BATANG KELAPA SAWIT SEBAGAI SUBSTRAT BAGI PENGHASILAN ENZIM-ENZIM LIGNOS ELULOSIK OLEI-I Aspergillus terreus MELALUI 1'EKNIK KULTUR SUBSTRAT PEPEJAL

(1)

BATANG KELAPA SAWIT SEBAGAI SUBSTRAT BAGI PENGHASILAN ENZIM-ENZIM LIGNOS·ELULOSIK

OLEI-I Aspergillus terreus MELALUI 1'EKNIK KULTUR

SUBSTRAT PEPEJAL

oleh

ANITA TALIB

Tesis yang diserahkan untuk memenuhi keperluan bagi Ijazah Sarjana Sains

1998

(2)

I I

"StUf: 7~ tk ^<lea~ We

/M

tk ~ ~ IIUf .ttwi. tI~ tk ^<lea~ Ie It4Ui «It ~u tk

~~IIUf.t~-~, ~_~tktik~ttJktp".

• 'J M IUJt ~ ~ 'J - , ~ ttJ tk _,u" .'" ttJ ^tile,'J ^dUMttJ k f.ik " tittte ~ ~ ^tICtk

~'U:, ~ ill 4It4 o«t

4-

tk eua/e<r., 4It4 e«Mf _ 4It4 tk,e, 'J ~ /U«l ^~" ^~

"

tile .

(3)

PENGHARGAAN

Segala puji bagi Allah S.W.t. diatas segala rahmat dan petunjukNya.

Saya ingin mengambil kesempatan ini untuk mengucapkan jutaan terima kasih kepada Prof. Mohd. Azemi Mohd. Noor sebagai penyelia yang telah memberi banyak bimbingan , dorongan serta nasi hat . Juga kepada Dr . Abdul Manan Dos Mohamed yang telah sudi menasihati dan membimbing saya.

Ribuan terima kasih juga diucapkan kepada semua rakari seperjuangan saya, Anis, Shariza, Astimar , Afidah, Harun, Amirul , Zahid serta rakan lain yang telah banyak memberi dorongan dan sokongan dalam projek ini. -

Penghargaan ini ditujukan juga kepada semua kakitangan makmal, pengurusan dan akademik Teknologi Makanan , Sains Kajihayat dan rakan sekerja di Pusat Matrikulasi . Terima kasih juga diucapkan kepada MSM (Malayan Sugar Manufacturing Sdn. Bhd.) dan Kouk Foundation yang membantu dari segi kewangan bagi menjayakan projek ini.

Tidak dilupakan keluarga tersayang , emak , ayah, adik-adik serta anak- anak Maryam Hanin, Muhammad Huraith, Maryam Husna , Maryam Hanan dan suami Dr. Yahya Abu Hasan, sumber inspirasi ini.

ANITA TALIB NOVEMBER 1997

(4)

KANDUNGAN

MlJKASlJRAT

PENGHARGAAN

KANDUNGAN

SENARAI RAJAH

SENARAI JADUAL

SENARAIGAMBARFOTO

ABSTRAK

ABSTRACT.

1 PE!'iGENALAN

1.1 Bahan Lignoselulosik

1.2 Enzim selulase dan &-glukosidase

1.3 Pengkulturan Substrat Pepejal

1.4 Objektif Kajian

2 TINJAUAN LITERATUR

2.1 Bahan Lignoselulosik

2.1.1 Batang kelapa sawit sebagai bahan buangan lignosel ulosik

2.1.1.1 Ciri umum

2.1.1.2 Ciri anatomi

ii

xi

xvi

xix

xxi

xxiii

1

2

4

6

10

(5)

2.1.2

2.1.3

2.1.4

2.1.5

2.1.1.3 Ciri fizikal

2.1.1.4 Ciri kimia

2.1.1.5 Kegunaan dan potensi

Struktur selulosa

Struktur hemiselulosa

Struktur lignin

Kesan kehadiran lignin dan kesan struktur selulosa ke atas hidrolisis berenzim

12

13

14

17

19

20

2.2 Mikroorganisma Pengurai Lignoselulosa 22

22 2.2.1

2.2.2

Kulat

Bakteria:

2.3 Enzim selulase

23

25

25 2.3.1

2.3.2

2.3.3

2.3.4

2.3.5

Endoglukanase

Eksoglukanase

K- glukosidase

Mekanisma tindakbalas selulase

33

2.3.4.1 Tindakbalas awal 33

2.3.4.2 Sinergisma antara kOMponen selulase 3S

Penghasilan sel ulase 39

2.3.5.1 Kesan strain mikroorganisma 39

(6)

iv

(7)

3 BAHAN DAN KAEDAH 67

3.1 Bahan dan Kaedah am 67

3.1.1 Sumber substrat 67

3.1.2 Penyediaan substrat batang kelapa sawit 67

3.1.3 Kaedah Pensterilanl Praolahan 68

3.1.4 Sumber mikroorganisma. 68

3.1.5 Media kultur mikroorganisma 69

3.1.6 Pemeliharaan kultur 69

3.1.7 Penyediaan inokulum 70

3.1.8 Penyediaan medium Toyama 70

3.1.9 Penyediaan ekstrak enzim dari kultur substrat 70 pepejal

3.1.10 Penyediaan ekstrak enzim dari kultur 71 tenggelam

3.1.11 Mikroskop elektron penskanan 72

3.2 Analisis kimia 72

3.2.1 Larutan tampan 73

3.2.2 Penentuan kandungan lembapan 75

3.2.3 Penentuan kandungan abu 75

3.2.4 Penentuan kandungan lignin (Kaedah Klason) 76

(8)

3.2.5 Penentuan kandungan holoselulosa

3.2.6 Penentuan kandungan selulosa 3.2.7 Penentuan kandungan kanji 3.2.8 Penentuan protin larut

3.2.9 Penentuan gula penurun

3.2.10 Penentuan aktiviti R-glukosidase

3.2.11 Penentuan aktiviti endoglukanase( CMease)

3.2.12 Penentuan aktiviti selulase total(FPase) 3.2.13 . Penentuan kandungan xilanase

3.2.14 Penentuan kandungan amilase 3.2.15 Penentuan kandungan pektinase

3.2.16 Penentuan kandungan gula. menggunakan kaedah Kromatografi Ceeair Berkeupayaan Tinggi (HPLC)

3.3 Pengkulturan Substrat Pepejal

3.3.1

3.3.2

Aktiviti enzim selulase dari Aspergillus terreus

Aktiviti enzim xilanase , pektinase dan amilase dari Aspergillus terreus

vi

I ,

78

79

80

81

82

- 83

84

85

86

87

89

(9)

3.3.3 Kesan saiz partikel ke atas aktiviti enzim R-glukosidase dalam batang kelapa sawit.

3.3.4 Kesan masa pengkulturan ke atas aktiviti enzim R-gl u,kosidase

3.3.5 Kesan pH awal ke atas aktiviti enzim g-glukosidase ~

3.3.6 Kesan suhu ke atas aktiviti enzim R-glukosidase 91

3.3.7 Kesan kepekatan medium nutrien ke atas aktiviti 91 enzim g,-glukosidase

3..3.8 Kesan jumlah spora ke atas aktiviti enzim

J~-gl ukosidase

91 -

3.4 Pencirian enzim mentah(crude) R-glukosidase dari kultur substrat pepejal dan kultur tenggelam

92

3.4.1 pH optimum enzim 3.4.2 Kestabilan pH enzim

3.4.3 Suhu optimum enzim

3.4.4 Kestabilan terma enzim 3.5 Sakarifikasi bahan selulosik

3.5.1 Sampel selulosa

3.5.2 Enzim selulase 3.5.3 Enzim selobiase

3.5.4 Hidrolisis keatas selulosa mikrohablur (Avicel)

92 92

93

93 94

94 94

95

(10)

4

3.5.5 Hidrolisis keatas sampel parenkima (P)

KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN

4.1 Kesan Substrat

4.1.1

4.1.2

4.1.3

4.1.4

4.1.5

4.1.6

4.1.7

Komposisi kimia batang kelapa sawit

Aktiviti enzim .&-glukosidase dari komponen batang kelapa sawit berbeza setelah dikultur dengan Aspergillus terreus

Aktiviti enzim CMCase dari komponen batang kelapa sawit berbeza setelah dikultur dengan Aspergillus, te.rreus

Aktiviti enzim FPase dari komponen batang kelapa sawit berbeza setelah dikultur dengan Aspergillus terreus

Kandungan gula penurun dari komponen batang kelapa sawit berbeza setelah dikultur dengan Aspergillus terreus

Aktiviti enzim selulase, xilanase, pektinase dan amilase dari komponen batang kelapa sawit berbeza setelah dikultur dengan Aspergillus terreus selama 3 hari.

Kandungan glukosa , xilosa, arabinosa dan selobiosa yang dihasilkan dari batang kelapa sawit sebelum dilakukan kultur substrat pepejal.

viii

96

98

98 99 104

112

119

126

134

140

(11)

4.1.8 Kandungan glukosa . xHosa . arabinosa dan 141 selobiosa yang dihasilkan dari batang kelapa

sawit setelah dilakukan kultur substrat pepejal.

