4.1 Kesan Substrat .
Substrat batang kelapa sawit dalam kajian ini dibahagikan kepada beberapa komponen berbeza (Bahagian 3.1.2) untuk mengkaji kesan substrat dalam penghasilan enzim selulase dan ~-glukosidase .
Dalam penyediaan substrat untuk pengkulturan substrat pepejal beberapa langkah diambil antaranya ialah, melakukan praolahan dengan pensterilan pada suhu 1210C selama 20 minit. Praolahan substrat pe~ejal
ini dilakukan untuk mengubah struktur kimia substrat supaya ia lebih tercapai (accesible) dan supaya struktur. fizikal substrat lebih terbuka untuk penembusan miselium di dalam kultur substrat pepejal (Glenn dan Rogers,1986).
Disamping praolahan, medium cecair yang sesuai juga penting dalam kultur substrat pepejal kerana medium ini akan membekalkan sumber nitrogen. Untukkajian ini medium Toyama (Toyama ,1976) dipilih kerana ia mudah disediakan dan memerlukan kurang bahan kimia berbanding dengan medium dan Reese (1957) yang biasanya digunakan dalam penghasilan enzim selulase. Berdasarkan beberapa kajian ke atas jerami gandum pengunaan medium Toyama juga didapati menghasilkan aktiviti selulase yang lebih tinggi mung kin kerana kandungan nitrogennya lebih tinggi (Macris dan Kekos, 1989; Shamala dan Sreekantiah,1986). Satu lagi langkah penting dalam kajian ini ialah pengunaan 0.1% Tween 80 iaitu sejenis surfaktan dalam penekstrakan enzim.
lni adalah kerana Tween 80 telah dikenalpasti dapat meningkatkan penghasilan enzim selulase dari kultur kulat(Reese dan McGuire.1969) secara interaksi dengan membran sel lalu mengubah keterlapan membran dan meningkatkan pembebasan eksoenzim (Reese er al .. 1972).
Substrat mempunyai kaitan rapat dengan pehghasilan enzim dari segi struktur fizikalnya, porositi, kehabluran atau keamorfusan. saiz partikel dan juga konsistensinya dalam proses pengkulturan substrat pepejal.
Disamping itu faktor parameter pengkulturan seperti mas a, pH awal, jumlah inokulum spora dan suhu juga mempengaruhi penghasilan enzim.
Pada asasnya, sam ada sesuatu substrat mampu menghasilkan enzim tertentu adalah berkait rapatdengan komposiSi kimia substrat tersebut.
4.1.1 Komposisi kimia batang kelapasawit
Komposisi kimia dalam komponen batang kelapa sawit berbeza ini dapat dilihat dari Jadual 4.1.
Menurut kajian Jarvis etal., (1988) dan Wilson etal., (1989) biasanya tisu parenkima dari kebanyakkan tumbuhan monokot mudah dipisahkan dari tisu vaskular melalui homogenisasi basah (wet homogenisation). Dalam kajian ini, didapati bahawa sampel berkas vaskular bersalut dengan sel parenkima yang melekat kuat dan ia merupakan masalah utama yang dihadapi dalam pengasingan kedua-dua komponen tisu batang kelapa sawit.
Homogenisasi samada dalam keadaan basah atau kering kurang berkesan untuk memisahkan berkas vaskular dari parenkima. Sebagai langkah terakhir, pemisahan dilakukan secara manual dengan pengikisan menggunakan pisau. Berdasarkan penelitian dengan mikroskop, tisu vaskular yang hampir 90% tulen dihasilkan dengan cara ini. Secara umum,
99
menurut Tomimura (1992), kandungan berkas vaskular dan parenkima adalah an tara 71 hingga 76 % dan 24 hingga 29 % masing-masing dari keseluruhan batang kelapa sawit.
jadual 4.1 Komposisi kimia batang kelapa sawit(berdasarkan asas kering)
Parenkima Berkas Vaskular BKS
( P) (V) ( WI)
Kelembapan (%) 7.9 7 6.9
Abu (%) 2.1 1.9 2.5
a selulosa (%) 19.3 31.5 25.9
Holoselulosa (%) 47.3 56.5 59.3
Hemiselulosa 28.0 25.0 33.4
(dari perbezaan)
Lignin (%) 25.6 18.2 23.4
Kanji (%) 6.9 5.2 5.5
4.1.1.1 Kandungan Lembapan
Kelembapan di dalam batang ke1apa sawit yang telah dikeringkan didapati berubah diantara 6.9-7.9% dengan kelembapan tertinggi dalam sampel parenkima. lni menunjukkan bahawa sampel parenkima lebih banyak menyerap lembapan dart udara berbanding berkas vaskular(V) dan sampel seluruh(Wl). Keupayaan menyerap lembapan yang lebih ini mung kin ada kaitan dengan darjah porositi substrat parenkima berbanding dengan berkas vaskular. Kandungan lembapan yang lebih tinggi ini lebih memudahkan substrat parenkima didegradasi oleh mikroorganisma berbanding dengan substrat berkas vaskular.
