( natrium hidroksida) dan 300 g kalium natrium tartrat dicampurkan. Air suling ditambahkan sehingga 1 liter .
Untuk menentukan kandugan gula penurun, 0.1 mL sampel dicampurkan
dididihkan selama 10 minit. Selepas itu campuran disejukkan pada suhu·
bilik dan jika perlu dicairkan dengan 10 ml air suling. Absorbans ditentukan pada jarak gelombang 540 nm dengan menggunakan alat spektrofotometer (Shimadzu Model IN-160 A). Kawalan (blank) disediakan dengan menggantikan sampel dengan air suling . Kepekatan gula penurun ditentukan daripada lengkuk piawai glukosa berjulat kepekatan daripada 0 hingga 500 !A g ( Lampiran 1)
3.2.10. Penentuan aktiviti ~-glukosidase ( E.C. 3.2.1.21)
Penentuan aktiviti ~-glukosidase dilakukan mengikut kaedah Selby &
Maitland (1967) menggunakan p-nitrofeni1-~-D-glukosida (pNPG) sebagai substrat. Aktiviti ditentukan dengan mengukur p-nitrofenol yang dibebaskan dari p-nitrofenil-~-D-glukosida (pNPG).
Penyediaan substrat dan reagen adalah seperti berikut: 0.1 % (w/v) pNPG SO mM larutan tampan asetat pH 5.0 ; 1 M larutan natrium karbon at
Aktiviti enzim diukur dengan menggunakan 0.025 mL sampel yang ditambahkan dengan 1.975 mL larutan tampan pNPG. Seterusnya 1 mL pNPG dimasukkan dan campuran dieramkan pada suhu SO OC selama 30 minit. Akhir sekali 2 mL larutan natrium karbonatditambahkan untuk menghentikan tindakbalas. Absorbans ditentukan pada jarak gelombang 400 nm dengan· menggunakan alat spektrofotometer (Shimadzu Model IN -160 A): Kawalan (blank) disediakan dengan menggantikan sampel dengan air suling. Kepekatan p-nitrofenol ditentukan daripada lengkuk piawai dengan menggunakan kepekatan p-nitrofenol dari 0 hingga 30 !AI asai.
(lampiran 4). 1 unit aktiviti ~-glukosidase didefinasikan sebagai amaun enzim yang perlu untuk membebaskan 1 !A mol p-nitrofenol per minit.
81
3.2.11. Penentuan aktiviti endoglukanase (CMease)
D.c.
3.2.1.4Penentuan aktiviti karboksimetil selulase ( CMCase) dilakukan mengikut Mandels et a1 (1976). Prinsip penentuan ialah enzim endoglukanase akan menghidrolisis selulosa di dalam substrat karboksimetil selulosa(CMC) seeara rawak dan membebaskan gula penurun .
Penyediaan substrat dan reagen adalah seperti berikut:
1 % CMC dalam 30 rruv11arutan tampan asetat 50 roM larutan tampan asetat ( pH 5.0)
Aktiviti enzim diasaikan dengan menggunakan 0.025 mL sampel ditambah dengan larutan tampan asetat sebanyak 0.475 mL. Seterusn):a 1-% CMC sebanyak 0.5 mL dimasukkan sebagai substrat dan dieramkan pada suhu 50 oC selama 30 minit. Gula penurun yang terhasil ditentukan seperti diterangkan dalam bahagian 3.2.9.
1 unit aktiviti CMCase ditakrifkan sebagai amaun enzim yang menghasilkan 1 !.I. mol glukosa setara / minit.( Larnpiran 2 )
3.2.12. Penentuan aktiviti FPase
Aktiviti FPase atau selulase total ini ditentukan mengikut kaedah Mandels et a1 (1976) dengan menggunakan kertas turas sebagai substrat. Degradasi enzim selulase ke atas kertas turas diukur dengan gula penurun yang terhasil. Luas permukaan substrat (kertas turas) adalah rendah dan ini merupakan suatu halangan atau konstrain kinetik ke atas tindakbalas selulase . Oleh itu asai ini sesuai untuk kompleks selulase yang mengandungi eksoglukanase yang eukup untuk mengatasi halangan ini.