4.1.9 Kes~ saiz partikel substrat ke atas aktiviti 144 enzim R-glukosidase dalam pengkulturan

substrat pepejal batang kelapa sawit

4.2 Kesan Kondisi Kultur 149

4.2.1 Kesan tempoh mas a pengkulturan ke atas aktiviti 149 enzim R-glukosidase dalam pengkulturan substrat

pepejal batang kelapa sawit

4.2.2 Kesan pH aw·.:J ke atas aktiviti enzim R-glukosidase 152 dalam pengkulturan substrat pepejal batang

kelapa sawit

4.2.3 Kesan suhu ke atas aktiviti enzim K-glukosidase 154 dalam pengkulturan substrat pepejal batang

kelapa sawit.

4.2.4 Kesan kepekatan medium ke atas aktiviti enzim 156 R-glukosidase dalam pengkulturan substrat

4.2.5 KesaD. saiz inokulum spora ke atas aktiviti enzim 158 K-glukosidase dalam pengkulturansubstrat

(12)

5

6

7

4.3

4.4

4.5

Pencirian enzim mentah dari kultur substrat pepejal dan kultur tenggelam

4.3.1 pH optimum

4.3.2 Kestabilan pH 4.3.3 Suhu optimum

4.3.4 Kestabilan suhu

Kesan penambahan enzim R-glukosidase ke atas sakarifikasi bahan selulosik

Kajian Mikroskopi Elektron Penskanan( 'Scanning Electron- Microscopy')

4.5.1

4.5.2

Corak tumbesaran dan kesan kultur substrat pepejal ke atas substrat batang kelapa sawit Kesan tindakbalas enzim ke atas substrat selulosa mikrohablur (Avice!)

KESIMPULAN

CADANGAN KAJIAN LANJUTAN

BIBLIOGRAFII RUJUKAN

LAMPI RAN

x

160

160 161

165 165

170

180

189

198

203

205

(13)

SENARAI RAJAH

RAJAH TAJUK MlJKASlIRA T

Rajah 2.1 Keratan rentas batang kelapa sawit -pembahagian 11 mengikut bahagian anatomi berbeza (ubahsuai dari

Abdul Razak et al.,1991)

Rajah 2.2 Struktur ringkas selulosa ( Reese et al.,1972) 18

Rajah 2.3 Perencatan g-glukosidase Aspergillus niger oleh 32 glukosa

Rajah 2.4 Hipotesis asal dan hipotesis baru untuk mekanisme 34 indakbalas selulase yang melibatkan komponen Cl

Rajah 2.5 Tindakan enzim dalam hidrolisis 37

Rajah 2.6 Laluan untuk hidrolisis enzimatik selulosa 38 (Enari et al.,1987).

;>. Rajah 2.7 Penghasilan enzim melalui fermentasi koji (Bailey 53

dan Ollis,1986)

" Rajah 2.8 Tumbesaran kulat atas substrat pepejal (ubahsuaian

,

•

~' Weiland, 1986).

Rajah 2.9 Model deskriptif tumbesaran Rhizopus oligosporus 61 di atas substrat pepejal (Mitchell et al.,1991b).

Rajah 3.1 Ringkasan teknik kultur substrat pepejal pada skala 88 makmal

(14)

Rajah 4.1 Aktiviti enzim ~ glukosidase di dalam sampel batang 108 kelapa sawit berbeza setelah dikultur selama 5 hari.

Rajah 4.2 Aktiviti enzim ~ glukosidase di dalarn sarnpel batang

109

-kelapa sawit berbeza setelah dikultur selarna 10 hari.

Rajah 4.3 Aktiviti enzim ~ glukosidase di dalarn sarnpel batang 110 kelapa sawit berbeza setelah dikultur selarna 15 hari.

Rajah 4. 4 Aktiviti enzim ~ glukosidase di dalarn sampel batang 111 kelapa sawit berbeza setelah dikultur selarna 20 hari.

Rajah 4.5 Aktiviti enzim CMCase di dalarn sampel batang kelapa 115 sawit berbeza setelah dikultur selama 5 hari.

Rajah 4.6 Aktiviti enzim CMCase di dalam sampel batang kelapa 116 sawit berbeza setelah dikultur selama 10 hari.

Rajah 4.9 Aktiviti enzim FPase di dalam sampel batang kelapa 122 sawit berbeza setelah dikultur selama 5 hari.

xii

(15)

Rajah 4. 12 Aktiviti enzim FPase di dalam sampel batang kelapa 125 sawit berbeza setelah dikultur selama 20 hari.

Rajah 4.13 Penghasilan gula penurun dari komponen batang 130 kelapa sawit berbeza setelah dikultur selama 5 hari

Rajah 4.16 Penghasilari gula penurun dari komponen batang 133 kelapa sawit berbeza setelah dikultur selama 20 hari

Rajah 4.17 Peratus kehilangan berat dari substrat batang 138 ke1apa sawit berbeza setelah dikultur menggunakan

A.terreus selama 3 hari

Rajah 4.18 Kesan substrat berbeza ke atas aktiviti enzim 139 R-glukosidase serta perubahan pH setelah dikultur

dengan A. terreus selama 3 hari.

Rajah 4.19 Kesan saiz partikel substrat batang kelapa sawit 147 ke atas aktiviti enzim R-glukosidase serta perubahan

pH setelah di kultur substrat pepejal se1ama 5 hari.

Rajah 4.20 Kesan saiz partikel substrat batang kelapa sawit 148 ke atas aktiviti enzim R-glukosidase serta perubahan

pH setelah di kultur substrat pepejal selama 10 hari.

(16)

Rajah 4.21 Kesan masa pengkulturan ke atas aktiviti enzim 151

~-glukosidase .

Rajah 4.22 Kesan pH awal ke atas aktiviti enzim ~-glukosidase 153

Rajah 4.23 Kesan suhu ke atas aktiviti enzim ~-glukosidase 155 setelah dikultur selama 6 hari. (Substrat WI,

pH awal 5)

Rajah 4.24 Kesan kepekatan medium ke atas aktiviti enzim 157

~-glukosidase setelah dikultur selama 6 hari.

(Substrat W1,pH awal 5, Suhu 35OC)

Rajah 4.25 Kesan saiz inokulum sp~ra ke atas aktiviti enzim 159

~-glukosidase setelah dikultur selama 6 hari.

(Substrat W1,pH awal 5, Suhu 35OC)

Rajah 4.26 Kesan pH ke atas aktiviti enzim ~-glukosidase dari 163 kultur substrat pepejal dan kultur tenggelam

Rajah 4.27 Kesan pH ke atas kestabilan aktiviti enzim

~-glukosidase dari kultur substrat pepejal dan kultur tenggelam.

164

Rajah 4.28 Kesan suhu ke atas aktiviti enzim ~-glukosidase 168 dari kultur substrat pepejal dan kultur tenggelam.

Rajah 4.29 Kesan suhu ke atas kestabilan aktiviti enzim 169

~-glukosidase dari kultur substrat pepejal dan kultur tenggelam.

xiv

(17)

Rajah 4.30 Kesan penambahan enzim selobiase dan K-glukosidase 174 ke atas hidrolisis 1 %(w/v) selulosa mikrohablur

(Avicel) pada pH 4.8, suhu 480(: dan kadar goncangan 150 rpm.

Rajah 4.31 Kesan penambahan enzim selobiase dan K-glukosidase 175 ke atas hidrolisis 1% (w/v)parenkirna pada pH 4.8,

suhu 48⁰C dan kadar goncangan 150 rpm.

(18)

SENARAI JADUAL

JADUAL TAJUK MUKASURAT

Jadual2.8 Aktiviti, tindakbalas,hasii akhir dan ciri ekso-JU,4- 28 glukanase 3.2.1.91 (Mandels,1983)

xvi

(19)

]adual2.9 Selobiase atau '&-D-glukosidase (3.2.1.21). 29

]adual2.10 Ciri fizik kimia '&-D-glukosidase dari Aspergillus 31 niger

]adual2.11 Aktiviti selulase dalam komponen T. koningii dan 36 F. solani bila ditindakkan secara berasingan dan

bersama.

]adual2.12 Ciri eksoglukanase dari pelbagai kulat 41 ( Coughlan, 198 5)

]adual2.13 Ciri endoglukanase dari pelbagai kulat 42 ( Coughlan,1985)

jadual2.14 Ciri R-glukosidase dari pelbagai kulat 43 ( Coughlan,1985)

jadual2.15 Koji sebagai sumber eksoenzim(selulase 54 dan .8.-glukosidase).

jadual2.16 Perbezaan antara kultur substrat pepejal dan kultur 56 tenggelam.