Kelembapan batang kelapa sawit seluruh (WI) adalah 6.9%. lni disokong oleh kajian Ramlah dan Halim (1991) yang mendapati kelembapan sampel antara 6.3 hingga 8%. Sampel tersebut diambil dari 2 dan 4 meter dari paras tanah. Ketika segar kedua-dua sampel mempunyai kelembapan 59.7% dan 65.5%.
4.1.1.2 Kandungan Abu
Analisa kandungan abu menunjukkan kandungan kehadiran beberapa . bahan galian termasuk silika dalam batang kelapa sawit. Dari ]adual 4.1
didapati bahawa kandungan abu paling rendah iaitu 1.9% dalam berkas vaskular dan paling tinggi iaitu 2.5% dalam sampel seluruh (WI).
Kandungan abu juga didapati lebih tinggi dalam ·sampel parenkima iaitu 2.1 % berbanding dengan berkas vaskular. Kajian Tomimura (1992) juga mendapati kandungan abu dalam parenkima iaitu 2.9% adalah lebih tinggi berbanding dengan dalam berkas vaskular iaitu 2.2%. Menurut analisis Tomimura (1992) hampir keseluruhan kandungan abu disumbangkan oleh silika. Menurut Killman dan Hong (1989), kebanyakkan silika dalam batang kelapa sawit terdapat dalam salur sklerenkima di sekeliling berkas vaskular dan berkas fiber. Oleh itu besar kemungkinan kandungan abu yang tinggi dalam parenkima ini adalah disebabkan oleh kontaminasi dengan berkas vaskular yang sukar untuk dielakkan .
Dalam kebanyakkan kayu, kandungan silika biasanya kurang dari 1%.
101
4.1.1.3 Kandungan Kanji
Kandungan kanji didapati tertinggi dalam sampel parenkima(P) sebanyak 6.9% diikuti oleh sampel seluruh (WI) sebanyak 5.5% dan paling rendah di dalam sampel berkas vaskular (V) iaitu sebanyak 5.2%. Secara keseluruhan,_
keputusan yang didapati adalah rendah berbanding dengan Tomimura (1992). Walau bagaimanapun Rahim et al., (1987) mendapati kandungan kanji juga agak rendah iaitu sebanyak 0.4% hingga 25.5%. Keputusan berbeza ini menunjukkan variasi dalam sampel batang kelapa sawit.
4.1.1.4 Kandungan Holoselulosa, Selulosa dan Lignin
Dari keputusan dalam jadual 4.1, didapati bahawa kandungan holoselulosa paling tinggi dalam sampel batang kelapa sawit seluruh (WI) iaitu 59.3%
manakala dalam sampel parenkima (P) ia didapati hanya 47.3%.
Kandungan selulosa dalam sampel berkas vaskular(V) adalah paling tinggi sebanyak 31.5% manakala dalam sampel parenkima(P) ia paling rendah iaitu sebanyak 19.3%. Dengan mengira perbezaan, kandungan hemiselulosa dalam parenkima adalah 28.0%. Kandungan selulosa dan hemiselulosa yang didapati ini tidak banyak berbeza dengan hasH kajian Abdul Razak et al.,(1991) yang mendapati selulosa sebanyak 34% dan hemiselulosa sebanyak 35.8% dalam sampel parenkima. Variasi kelompok mungkin menyebabkan sedikit perbezaan antara hasH kajian makmal berbeza.
Dari segi kandungan lignin dalam batang kelapa sawit. perbezaan keputusan antara makmal adalah lebih ketara. Hasil kajian ini mendapati lignin lebih tinggi dalam sampel parenkima(P) iaitu 25.6% berbanding berkas vaskular(V) iaitu 18.2%. Abdul Razak et al.,( 1992). mendapati kandungan lignin dalam parenkima adalah 12.6% yang menghampiri jerami padi (13%) manakala Tomimura (1992) mendapati sam pel parenkima mengandungi lignin yang tinggi iaitu 20% berbanding dengan berkas vaskular, 15.7%. Kandungan lignin yang tinggi dalam parenkima ini juga disokong oleh kajian Gallacher et al.,(1993) yang mendapati kandungan lignin dalam parenkima sebanyak 24.4% manakala dalam berkas vaskular adalah sebanyak 12.5%.
Kebiasaannya tisu tumbuhan yang dikaitkan dengan lignifikasi adalah dinding sel mati di dalam xilem primer dan xilem sekunder yang terdapat pada berkas vaskular. Sel parenkima biasanya hidup dan tidak berlignin.