Substrat dan bahan kimia yang disediakan seperti berikut :1 x 6 em kertas turas Whatman No.1 ( 50 mg); 50 mM larutan tampan asetat pH 5
Aktiviti enzim diasaikan dengan menggunakan sampel sebanyak 0.025 mL ditambah dengan 1.475 mL larutan tampan. Kertas turas dimasukkan sebagai substrat. Campuran dieramkan pada 500C selama 60 minit.
Kepekatan gula penurun yang terhasil ditentukan seperti yang diterangkan dalam bahagian 3.2.9. Kawalan (blank) disediakan dengan menggantikan sampel dengan air suling. Kepekatan gula penurun ditentukan daripada lengkuk piawai yang dibentuk dengan mengunakan glukosa berkepekatan 0 hingga 500 ~l g .1 unit aktiviti FPase ditakrifkan sebagai amaun enzim yang menghasiikan 1 Il mol glukosa setara / minit.
( Lampiran 3).
3.2.13 Penentuan aktiviti xilanase
Aktiviti xilanase ditentukan dengan mengukur gula penurun yang dihasilkan menggunakan reagen DNS ( Miller ,1959) seperti dalam bahagian 3.2.9.
Sebanyak 0 .2 mL sampel enzim dicairkan ke dalam larutan tampan 50 mM natrium asetat yang mengandungi 1% 'oats spelt xylan' . Campuran ini kemudian dieram selama 30 minit pada suhu SOGe . Kawalan (blank) disediakan dengan menggantikan sampel dengan air suling. Kepekatan gula penurun ditentukan daripada lengkuk piawai yang dibentuk dengan mengunakan xilosa berkepekatan 0 hingga 500 Il g . 1 unit aktiviti xilanase ditakrifkan sebagai amaun enzim yang menghasilkan 1 Il mol gula penurunl minit.
83
3.2.14 Penentuan aktiviti amilase
Aktiviti amilase total adalah mengikut kaedah (Bernfield. 1955) ditentukan dengan mengukur gula penurun yang dihasilkan menggunakan reagen -DNS ( Miller, 1959) seperti dalam bahagian 3.2.9.
Substrat kanji larut ,1% (BDH) digunakan . Aktiviti enzim amilase total ditentukan dengan menggunakan 0.2 mL sampel yang dicairkan di dalam larutan tampan 50 mM natrium asetat pH 5 yang mengandungi 1 % w/v kanji larut (BDH) . Campuran dieram selama 30 minit pada 500 C . Kepekatan gula penurun ditentukan daripada lengkuk piawai yang dibentuk dengan mengunakan glukosa berkepekatan 0 hingga 100 !l g .
Satu unit aktiviti enzim amilase ditakrifkan sebagai sejumlah enzim yang menukarkan satu !l mol gula penurun di bawah keadaan pengasaian yang
; digunakan.
3.2 .. 15 Penentuan aktiviti pektinase
Aktiviti pektinase ditentukan dengan mengukur gula penurun yang dihasilkan menggunakan reagen DNS ( Miller ,1959) seperti dalam bahagian 3.2.9.
Aktiviti enzim pektinase total ditentukan dengan menggunakan 0.2 mL sampel yang dicairkan di dalam larutan tampan 50 mM natrium asetat pH 5 yang mengandungi 1 % pektin(BDH) daripada epal. Campuran dieram selama 30 min it pada 500 C . Kepekatan asid galakturonik ditentukan daripada lengkuk piawai yang dibentuk dengan mengunakan asid D-galakturonik berkepekatan 0 hingga 100 !l g .
Satu unit aktiviti enzim pektinase ditakrifkan sebagai sejumlah enzim yang menukarkan satu 11 mol gula penurun di bawah keadaan pengasaian yang digunakan;
3.2.16. Penentuan kandungan gula menggunakan kaedah Kromat()grafi Cecair Berkeupayaan Tinggi (HPLC)
Ekstrak dari Klason lignin setelah dineutralkan digunakan untuk menentukan kandungan glukosa , selobiosa, xilosa dan arabinosa pada sampel yang belum dikultur. Pada sampel yang telah dikultur selama 3 hari ekstrakdari kultur digunakan untuk menentukan kandungan gula .melalui HPLC. Penghasilan gula sebelum dan selepas kultur substrat pepejal akan memberi gambaran yang lebih jelas ke atas degradasi substrat oleh enzim.