.', jadual3.1 Penyediaan larutan tampan asetat 73

"

~,

r

t

^jadual3.2 Penyediaan larutan tampan fosfat 74

!,

jadual4.1 Kandungan lembapan,abu, selulosa, holoselulosa, 100

~ ~'

i· t lignin dan kanji dalam komponen batang kelapa sawit berbeza.

jadual4.2 Aktiviti beberapa enzim dari substrat batang kelapa 137 sawit berbeza setelah dikultur dengan

-

(20)

]adual4.3 Kandungan gula (Kaedah HPLC) dalam komponen 140 batang kelapa sawit berbeza setelah dihidrolisis

dengan asid.·

]adual4.4 Kandungan gula (Kaedah HPLC) dalam komponen 143 batang kelapa sawit berbeza .

xviii

(21)

SENARAIGAMBARFOTO

(22)

Gambarloto 4.9 Mikrograf elektron penskanan menunjukkan 192 (a) dan (b) struktur partikel selulosa mikrohablur(Avicel)

yang digunakan sebagai kawalan.

setelah dihidrolisis dengan 1% selulase + 2.5U selobiase (Novozym) selama 48 jam.

setelahdihidrolisis dengan 1% selulase + 2.5U R-glukosidase dari A.terreus selama 48 jam.

Gambarfoto 4.12 Mikrograf elektron penskanan menunjukkan 195 (a) dan (b) struktur sel parenkima dari batang kelapa sawit

yang dig una sebagai kawalan.

setelah dihidrolisis dengan 1% selulase + 2.5U selobiase (Novozym) selama 48 jam.

setelah dihidrolisis dengan 1% selulase + 2.5U R-glukosidase dari A.terreus selama 48 jam.

xx

(23)

ABSTRAK

Batang kelapa sawit(BKS) diasingkan kepada 3 komponen utama iaitu pa:enkima(P), berkas vaskular(V) dan sampel seluruh(W) . Tiga sampel seluruh dikaji iaitu sampel kering (WI), sampel kering yang dikisar(W2) dan sampel basah ataupun 'green' (W3). Kesemua sampel tersebut dikultur substrat pepejal dengan menggunakan Aspergillus terre us. Substrat BKS ditambah dengan medium Toyama dalam nisbah bks/medium berbeza (dari

1:1 hingga 1: 8) dan didapati Aspergillus terreus yang dikultur atas komponen batang kelapa sawit berbeza hasilkan profil enzim selulase dan K-glukosidase yangspesifik.

Parenkima hasilkan endoselulase -(CMCase) dan selulase total(FPase) yang tinggi, iaitu sebanyak 18.4U dan 4.0U/g substrat, berbanding dengan berkas vaskular 12.2U dan O.8U/g substrate Substrat seluruh (WI) hasilkan enzim R-glukosidase yang dua kali ganda (2X) lebih tinggi dari parenkima dan berkas vaskular iaitu 4.3U/g substrate Aktiviti enzim CMCase dan FPase dari substrat seluruh (WI) juga tinggi iaitu sebanyak 14.3U dan 2.2U/g substrat masing-masing.

Aktiviti enzim juga didapati berkait rapat dengan nisbah bks/medium ataupun kandungan cecair di dalam kultur. Substrat seluruh (WI) didapati menghasilkan aktiviti R-glukosidase paling tinggi dalam kultur yang agak kering iaitu nisbah 1: 1 berbanding dengan nisbah 1 : 4 dan 1: 6 untuk enzim CMCase dan FPase.

(24)

Gabungan kultur substrat pepejal batang kelapa sawit dengan Aspergillus terre us ini juga didapati boleh rnenghasilkan enzirn xilanase. ami lase dan pektinase.

Beberapa parameter kultur dikaji seperti kesan saiz partikel. mas a , pH awal ,suhu, kepekatan medium dan saiz inokulurn spora.

Penghasilan R-gl ukosidase didapati paling tinggi dari substrat seluruh( WI) yang bersaiz partikel besar (0.5 -1 crn). Enzim R-gl ukosidase didapati optimum pada hari ke-6, pH awal 5, suhu 350(:, kepekatan medium separuh (1/2X) dan saiz inokuhirn spora sebanyak 2.1XI01. Dengan pengoptimuman, aktiviti R-glukosidase ditingkatkan sebanyak 34.8% iaitu dari 4.3U ke 5.8U/g substrat.

Pencirian keatas enzim mentah (crude) dilakukan dan enzim R-glukosidase didapati mempunyai ciri kestabilan termal iaitu aktiviti kekal sebanyak 90% pada 600(:. Suhu optimumnya 350C manakala pH optimumnya pH S.2 dan aktivitinya stabil dian tara pH 5 dan pH 6.

Enzim &-glukosidase yang dihasilkan seterusnya dig una dalam kajian hidrolisis . Substrat selulosa mikrohablur (Avicel) dan parenkima yang ditindak oleh 1%(v/v) selulase dan ditambah dengan 2.5U &-glukosidase menunjukkan peratus hidrolisis yang lebih tinggi iaitu sebanyak 85% ke atas selulosa mikrohablur (Avicel) dan 19.5% ke atas parenkima, berbanding penambahan enzim kornersil, selobiase (Novozyrne) yang sarna aktivitinya .

xxii

(25)

THE OIL PALM TRUNK AS A SUBSTRATE FOR LIGNOCELLULOSIC ENZYMES PRODUCTION WITH Aspergillus terreus USING SOLID SUBSTRATE

FERMENTATION TECIINIQUE.

ABSTRACT

Oil palm stem( ops) was initially separated into three different components, i.e. parenchyma(P), vascular bundles(V) and also left intact, i.e. whole oil palm stem(W). Three different whole ops samples were studied i.e. dried sample(W1), dried and ground up sample(W2) and 'green' samples (W3).

Solid substrate fermentation was then carried out on the oil palin stem components using Aspergillus terreus. The substrates were supplemented with Toyama's medium in different opslmedium ratios, ranging from 1: 1 to 1:8 and the results showed that the Aspergillus terreus cultured on different components of the oil palm stem produced specific cellulase and g-glucosidase enzyme profiles.

Higher cellulase activities i.e. endocellulase( CMCase) and total cellulase(FPase) were obtained from the parenchyma portion compared to the vascular bundles i.e. 18.4SU and 4.01U compared to 12.2U and O.8U/g substrate respectively.

Highest activities of g-glucosidase was produced from the whole oil palm stem(W1) whereby the activities are two times(2X) higher compared to g- glucosidase from the vascular bundles(V) and the parenchyma (P).The CMCase and FPase from the whole oil palm stem(W1) are 14.29U and 2.21 U/g of substrate, which is relatively quite good.

(26)

The enzyme activities were also dependent on the ops/ medium ratios. the highest R-glucosidase activities were in the 1: 1 ratio which is quite 'dry'.

CMCase and FPase activites were highest in the 1: 4 and 1: 6 ratios respectively.

This combination of solid substrate fermentation of oil palm stem using Aspergillus terreus was found to produce other enzymes such as xylanase, amylase and pectinase.

Several parameters of cultivation were studied i.e. the particle size, time of incubation, initial pH, temperature, concentration of medium and spore inoculum size.

The whole oil palm stem(W1) with larger particle sizes (0.5 -1 cm) produced higher activities of R-glucosidase . Optimum production of R-glucosidase was found with the following parameters Le. incubation time of 6 days, with an initial pH of 5, an incubation temperature of 35 OC ,using half strength medium(1/2X) and 2.1XI07 spores.Following optimisation, R- glucosidase activities were increased from 4.3U to 5.8U, indicating an increase of 34.8%.

Characterisation of the crude enzymes has shown the R-glucosidase to be thermostable with 90% of its activities retained at 60⁰C. The optimum temperature is 35OC.The optimum pH is 5.2 and the enzyme is stable between pH 5 and 6.

xxiv

(27)

The ~-glucosidase produced was finally tested in hydrolysis reactions using micro crystalline cellulose (Avicel) and parenchyma as substrates. Both substrates show greater degree of hydrolysis after 2.SU ~-glucosidase was added to the initial 1% (v Iv) cellulase ,compared to supplementing with ceUobiase (Novozyme) adjusted to the same activities. The degree of hydrolysis achieved in both micro crystalline cellulose (Avicel) and parenchyma were 85% and 19.5% respectively.

(28)

1 PENGENALAN

1.1 Batang kelapa sawit sebagai bahan buangan lignoselulosik

Bahan lignoselulosik mudah didapati dari sisa tanaman serta perhutanan dan merupakan sumber selulosa yang paling murah (Chahal ,1985). Di Malaysia, suatu dari sumber utama bahan lignoselulosa ialah pokok kelapa sawit yang mempunyai jangka hay at selama 25 hingga 30 tahun. Semenjak tahun 1985, penanaman semula telah dijalankan secara besar-besaran dan ini menghasilkan sisa buangan seperti batang kelapa sawit, pelepah dan

tandan kosong yang banyak.

Berdasarkan anggaran untuk tahun 1994, sisa dari batang kelapa sawit adalah hampir 4.6 juta tan manakala 23.5 juta tan adalah dari pelepahnya.