Lignifikasi dalam sel parenkima ini adalah suatu perkara luar biasa kerana sel parenkima juga mengandungi kanji dan mungkin gula bebas.
(Gallacher et al.,1993).
Daripada hasH kajian yang diperolehi dapat disimpulkan bahawa kesemua komponen batang kelapa sawit mempunyai selulosa, herniselulosa , lignin dan kanji dalam kandungan berbeza. Oleh itu kesemua komponen batang kelapa sawit ini sesuai untuk digunakan sebagai substrat penghasilan enzim seperti selulase, herniselulase, ligninase dan arnilase.
103
4.1.2 Aktiviti enzim g-glukosidase dari komponen batang kelapa sawit berbeza setelah dikulturdengan Aspergillus Jerreus.
Daripada Rajah 4.1 didapati bahawa substrat sang at penting dalam mempengaruhi aktiviti enzim g-glukosidase. Secara keseluruhan substrat seluruh (WI) setelah dikultur selama 5 hari, menunjukkan aktiviti g-glukoSidase tertinggi sebanyak 4.2U/g substrat berbanding dengan berkas vaskular (V) dan parenkima(P) .
Perbezaan dari segi penghasilan enzim diantara substrat di atas mungkin berkait dengan komposisisubstrat-substrat tersebut. Jika diperhatikan corak penghasilan enzim g-glukosidase, enzim ini didapati memerlukan kehadiran kedua-dua parenkima dan berk,as vaskular untuk menghasilkan g-glukosidase yang tinggi aktivitinya. Keputusan ini mencadangkan kepentingan parenkima kerana menurut Chen dan Wayman (1992) kanji terlarut adalah pengaruh kepada penghasilan selulase. Parenkima adalah substrat yang lebih kandungan kanji manakala berkas vaskular mempunyai kandungan selulosa yang tinggi (Bahagian 4.1.1.3 dan 4.1.1.4).
Di dalam substrat seluruh Wi, berkas vaskular mungkin membekalkan selulosa untuk ditindak oleh selulase yang telah diaruh oleh kanji terlarut dari parenkima. Kekurangan parenkima juga mungkin berkait dengan aktiviti enzim ~-glukosidase yang rendah dari substrat berkas vaskular(V).
Penghasilan enzim selulase dan g-glukosidase adalah berkait rapat dengan substrat. Menurut Binder dan Ghose (1978) hubungan fizikal antara kulat dan selulosa boleh menyebabkan pengaruhan oleh kerana terdapat tapak pengenalan dalam selulosa. Penerangan alternatif ialah kulat
menghasilkan selulase tahap asas secara konstitutif yang membebaskan selobiosa dan menyebabkan pengaruhan (Mandels dan Reese, 1960).
Subsrat seluruh yang segar ataupun 'green'(W3) walaupun mempunyai kedua-dua komponen parenkima dan berkas vaskular,. menunjukkan aktiviti terendah . Kemungkinan substrat W3 menunjukkan kesan perencatan tumbesaran kulat dan perencatan penghasilan enzim.
Menurut Hong dan Abdul Razak( 1983) batang kelapa sawit yang segar ataupun 'green' didapati lebih rintang terhadap degradasi oleh mikroorganisma serta menunjukkan kehadiran bahan ekstraktif yang tinggi. Kemungkinan perencatan penghasilan enzim dalam kajian ini juga berkait dengan kehadiran bahan ekstraktif seperti resin dan sebatian fenol . Menurut Sjostrom (1993) sebatian fenol yang terdapat dalam xiI em tumbuhan mempunyai ciri fungisid dan boleh melindungi tumbuhan dari serangan mikroorganisma.
Disamping komposisi substrat, kandungan cecair di dalam substrat juga didapati boleh mempengaruhi penghasilan enzim R-glukosidase.
Berdasarkan pemerhatian ke atas kultur batang kelapa sawit dalam kajian ini kandungan cecair didapati mempengaruhi konsistensi substrat . Aktiviti enzim R-glukosidase yang paling tinggi dalam kesemua substrat diatas didapati dari kultur yang agak 'kering' iaitu nisbah bks/medium 1:1
\
(w/v, as as kering ). Bila kultur kekurangan medium cecair, substrat batang kelapa sawit didapati mempunyai konsistensi yang longgar. Seterusnya konsistensi substrat yang longgar akan mempengaruhi perpindahan massa interpartikel iaitu pemindahan oksigen dari ruang(void) dal'am fasa pepejal kepada mikroorganisma. Dengan konsistensi subsrat yang 'longgar' , oksigen mudah dipindahkan ke substrat dan. ini mungkin
105
mempengaruhi jenis tumbesaran serta penghasilan enzim .Dari keputusan yang diperolehi (Rajah 4.1), didapati aktiviti K-glukosidase menurun melebihi 50% bila nisbah bks/medium ditingkatkan ke 1: 2. Aktiviti enzim K-glukosidase yang dihasilkan oleh substrat berkas vaskular dan parenkima juga menunjukkan pengurangan aktiviti' melebihi 500/0 di dalam kultur nisbah 1: 2. Dalam kultur nisbah 1: 2, medium ditambah sekali ganda dan medium menjadi agak lembab berbanding dengan nisbah 1: 1.