Sampel dituras menerusi Sep-Pak C18(Waters, Millipore Corp., USA) diikuti dengan turas membran 0.45 11m (Millipore Corp., USA). Kolum yang digunakan ialah Sugar Pak TM (Waters, Millipore Corp., USA). F~sa bergerak adalah air suling yang telah dinyahgas menggunakan alat sonifikasi (Branson 2200, Branson Ultrasonics Co., USA). Isipadu suntikan adalah 10 uL dan sampel dikesan menggunakan alat HPLC(Waters, Millipore Corp., USA) dengan pengesan Indeks Refraktif (Waters, Millipore Corp., USA).
Larutan piawai disediakan dengan menimbang 1.0 gula, dilarutkan dalam kelalang volumetrik 50 mL menggunakan air suling.lni merupakan larutan stok. Pencairan seterusnya dilakukan bagi memperolehi kepekatan 10 hingga 100 mg/mL. Sebanyak 2 mL dari setiap larutan pencairan dituras menggunakan membran penuras 0.45 11m sebelum disuntikkan kedalam alat HPLC. Kepekatan dihitung dengan membahagikan tinggi puncak bagi sampel dengan tinggi puncak bagi larutan yang diketahui kepekatannya.
85
Kepekatan gula (mg/mL) = tinggi puncak sampel X kepekatan sampel tinggi puncak piawai
3.3. Kultur Substrat Pepejal
Bahagian pertama kajian dijalankan untuk mengkaji kesan substrat iaitu komponen batang kelapa sawit berbeza ke at as penghasilan beberapa enzim iaitu selulase (CMCase dan FPase), '&-glukosidase, xilanase, amilase dan pektinase. Oleh kerana tujuan kajian ialah penghasilan enzim mentah yang tinggi dengan .&-glukosidase, maka prinsipyang diambil dalam kajian ini ialah substrat serta nisbah kultur/medium yang didapati paling sesuai untuk penghasilan enzim '&-glukosidase akan digunakan dalam kajian selanjutnya.
Berdasarkan keputusan awal kajian ini iaitu keputusan dari Bahagian 3.3.1 dan 3.3.2, substrat seluruh (W1) di dalam nisbah BKS/medium 1:1 didapati menghasilkan aktiviti enzim .&-glukosidase yang lebih tinggi berbanding substrat -substrat lain . Berdasarkan kajian dalam Bahagian 3.3.3 , substrat seluruh WI masih menghasilkan aktiviti enzim K-glukosidase yang lebih tinggi berbanding dengan substrat seluruh W2 yang telah dikisar halus . Seterusnya kajian pengoptimuman penghasilan enzim ditetapkan ke atas substrat seluruh W1 pada nisbah BKS/medium 1:1.
Setelah substrat BKS ditetapkan, bahagian kedua kajian iaitu parameter kondisi kultur dikaji. Antara parameter kultur yang dikaji adalah kesan tempoh masa (Bahagian 3.3.4), kesan pH awal (Bahagian 3.3.5) , kesan suhu -(Bahagian 3.3.6), kesan kepekatan medium(Bahagian 3.3.7) dan kesan saiz
inokulum spora (Bahagian 3.3.8) ke atas penghasilan enzim h-glukosidase.
Setiap parameter yang didapati paling tinggi aktiviti enzimnya akan digunakan di dalam kajian berikutnya.
3.3.1. Profil aktiviti enzim selulase dari Aspergillus terreus
Aktiviti enzim yang dikaji ialah FPase , CMCase dan .h-glukosidase . Substrat batang kelapa sawit yang digunakan adalah P, V , WI ,W2 dan W3 iaitu sebanyak 2.5 g substrat dimasukkan ke dalam setiap kelalang untuk menghasilkan substrat yang lembab untuk dikultur.
Pelbagai sistem kultur substrat pepejal dikaji berdasarkan kandungan
Pelbagai sistem kultur substrat pepejal dikaji berdasarkan kandungan