Menjelang tahun 2000, sisa dari batang kelapa sawit dianggarkan meningkat sehingga 7 juta tan manakala dari pelepah, anggarannya ialah sebanyak 26.2 juta tan (Salleh,1994). Pelupusan bahan buangan lignoselulosa yang sebanyak ini adalah diantara masalah yang dihadapi oleh peladang- peladang masa kini dan mas a hadapan. Proses pelupusan sisa tanaman kelapa sawit bukan sahaja melibatkan tenaga dan kos yang tinggi, ia juga suatu pembaziran sumber.

Memandangkan batang kelapa sawit merupakan suatu sumber yang mempunyai potensi untuk dipelbagaigunakart , maka banyak kajian telah dijalankan. Dalam tinjauan oleh Abdul Razak et aJ (1991) antara kajian yang telah dijalankan ialah penghasilan bahan-bahan panel, pulpa dan kertas, bahan makanan ternakan dan sebagai sumber bahanapi dan tenaga. Sehingga kini bahagian parenkima dalam batang kelapa sawit

1

(29)

banyak digunakan sebagai makanan ternakan kaya kanji manakala bahagian berkas vaskular berpotensi untuk digunakan dalam industri gentian pulpa, panel dan kertas. Aplikasi untuk kedua bahagian ini adalah berbeza dan kehadiran parenkima dalam berkas vaskular tidak sesuai untuk penghasilan pulpa manakala kehadiran berkas vaskular dalam parenkima pula tidak sesuai sebagai makanan ternakan (Gallacher et al.,1993; Lubis et al., 1994).

1.2 Enzim selulase dan ~-glukosidase

Selulase dan ~-glukosidase iaitu enzlm yangaktif dalam menyahpolimerkan selulosa adalah gabungan kompleks beberapa enzim.

Selulase yang terdiri dari endo dan eksoglukanase bertindak ke atas selulosa dan menghasilkan selobiosa. Seterusnya selobiosa ditukarkan kepada glukosa oleh ~-glukosidase ataupun selobiase (Enari,1983).

Enzim selulase digunakan sebagai pembantu pencernaan , ekstraksi komponen teh hijau, pengubahsuaian tisu makanan , peleraian kulit biji kacang soya, meningkatkan kualiti makanan lembu dan penekstrakan jus atau lain-lain produk dari tumbuhan (Toyama, 1969).

Satu lagi kepentingan enzim selulolitik ialah dalam hidrolisis enzimatik dan fermentasi bahan buangan selulosa kepada glukosa , etanol , sirap tinggi fruktosa dan bahan kimia lain daripada bahan buangan selulosik (Emert. dan .Katzen , 1980). Hidrolisis enzimatik lebih digemari dalam aplikasi industri kerana berbanding dengan hidrolisis asid ia mempunyai kelebihan seperti keadaan operasi yang sederhana, penghasilan tinggi, hasil yang tulen dan semua ini menolong menjimatkan kos (Borriss, 1987 ; -

(30)

Enari. 1983; Teeri.1997). Namun begitu hidrolisis enzimatik melibatkan pengunaan enzim selulase yang banyak dan harganya mahal.

terutamanya jika enzim ditulenkan. Menurut Teeri (1997) kebanyakkan aplikasi enzim selulolitik kini dijalankan dengan menggunakan enzim mentah yang tidak spesifik berbanding dengan enzim tulen.

Secara umum sistem selulase dari Trichoderma telah didapati paling berkesan dalam hidrolisis (Mandels, 1975). Walaupun sistem selulase Trichoderma mengandungi banyak ekso dan endoglukanase, ia kekurangan f3-glukosidase (Herr, 1979 ; Sternberg,1976 ). Kekurangan ~-

' - glukosidase akan menyebabkan peningkatan selobiosa dan kehadiran selobiosa merencatkan sistem enzim selulolitik (Halliwell, 1975 ; Wood dan McCrae, 1975) dan seterusnya merencatkan l<onversi selulosa kepada glukosa. Untuk meningkatkan hidrolisis enzimatik biomassa selulosik, selulase dari Trichoderma perlu ditambah atau disuplemen dengan j3-

glukosidase daripada mikroorganisma lain (Sternberg et al., 1977 , Allen dan Sternberg ,1980).

Enzim selulase dan ~-glukosidase biasanya dihasilkan dari pelbagai substrat terutama hampas gandum dan padi (Deschamps,1985; Shamala dan Sreekantlah,1986). Tidak banyak kajian penghasilan enzim selulase dan ~

glukosidase dilakukan ke atas sisa bahan kelapa sawit. Antara kajian yang telah dijalankan ialah melalui teknik kultur tenggelam ke atas tandan buah kelapa sawit (Umi Kalsum dan Baharudin.,1994) dan juga teknik fermentasi dalam reaktor (Putri Faridatul e tal., 1991) dengan menggunakan batang kelapa sawit yang dikisar. Antara kekurangan teknik kultur tenggelam ialah penghasilan enzim yang kurang pekat

3

(31)

berbanding teknik kultur substrat pepejal (Macris er al.,l987;

Hesseltine,1977)

1.3 Teknik kultur substrat pepejal

Pengkulturan Substrat Pepejal (PSP) iaitu suatu kaedah dimana mikroorganisma dikulturkan di dalam substrat pepejal lembab tanpa kehadiran air bebas (Aidoo , 1982). Substrat pepejal yang dilembabkan dengan cecair medium bertindak sebagai sumber karbon, nitrogen dan mineral kepada mikroorganisma . Tumbesaran mikroorganisma di atas substrat pepejal adalah seperti di dalam habitat semulajadi dan kondisi kultur optimum ini memudahkan penghasilan produk seperti enzim dan lain-lain metabolit sekunder (Hesseltine,1977).

Beberapa kelebihan teknik kultur substrat pepejal ialah ia mudah digunakan ke atas sisa tanaman, tidak memerlukan pensterilan serta tidak memerlukan kos yang tinggi . Permukaannya yang kurang cecair berbanding kultur tenggelam , mengurangkan kontaminasi bakteria serta memudahkan penekstrakan prod uk (Hesseltine, 1977).

1.4 Objektif Kajian

Objektif kajian ini adalah penghasilan enzim mentah iaitu selulase dan K- glukosidase dari komponen batang kelapa sawit berbeza melalui teknik kultur substrat pepejal dengan menggunakan kulat Aspergillus terreus .

fi Pengoptimuman penghasilan enzim akan dikhususkan kepada enzim K-

t

(32)

f _f

glukosidase walaupun profil umum aktiviti enzim lain seperti xilanase.

amilase dan pektinase juga akan dikaji.

Untuk tujuan ini batang kelapa sawit akan difraksionasi kepada dua komponen utama iaitu parenkima(P) dan berkas vaskular(V) . Ia juga akan dikaji dalam bent uk seluruh(Wl,W2 dan W3). Tujuan fraksionasi adalah untuk meningkatkan potensi penggunaan substrat batang kelapa sawit serta membuat perbandingan untuk mendapatkan substrat yang paling sesuai untuk penghasilan enzim E,-glukosidase.

Selaindari faktor substrat, faktor kondisi kultur juga penting dalam penghasilan enzim. Beberapa kondisi kultur akan dikaji bagi mendapatkan parameter optimum untuk penghasilan enzim E,-glukosidase.

Pengoptimuman penghasilan enzim dikhususkan kepada enzim E,- glukosidase kerana enzim ini adalah kadar penghad ('rate limiting') di dalam penghasilan gula melalui hidrolisis . Seterusnya enzim mentah E,- glukosidase akan dicirikan serta diuji kesesuaiannya dalam meningkatkan kadar hidrolisis substrat selulosa dan lignoselulosa.

Antara faktor penting dalam kajian ini adalah interaksi antara substrat (batang kelapa sawit), mikroorganisma(Aspergillus terre us) dan teknik penghasilan enzim(Pengkulturan Substrat Pepejal).

5

(33)

2 TINJAUAN LITERATUR

2.1. Bahan Lignoselulosik

2.1.1. Batang kelapa sawit sebagai bahan buangan lignoselulosik.

Batang kelapa sawit adalah merupakan sisa dari pokok kelapa sawit yang telah tamat tempoh hayat penghasilan minyak sawitnya. Ia dikelaskan seperti di bawah:

Order: Palmales Famili: Palmaceae Subfamili : Cocoideae

Nama Latin : Elaeis guineensis

Kelapa sawit berasal dari Afrika Barat dan diperkenalkan di Malaysia dalam tahun 1870. Sejak dari itu ia telah digunakan dalam pelbagai segi dari tumbuhan hiasan hingga ke tahap kegunaan industri. Penanaman kelapa sawit mula berkembang sejak kejatuhan harga getah pada awal tahun 1960an. Dalam tahun 1970 hanya terdapat lebih kurang 300,000 hektar(jadual 2.1) ladang kelapa sawit berbanding dengan 1993, sudah mencapai 2.2 juta hektar (Anonymous,1993.)

(34)

]adual 2.1 ]umlah keluasan kawasan tanaman kelapa sawit (hektar) Statistics on Commodities Ministry of Primary Industries, Malaysia (1990).

Tahun Sem.M'sia Sabah Sarawak ]umlah

1970 260903 28947 1117 290967

1975 568561 59139 14091 641791

1980 906590 93967 22749 1023306

1985 1292399 152541 23274 1468214

1986 1410923 162645 25743 1599311

1987 1460502 182612 29761 1672875 .

1988 1539797 211763 34101 1785661

Sejak tahun 1985, penanaman semula secara besar-besaran telah dijalankan dan ini menghasilkan banyak batang,pelepah dan tandan kelapa sawit. Chow (1982) menganggarkan bahawa pada tahun 2000 akan terdapat 83,594 hektar ladang kelapa sawit yang ditanamsemula (Jadual 2.2) dan anggaran dari segi isipadu oleh Khali Aziz dan Wan Razali (1989) menunjukkan bahawa isipadu batang kelapa sawit akan mencapai 2004 juta meter padu dalam tahun 1998 (Jadual 2.3)

7

(35)

jadual 2.2 jumlah luas kawasan ladang kelapa sawit yang dianggarkan akan ditanamsemula antara tahun 1989-2000 (Chow, 1982).

Tahun Sem. M'sia Sabah /Sarawak Jumlah

1989 9650 1938 11588

1990 11500 4204 15704

1991 21150 7342 28492

1992 30250 9932 40182

1993 35500 12822 48322

1994 39400 15356 54756

1995 37150 14872 52022

1996 38550 13220 51770

1997 62100 11138 73238

1998 79000 9996 88996

1999 76100 8628 84728

2(0) 75800 7794 83594

(36)

Jadual 2.3 Jumlah isipadu batang kelapa sawit yang dianggarkan terdapat di Malaysia setiap tabun di antara tabun 1989 -2000 (Khali Aziz dan Wan Razali 1989).

Tahun Sem.Malaysia Sabah /Sarawak Jumlah

1989 2.210 0.444 2.655

1990 2.634 0.%3 3.597

1991 4.843 1.681 6.524

1992 6.927 2.274 9.201

1993 8.130 2.936 11.066

1994 9.023 3.516 12.539

1995 8.507 3.406 11.913

1996 8.828 3.027 11.855

1997 14.221 2.551 16.772

1998 18.091 2.289 20.380

1999 17.427 1.976 19.403

2000 17.358 1.785 19.143 .

Berdasarkan data dari ketiga-tiga jadual di atas (Jadual 2.1, 2.2 dan 2.3) dapat diperhatikan betapa banyaknya bahan buangan yang dihasilkan dari tanaman kelapa sawit . Pelupusan baban buangan ini bukan suatu perkara yang mudah kerana beberapa sebab , diantaranya ialah ia tidak boleh dibakar dengan mudah kerana kandungan lembapannya tinggi , kadangkala sehingga melebihi 500% (berdasarkan berat kering). Jika dibiarkan ia diladang pula akan menjadi suatu penghalang untuk

9

(37)

penanaman semula. selain daripada itu ia juga merupakan habitat semulajadi untuk kumbang dan kulat Ganodenna spp.

Pada masakini cara yang paling sesuai ialah meracun batang kelapa sawit tersebut sebelum ianya ditebang , dipotong dan dibakar. Inilah satu-satunya cara untuk mempercepatkan kadar penguraiannya walaupun membakar akan mencemarkan persekitaran. Membakar batang kelapa sawit juga merupakan suatu pembaziran sumber yang berpotensi tinggi .

2.1.1.1. Cirt umum

Batang kelapa sawit mempunyai ketinggian dari 7 hingga 13 meter dengan garispusat antara 45 dan 65 sm. (diukur 1.5 meter dari perrilukaan tanah) dan batang ini meruncing ke arah pucuk (Mohamad et aI., 1985).

2.1.1.2. Cirt anatomi

Kajian ten tang anatomi batang kelapa sawit telah dijalankan oleh Killmann dan Lim (1985). Tumbesaran dan peningkatan dalam garispusat batang kelapa sawit adalah berpunca dari pembahagian serta pembesaran sel parenkima bersama dengan pembesaran fiber dalam berkas vaskular. Mengikut Tomimura (1992) peratusan berkas vaskular dan parenkima adalah antara 71-76% dan 24-29% masing-masing.

(38)

Satu keratan rentas dalam batang kelapa sawit menunjukkan tiga bahagian utama iaitu korteks , periferi dan zon tengah seperti dalam

Rajah 2.1

Serkas vaskular Sahagian dalam

Parenkima

Sahagian tengah

Sahagian perifen :

~.::::::.Lu..;~~

Kulit luar

Rajah 2.1 Keratan rentas batang kelapa sawit - pembahagian mengikut bahagian anatomi berbeza (ubahsuai dari Abdul Razak et aJ., 1991)

Korteks.

Korteks adalah bahagian luar batang yang anggaran lebarnya ialah antara 1.5 -3.5 sm. Ia terdiri dari tisu parenkima dengan fiber memanjang dan tanpa bentuk tetap serta berkas vaskular.

11

(39)

Periferi

Kawasan periferi terdiri dari lapisan nipis parenkima dan banyak berkas vaskular dan membentuk zon penyokongan utarna dalarn batang.

Tengah

Zon tengah merupakan 80% dari jumlah perrnukaan terdiri dari berkas vaskular yang lebih besar dan benaburan didalarn tisu parenkima.

Berkas vaskular

Setiap berkas vaskular dibina dari lapisan berfiber , sel floem , xilem dan sel parenkima. Mengikut Lim dan Khoo (1986) jumlah berkas vaskular semakin mengurang ke zon dala.ll1an manakala dari bawah keatas ia sernakin kurang di bahagian atas batang.

Tisu parenkirna

Sel parenkima asas kebanyakannya terdiri dari sel berbentuk sfera yang berdinding nipis kecuali di dalarn kawasanberharnpiran berkas vaskular (lim dan Khoo ,1986).

2.1.1.3. Ciri fizikal .

Ciri fizikal batang kelapa sawit boleh diperhatikan dari kelernbapan , ketumpatan dan dimensi fiber (Kil1rnann dan lim 1985).

Dari kajian tersebut ke1embapan didapati berubah antara 100 hingga 500% dengan peningkatan dari bawah ke atas dan dari zon luar ke zon tengah. Perbezaan kandungan lembapan ini adalah berkait rap at dengan penyebaran sel parenkima yang menyimpan lebih lembapan dati berkas vaskular.

(40)

Nilai ketumpatan batang kelapa sawit juga berbeza mengikut bahagian . Nilainya adalah dari julat 200 hingga 600 kg/m 3 dengan purata ketumpatan sebanyak 370 kg/m 3. Ketumpatan batang kelapa sawit semakin kurang dengan peningkatan ketinggian batang dan ia juga semakin kurang di bahagian dalaman batang. Diantara faktor yang terlibat adalah jumlah berkas vaskular kearah tengah batang adalah kurang berbanding dengan bahagian luar batang. Variasi pada ketinggian batang adalah disebabkan berkas vaskular di bahagian atas batang adalah lebih muda berbanding dengan di bahagian bawah batang.

Dari segi dimensi fiber , panjang fiber batang kelapa sawit (1. 22 rom) adalah setanding dengan fiber kayu getah (1.40 rom). Bahagianpangkal batang kelapa sawit mempunyai fiber yang lebih panjang berbanding dengan dibahagian" pucuk. Keadaan ini mungkin disebabkan oleh tisu kerana tisu berfiber di bahagian bawah batap.g yang lebih matang (Killmann dan lim ,1985). Purata panjang fiber adalah dari 1.76 rom dikawasan periferi dan meningkat sebingga ke 2.37 nun di bahagian teras . Ini adalah berkaitan dengan corak tumbesaran di mana tumbesaran berkas vaskular di bahagian tengah juga mempengaruhi diameter batang kelapa sawit .

2.1.1.4.

eiri

kimia

Satu kajian mendalam tentang ciri batang kelapa sawit termasuk ketumpatan, morfologi fiber dan komposisi kimia telah dijalankan oleh Mohd. Noor et ai., (1984). Jadual 2.4 membandingkan antara komposisi kimia batang kelapa sawit , kayu getah dan batang kelapa (Escolano dan Bawagan, 1980) manakala Tomimura (1992) telah membandingan

13

(41)

komposisi kimia dalam berkas vaskular dengan parenkima batang kelapa sawit (Jadual 2.5)

2.1.1.S Kegunaan dan potensi

Dalam tinjauan oleh Abdul Razak et al. (1991) secara umum batang ke1apa sawit sedang giat d.i.k.aji untuk beberapa kegunaan utama seperti produk panel, kertas dan pulpa ,makanan ternakan , bahanapi pepejal serta cecair.

Jika diasingkan kegunaan mengikut komponen berbeza maka dapat

"dilihat bahawa untuk produk panel seperti papail partikel samada paPan partikel bersimen atau papan partikel bergipsum , papanblok , papan gentian ketumpatan s~derhana (medium density fiberboard) , kayu ply dan perabut, bahagian parenkima "ti(hk digunakan kerana" ia mengurangkan kekuatan produk panel tersebut. Se1ain dari itu , dalam.

penghasilan kertas dan pulpa yang lebih bersih , kuat serta tahan penguraian , bahagian parenkima juga didapati tidak sesuai dan biasanya dipisahkan sebelum bahagian berkas vaskular diproses dengan proses kimia sulfat (Khoo dan Lee ,1985) dan proses separakimia sulfat neutral (Mohd. Nor ,1985).

Walau bagaimanapun bahagian parenkima yang kaya dengan karbohidrat sedang dikaji untuk sumber makanan ternakan seperti lembu . Hasil kajian sehingga kini menunjukkan bahawa ia berpotensi tinggi . Walaupun kandungan protein kasarnya serta lemak kasarnya kurang , batang ke1apa sawit yang tidak diolah mempunyai kandungan fiber' yang tinggi , oleh itu ia sesuai sebagai sumber 'roughage' (Abdul Razak et al., 1991).

(42)

Jadual2.4 Komposisi kimia batang kelapa sawit, kayu getah

(Mohamad et. a1 1985) dan batang kelapa (Escolano dan Bawagan 1988)

Komposisi Batang kelapa Kayu Batang

kimia sawi t 1 getah 2 kelapa3

Alkohol -benzena 9.8 15 2.6

Larut air panas 14.2 4.8 2.8

Larut alkali (1 % NaOH ) 40.2 19.2 22.9

Holoselulosa 45.7 67.0 66.7

Alpha- selulosa 29.2 41.5 n.a

Klason lignin 18.8 26.0 25.1

Pentosans 18.8 19.4 22.9

Abu 2.3 1.5 2.8

n.a: Tiada

Jadual2.S: Analisis kimia - berkas vaskular dan parenkima (Tomimura , 1992)

Komposisi Berkas vaskular Parenkima

Abu 2.2 2.9

Kanji 2.4 555

Lignin (larut 15.7 ( 3.9) 20.0 ( 4.5) asid)

Kandungan gula:

Mannosa 2.0 1.3

Arabinosa ₊ 65

Galaktosa ₊ 1.9

XHosa 34.8 34.8

Glukosa 63.2 - 555

15

(43)

Kandungan lignin dan holoselulosa adalah rendah dalarn batang kelapa sawit tetapi kandugan ekstraktif , pelarutan alkali dan air adalah lebih tinggi dari kayu getah. Variasi dalarn kandungan kimia pada tahap 1.8 meter adalah tinggi walaupun pada batang yang sarna (Mohd. Nor

et

^al.,

1984). Tiada sebarang corak yang dapat diperhatikan pada pelarutan alkohol- benzena, pelarutan alkohol, kandungan holoselulosa, lignin dan pentosan. Kandungan alfa-selulosa diperhatikan meningkat daripada bahagian tengah ke periferi.

Secara keseluruhan bahagian tengah batang mempunyai kandungan larut air panas dan larut alkali yang lebih tinggi daripada zon luar.

Pelarutan alkali dan air biasanya menunjukkan .kuantiti karbohiderat yang hadir. Corak yang diperhatikan dalarn batang kelapa sawit ini dapat diterangkan oleh kuantiti kanji serta polisakarida berantai pendek yang lebih tinggi di dalarn bahagian tengah batang yang kaya dengan tisu parenkima.

Dalam satu lagi kajian oleh Halimahton dan Abdul Rashih (1990) kandungan lignin didapati harnpir sekata taburannya di sepalljang batang kecuali ia sangat tinggi di bahagian bawah batang dan paling rendah di bahagian atas iaitu pada bahagian terasnya. Ini adalah kerana berkas vaskular yang lebih tua menebal dan ini meningkatkan lagi kandungan lignin di bahagian bawah batang. Kawasan luar batang juga tinggi kandungan ligninnya kerana kawasan periferi mempunyai banyak berkas vaskular. Kandungan abu didapati hampir serupa diseluruh batang.

(44)

Rahim et al., (1987) mendapati bahawa batang kelapa sawit yang baru ditebang boleh mengeluarkan sehingga 10% gula bebas dan 25% kanji.

Halimahton dan Abdul Rashih (1990) melapurkan bahawa jumlah keseluruhan gula bebas di sepanjang batang adalah antara 2 hingga 10%. Berdasarkan ekstrak metanol-air, bahagian teras mempunyai kandungan gula bebas yang lebih tinggi berbanding dengan kawasan periferi. Analisa mengunakan Kromatografi Cecair Berkeupayaan Tinggi (HPLC) menunjukkan sukrosa, glukosa dan fruktosa sebagai gula bebas utama dalam batang kelapa sawit. Sukrosa iaitu komponen gula utama didapati hampir tetap disepanjang batang manakala kandungan glukosa menurun dan kandungan fruktosa meningkat disepanjang batang.

Kandungan gula yang lebih tinggi iaitu 48-70% dihasilkan oleh hidrolisis asid batang kelapa sawit (Halimahton dan Abdul Rashih, 1990) Penentuan melalui kaedah HPLC oleh hidrolisis asid.~enunjukkan enam komponen gula iaitu glukosa ,xilosa , galaktosa ,arabinosa , mannosa dan rhamnosa . Komponen utama ialah glukosa (35 - 48%) diikuti oleh xilosa (11-16%).

2.1.2 Struktur selulosa

Selulosa ialah suatu polimer linear glukosa (polialkohol) yang terdiri dari unit anhidroglukosa yang diikat oleh ikatan ,g-1,4 glukosidik (GoksoyrdanEriksen , 1980). Struktur ringkas selulosa adalah seperti dalam Rajah 2.2 oleh Reese et al., (1972).

17

(45)

H OH

Rajah 2.2

1

1-

OH

o

H OH

Struktur selulosa ( Reese et al.,1972)

I B CH20H

I .

IH~O

^OH

141

^H ^H ¹

~ H H

3 t

I H OH

J.

Selulosa daripada kayu mempunyai 10,000 unit residu gluk~a pada rantai polimer lurus (Sjostrom ,1993). Selulosa adalah komponen utama kayu. Ia membentuk hampir 40~4S% bahan kering dalam kebanyakkan tumbuhan berkayu terutamanya dalam dinding sekunder. Sehingga kini struktur kimia selulosa telah dikaji dengan terperinci namun keadaan struktur supermolekulnya termasuk bentuk hablur dan fibrilnya masih lagi diperdebatkan. Walaupun molekul selulosa pada keseluruhannya lurus, ia cenderung untuk membentuk ikatan hidrogen secara intramolekul dan intermolekul. Dengan ini berkas molekul selulosa akan terkumpul bersama dalam bentuk mikrofibril dimana terdapat bahagian berhablur yang susunannya teratur diselangseli dengan bahagian amorfus yang kurang teratur. Mikrofibril membentuk fibril dan seterusnya membentuk fiber selulosa.

Menurut Fan et al., (1980), hemiselulosa dan lignin terdapat dalam ruang antara mikrofibril dan molekul selulosa didalam bahagian amorfus.

(46)

2.1.3. Struktur hemiselulosa

Hemiselulosa dalam kayu adalah campuran polisakarida yang mengandungi residu gula pentosa dan heksosa terrnasuk D-glukosa , D-

,

mannosa, D-xilosa dan L-arabinosa bersama dengan beberapa asid uronik. Polimer hemiselulosa biasanya bercabang dan bergabung dengan rantai selulosa pada keseluruhan dinding sel dan ini memberikan keteguhan. Kebanyakan hemiselulosa mempunyai darjah pempolimeran tidak melebihi 200 dan di antara rantai polimemya terdapat ikatan H. ]umlah hemiselulosa dalam berat kering kayu ialah antara 20 -30% (Sjostrom ,1993). Komposisi hemiselulosa berbeza antara spesis tumbuhan (Aspinall, 1981). Oleh kerana hampir keseluruhan struktumya amorfus , ia senang ~resapi air dan didegradasikan. Darjah ,aturan supramolekulnya yang rendah dan rantai bercabang menyebabkan ia lebih senang ditindakbalas berbanding dengan selulosa (Kennedy et ai., 1990).

2.1.4. Struktur lignin

Lignin merupakan satu rangkaian polimer longgar yang mempunyai herat molekul tinggi iaitu diantara 103 hingga 106 dan didapati bukan berhablur (Goring ,1971). Berbeza dengan selulosa dan hemiselulosa , makromolekul lignin tidak dapat diterangkan dengan gabungan beberapa unit monomer serta ikatan ringkas. Oleh itu struktur lignin hingga kini masih lagi berdasarkan model-model. Data tentang struktur lignin sangat kurang berbanding dengari koposisi kimia lignin dimana lebih banyak telah diketahui tentang komposisi kimianya. Banyak kajian mendapati bahawa lignin adalah polimer aromatik yang terdiri

19

(47)

dari unit -unit propilfenol (Fengel dan Wegener ,1984) , di mana lebih dari dua pertiga daripada unit propilfenol ini disambung oleh ikatan eter , yang selebihnya disambung oleh ikatan karbon-karbon (Sjostrom ,1993) dan juga karbon - oksigen (Greithlein ,1984).

Lignin didapati bergabung dengan polisakarida pada dinding sel terutamanya dengan hemiselulosa (Kennedy et al., 1990). Gabungan dengan polisakarida ini membentuk satu kompleks lignin-hemiselulosa -selulosa (Lipinsky, 1979).

2.1.5. Kesan kehadiran lignin dan kesan struktur selulosa keatas hidrolisis em:imatik.

Gabungan lignin dengan sebahagian struktur selulosa yang berhablur dalam gentian lignoselulosik merupakan rintangan biologi ke atas bahan tersebut. Kehadiran lignin ini menyukarkan hidrolisis bahan selulosa kerana lignin melidungi bahan selulosa daripada terdedah kepada tindakan enzim selulase. Selulosa asli merupakan mikrofibril berhablur yang mengandungi bahan-bahan seperti hemiselulosa dan lignin. Disebabkan struktumya yang kompleks ini , maka keupayaan selulosa untuk ditindak enzim bergantung kepada keadaan struktumya.

Diantara struktur utama bahan selulosik yang menentukan tindakan enzim adalah :

i. Penghabluran (struktur hablumya).

Bahagian berhablurnya sukar diresapi enzim berbanding dengan bahagian amorfus. Dikawasan berhablur , ikatan hidrogen dan ikatan glukosidik perIu dimusnahkan dahulu sebelum proses hidrolisis berIaku.

(48)

ii. Kandungan bahan-bahan lain seperti lignin

Lignin melindungi bahan selulosa daripada tindakan enzim.

iii. Darjah pembengkakan oleh air.

Fiber selulosa pada bahagian amorfus lebih mudah menyerap air dan membengkak berbanding dengan kawasan berhablur yang mempunyai ikatan hidrogen yang kuat. Molekul enzim yang bergaris pusat 5 nm (Cowling dan Brown, 1969) tidak dapat masuk ke struktur dalam fibril dan hanya bertindak pada pennukaan selulosa. Darjah pembengkakan akan mempengaruhi jumlah ikatan glukosida yang boleh ditindak oleh enzim.

iv. Struktur kapilari gentian selulosa.

Keupayaan selulosa untuk dihidrolisis ditentukan dengan penembusan enzim selulolitik kedalam pennukaannya. Hubungan fizikal secara lang sung antara molekul enzim dan molekul substrat selulosa adalah prasyarat penting untuk hidrolisis. Oleh itu struktur kapilari gentian selulosa adalah struktur yang dianggap sangat penting yang mempengaruhi hidrolisis( Stone, 1969).

v. Susunan molekulnya.

King (1969) mencadangkan bahawa bahagian berhablur selulosa lebih rintang pada tindakan enzim daripada bahagian amorfus bukan sahaja kerana ia terhalang dari tindakan enzim secara fizikal tetapi ia juga berkait dengan konformasi dan ketegangan sterik. pada unit anhidroglukosa yang terdapat dalam bahagian berhablur.

21

(49)

2.2. Mikroorganisma Pengurai lignoselulosa

Enzim selulolitik dibentuk oleh banyak jenis mikroorganisma diantaranya kulat , aktinomisit, miksobakteria dan bakteria (GOkS0yr

& Eriksen, 1980).

2.2.1. Kulat

Kulat pada amnya adalah SO -1000 kali lebih hidrolitik berbanding dengan bakteria selulolitik yang paling aktif (Saddler et al.,. 1987). Di dalam keadaan sesuai , kulat berkembang dalarn sarnpel kayu melalui

. ^.

tumbesaran hifanya . Keupayaan kulat untuk merigurai bukari hanya disebabkan hifa yang mudah menembusi dinding sel malah melibatkan enzim yang boleh mengurai selulosa , lignin serta lain-lain kandungan kompleks. Enzim akan mere sap melalui dinding sel kulat ke substrat dan berfungsi mengubah polisakarida dan lignin.

Berdasarkan jenis penguraian yang berlaku kulat yang menguraikan selulosa dikelaskan kepada beberapa kumpulan. Tiga daripada kumpulan utama ialah kulat 'brown rot' ,'white rot' dan 'soft rot'. Kulat 'brown rot' dan 'white rot' terdiri dari Subdivisi Basidiomycetes. ' 'Brown rot' mengurai terutarnanya bahan polisakarida kayu dengan perubahan kepada lignin dan menyebabkan kayu menjadi perang dan reput manakala 'white rot' pula mengurai lignin dan polisakarida kayu menjadi putih dan lembut setelah ia mengalami pembengkakan. Mikromorfologi penguraian oleh kedua-dua kulat ini adalah berbeza •

Kulat 'soft rot' tediri dari Ascomycetes dan kulat 'Imperfecti' yang berupaya mengurai polisakarida dan lignin. Ia juga mengurangkan ciri

(50)

oleh kulat 'soft rot' berbeza dari white rot' dan 'brown rot' kerana ia terhad pada kawasan permukaan luar kayu. 'Soft rot' banyak menyerang kayu yang lernbab; Penguraian bermula dari luar dan bergerak kedalam bila permukaan luar dimusnahkan.

2.2.2. Bakteria

Bakteria kurang mengurai kayu kerana ia rnernbiak dengan cara pembahagian sel dan hanya mernbentuk koloni dalam sel parenkima dan dalam ruang pit dimana ia melarutkan rnernbran pit. Bakteria mung kin rnenyerang dinding sel secara perlahan dengan mengurai polisakarida dan lignin.

2.3. Enzim selulase

Selulase bukanlah enzirn tunggal rnalahan ia sis tern unik dirnana beberapa enzirn bertindak bersama-sarna dalam· hidrolisis.

Kebanyakkan kulat selulolitik mernpunyai sistern selulase yang hampir serupa yang terdiri dari satu hingga beberapa enzim berikut :

i. Endoglukanase ( 1 ,4-.K-D-glukan-glukanohidrolase EC. 3.2.1.4) Ii. selobiohidrolase ( 1 , 4-.K-D-glukanselobiohidrolase EC . 3.2.1.91) iii &-glukosidase ( &-D-glukosid glukohidrolase)

23

(51)

Ketiga-tiga komponen enzim ini bertindak secara sinergistik dan ini penting kerana ikatan glukosidik pada molekul selulosa dihubungkan antara satu sama lainoleh ikatan hidrogen maka ia sukar diserang oleh molekul enzim. Kombinasi ketiga-tiga jenis enzim ini menghasilkan proses sakarifikasi selulase yang sempurna. Banyak kekeliruan timbul dalam kajian selulase kerana komponen enzim ini juga dikenali dengan beberapa nama berbeza ( jadual 2.6 )

Jadual 2.6 . Senarai nama yang biasa digunakan untuk tiga komponen selulase (Gilbert dan Tsao, 1983)

Kategori umum

.8, - glukosidase ( EC 3 .2 .1 .21) .8,- glukan selobiohidrolase

•.. &- glukan glukanohidrolase

Nama-nama lain selobiase

Cx

Eksogl ukanase Eksoselulase Aviselase

Selo biohidrolase

Endoglukanase Endo-.8,-glukanase CMCase

(52)

2.3.1. Endoglukanase ( Cx) at au 1 .4-~-D-glukan-glukanohidrolase

(EC.3.2.1.4)

Enzim hidrolitik ini seeara semulajadi adalah enzim multikomponen , Oleh itu ia dinamakan Cx oleh Reese ( Bisaria dan Ghose,1981).

Komponen ini bertindak seeara rawak dengan menghidrolisiskan ikatan ~(1-4) ke atas rantaian selulosa dan dengan ini menghasilkan glukosa , selobiosa dan selotriosa (Wood dan Bhat , 1988 ; Bisaria dan Ghose ,1981). Ia berupaya mensakarifikasikan terbitan selulosa terlarot seperti karboksimetil selulosa ( CMC) , selulosa amorfus dan selulosa yang telah didegradasikan . Serangan enzim .Cx ini akanmenghasilkan :

(i) pembentukan hujung bukan -penurun yang boleh diserang oleh komponen enzim ekso-K- glukanase (Bisaria dan Ghose ,1981) dan

(ii) pengurangan dalam darjah pempolimeran rantaian selulosa (Walseth ,1952).

Ringkasan eiri enzim ini dapat dilihat dari Jadual 2.7.

2.3.2. eksoglukanase (C1) atau 1, 4-K-D-glukanselobiohidrolase . (EC 3.2.1.91)

Eksoglukanase pernah disalahanggap sebagai enzim yang . menghidrolisiskan selulosa berhablur serta menghasilkan selulosa amorfus sebagai substrat kepada enzim Cx atau endoglukanase . Oleh sebab ini ia dinamakan C1 ataupun 'selulase pertama' . Kini Reese (1975) lebih yakin bahawa langkah pertama dalam hidrolisis ialah tindakbalas

2S

(53)

oleh endoglukanase yang menghasilkan hujung bebas pada rantai selulosa sebagai substrat untuk enzim-enzim lain.

Ciri enzim ini diringkaskan dalam Jadual 2.8.

2.3.3. Enzim g-glukosidase ataupun selobiase.

Ciri enzim ini diringkaskan dalam Jadual 2.9. Komponen enzim ini adaah enzim yang sangat penting dalam proses sakarifikasi kerana tanpa R-glukosidase , selobiosa yang terhasil dalam hidrolisis akan meningkat dan merencatkan eksoglukanase dan endoglukanase dan seterusnya melambatkan atau menamatkan proses sakarifikasi. Hanya g-glukosidase boleh menhidrolisiskan selobiosa maka enzim ini bukan sahaja" penting malah ia memainkan peranan utama dalam degradasi selulosa. Trichodenna reesei walaupun beFjaya menghasilkan selulase , namun komponen g-glukosidase yang dihasilkan adalah sangat sedikit.

berbanding dengan Trichoderma , Aspergillus spp adalah lebih berkesan sebagai sumber .K-glukosidase. Oleh itu .K-glukosidase daripada Aspergillus contohnya A.phoenicis sesuai ditambah dengan selulase T.reesei dan boleh memulakan sakarifIkasi selulosa ( Sternberg et al., 1977). Antara g-glukosidase yang telah dikomersilkan ialah Novozym 188 (Novo Industries A/S Denmark) dari A.niger dan Sturge Enzymes CP Cellulase dari Penicillium funiculosum ( Parr, 1983).

Dekker & Wallis (1983) telah mendapati sakarifikasi tebu sangat berkesan bila selulase T.reesei ditambah dengan Novozym 188.

Seterusnya Dekker (1986) telah mengkaji ciri kinetik ,perencatan dan kestabilan Novozym 188 dengan mengunakan substrat PNPG dan selobiosa (lihat jadual 2.10).

(54)

Jadual 2.7 Aktiviti ,tindakbalas ,hasH akhir dan ciri endo-~1-4-

glukanase (3.2.1.4) (Mandels,1982)

Substrat :

Tindakbalas :

HasH:

Ciri :

Aktiviti :

27

CMC dan lain-lain derivatif selulosa

Selulosa "walseth"- selulosa amorfus

Selodekstrin (aktiviti meningkat dengan penambahan rantai

- tiada aktiviti atas selobiosa -tiada aktiviti atas selulosa berhablur oleh enzim tulin

Hidrolisis rawak rantai ~-1,4-

glukosidik ( menyerupai a

amilase) .

Glukosa, selobiosa , selodekstrin (sementara)

Enzim larot ,substrat semulajadi bukan larot.

Berat molekul 11,000 -65,000 glikoprotein

pH optimum 4.8 ,suhu 50⁰C ( Trichoderma)

Boleh direncat oleh metilse1ulosa , selobiosa.

Termostabil

Unit Internasional ⁼ f.lmo1 gula penurun sebagai glukosa/minit.

Boleh diukur atas CMC dalam enzim kasar.

(55)

]adual 2.8 Aktiviti ,tindakbalas ,hasil akhir dan ciri ekso-'&l,4- glukanase-selobiohidrolase ( 3. 2.1.91) (Mandels,1982)

Substrat:

Tindakbalas :

Hasil :

eiri :

Aktiviti :

Selulosa"Walseth "

Avicel ( selulosa mikrohablur) selodekstrin (aktiviti mengikut dengan peningkatan rantai) Tiada tindakbalas atas kapas oleh

enzim tulin.

Kurang tindakbalas atas CMC .Tiada tindakbalas pada selobiosa

Hidrolisis ikatan ,&-1

A

-gl ukosidik .. -dengan meleraikan dimer

selobiosa dari hU:jung bukan penurun.

Selobiosa, anomer a

Enzim larot , substrat tak larnt ,diikat oleh selulosa.

Berat molekul 50 ,000-65,000 glikoprotein

pH optimum 4.8 , suhu optimum 500C ( Trichoderma) Direncat oleh metilselulosa

,selobiosa.

Kurang stabil berbanding endo

-~-glukanase.

Tidak dapat diukur dalam enzim kasar ,oleh kerana sinergisma.

(56)

]adual2.9 Selobiase = R -glukosidase (3.2.1.21) (Mandels,1982)

Substrat:

Tindakbalas :

Hasil :

Ciri :

29

Selobiosa Selodeks trin

Aryl R -glukosid ( salisin ,p- nitrophenil R -glukosid ) Tiada tindakbalas atas selulosa.

Hidrolisis pada ikatan R-glukosidik ( 1 ,2-1 ,3-1 ,4-1,6 ) pada dirner.

Konfigurasi R- glukosa dikekalkan Pemindahan unit glukosa kepada

gula lain danalkohol

Glukosa

Enzirn glikoprotein larot ,boleh diimobilkan.

Direncat oleh glukosa ,glukonolactone , nojirimisin Enzirn intrasel Trichoderma reesei

.Berat molekul 98,000 (MW) . pH optimum 6.5

kestabilan suhu 400C .1 jam -95 % aktiviti hilang.

f{)oC ,100% aktiviti hilang.

KIn selobiosa 0.9-3.3 mM Enzim ekstrasel T.viride Berat molekul (MW)47 ,000-76,000.

pH optimum 4.0-5.0 Kestabilan suhu 40-60⁰'1 jam

aktiviti kekal.

Km selobiosa 1..5-2.6 mM

(57)

Diantara ciri enzimnya ialah : pH optimum pada 4.5 . suhu 60-700 ( . Ia stabil pada pH 4 - 4.5 dan tahan pada 60^{0 (} apabila disimpan selama 0.5 jam pacta pH 5. Setelah dipanaskan pada 800( . lebih dari 98% aktivitinya hilang. Walaubagaimanapun ia stabil bila disimpan pada SOO( dan pH 5 untuk jangkamasa yang agak lama dimana 83 % dari aktiviti kekal selepas 48 jam dan 22% aktiviti kekal selepas 120 jam. Tetapan Michaelis ( Km) g-glukosidase untuk PNPG ( 1.02 mM) adalah rendah berbanding dengan selobiosa ( 5.63 mM) menunjukkan bahawa ia mempunyai afiniti yang tinggi terhadap g-glukosidase yang sintetik berbanding dengan substrat selulosa. Keputusan dari penentuan kelajuan maksimum ( V m) terhadap kedua-dua substrat menunjukkan bahawa g- glukosidase mendegradasikan selobiosa sembilan kali lebih laju dari PNPG (]adual 2.10).

&-glukosidase direncatkan oleh hasil akhir glukosa (Gong

ec

ai., 1977).

Glukosa didapati merencatkan &-glukosidase secara bersaing dengan substrat PNPG seperti yang dilihat pada Lineweaver Burk plot . Untuk memastikan samada perencatan glukosa keatas &-glukosidase adalah separa atau sepenuh, maka kecerunan daripada Lineweaver Burk plot ini diplot melawan kepekatan glukosa ( Rajah 2.3 ) . Hasilnya ialah garis

yang tidak putus ( lengkung hiperbola ) yang menunjukkan bahawa glukosa adalah perencat separa bersaing. D .. xilosa juga merupakan perencat kepada g-glukosidase A.niger. Pada tahap kepekatan xHosa (5%) perencatan enzim ini adalah 13%.

(58)

Jadual 2.10 Ciri fizik- kimia R - D - glukosidase dari Aspergillus niger.

pH optimum a,b

Julat kestabilan pH a ,b Suhu optimum a ,c

Ciri

Julat kestabilan suhu a, d Kestabilan separa hayat pada

saoca

Tenaga pengaktifan a Km ( PNPG )

- Vm( PNPG

r

Km ( selobiosa ) Vm( selobiosa ) K i ( glukosa ) e Jenis perencatan

Kaitan antara aktiviti enzim dan i) mas a hidrolisis

ii) kepekatan enzim Titik isoelektrik Jumlah isoenzim

4.5 4.0- 4.5 60-70 0-60 o C

>48jam

52.5 kJ/mollK 1.03mM

3.76 Ilrhollmiil/mg 5.63mM

33.74Ilmollmin/mg . 3.0mM

Separa bersaing

Linear sehingga 30 min.

Linear -5.0 1

a Menggunakan PNPG dan selobiosa sebagai substrat b Pacta SO 0 C selama 10 minit

c Pacta pH 5.0

d Pacta pH 5.0 selama 0.5 jam

e menggunakan PNPG sebagai substrat.

31

(59)

..., , ³⁰

~

S ^1/\"

"-

"s

c

"-

"0 20 - E:

;::!

~

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0 0.5 1.5 lIPNPG ( mM

r

¹

Cerun

o

² ⁴

Glukosa (mt-I)

Perencatan ~- glukosidase Aspergillus niger oleh glukosa Uneweaver - Burk pada kepekatan glukosa berbeza dan Plot semula cerun dari plot Iineweaver -Burk melawan kepekatan

Glukosa Smi'l

() mi'l

4 mt-I 2 mt-I 1 mi'l

o

mi'l

2

6

BATANG KELAPA SAWIT SEBAGAI SUBSTRAT BAGI PENGHASILAN ENZIM-ENZIM LIGNOS ELULOSIK OLEI-I Aspergillus terreus MELALUI 1'EKNIK KULTUR SUBSTRAT PEPEJAL