Dengan peningkatan kandungan cecair , konsistensi substrat berubah menjadi lebih padat dengan ruangan antara partikel diisi oleh cecair.
Besar kemungkinan kandungan substrat dengan kekurangan medium cecair atau air mempengaruhi penghasilan dan aktiviti enzim.
Keputusan yang hampir sarna didapati setelah substrat-substrat parenkima (P), berkas vaskular(V) dan seluruh (WI dan W3) dikultur selama 10,15 dan 20 hari. Dari Rajah 4.2, 4.3 dan 4.4 secara keseluruhan, corak aktiviti enzim yang dihasilkan adalah hampir sarna dengan kultur 5 hari (Rajah 4.1).
Substrat yang menunjukkan aktiviti enzim K-glukosidase paling tinggi adalah substrat seluruh WI (di dalam nisbah bks/medium 1:1) berbanding dengan substrat-substrat lain.
Nisbah bks/medium masih menunjukkan kesan jelas keatas aktiviti enzim.
lni dapat diperhatikan dari pengurangan aktiviti enzim K-glukosidase dari nisbah 1:1 ke nisbah 1:2 dalarn sampel WI samada pada 10, 15 ataupun 20 hari. Seterusnya dalam nisbah 1: 4,1: 6 dan 1: 8 , penambahan cecair mengurangkan pemindahan oksigen kepada mikroorganisma dan ini diikuti oleh aktiviti enzim yang semakin kurang berbanding dengan kultur nisbah 1: 1.
Beberapa kajian pengkulturan substrat pepejal keatas jerarni padi juga mendapati corak yang harnpir sarna iaitu aktiviti selulase dan ~
glukosidase dari Neurospora crassa STA rnenunjukkan aktiviti lebih tinggi dari kultur yang 'kering' iaitu pada nisbah 1: 1 dan 1: 2 (Macris er aI..
1989; Shamala dan Sreekantiah, 1986).
Keputusan ini juga menunjukkan aktiviti enzim ~-glukosidase dalam substrat BKS berbeza juga dipengaruhi oleh faktor mas a contohnya aktiviti R-glukosidase dari substrat WI pada nisbah BKS/medium 1:1, setelah dikultur selama 20 hari adalah lebih rendah berbanding dari kultur 5, 10 dan IS hari. lni menunjukkan faktor masa mempunyai pengaruh keatas tumbesaran organisma serta penghasilan enzim. Pengeraman yang lama juga boleh menyebabkan kultur menjadi lebih kering serta rnengurangkan nutrien dan pengagihan haba. Pengumpulan gula penurun seterusnya boleh merencatkan penghasilan enzim.
Secara keseluruhan, daripada keputusan yang diperolehi dapat disimpulkan aktiviti enzim ~-glukosidase adalah bergantung kepada
substrat iaitu pada komposisi substrat , samada batang kelapa saWit tersebut rnempunyai parenkima, berkas vaskular atau kedua-dua sekali . Satu lagi.
faktor penting yang mempengaruhi aktiviti enzim R-glukosidase ialah konsistensi substrat samada longgar atau padat yang bergantung pada nisbah bks/medium .
107
I-' ~
4.5 4
~ 3.5
~
- I I :
~ 'e
3...,..: 2.5
=.' e-'l!
' ... a'I c::-
N'
2~ c
;: :; 1.5
,
...
>-
c' ... ~ 1
...
oW'''' ., II:
1: 1
• W3
• p
• v
~Wl
: .. :
1: 2 1: 4 1: 6 1:
a
Nisbah ' berat bks / isipadu medium
Rajah 4. 1: Aktiviti enzim B- glukosidase di dalam sampel batang kelapa sawit berbeza setelah dikultur selama 5
~
8
3.5 3
~ ... 2.5
-'
o E ...= ..
E 2=i,.C
E':
1.5'
...
N_=
0 1~
=
,
.. :
....
' .. 0 )0 ~ 05 .
'
...
....
'..
.w= ~ 0 1: 1
• W3
• p
• V
--ls--Wl
1: 2 1: 4 1: 6 1: 8 Nisbah berat bks / isipadu medium
Rajah 4. 2: Aktiviti enzim B- glukosidase di dalam sam pel batang kelapa sawit berbeza setelah dikultur selama 10 hari.
I-'
Rajah 4.3: Aktiviti enzim B- glukosidase di dalam sampel batang kelapa sawit berbeza setelah dikultur selama ) 5
...
...
...
2.5
2
•
W3=- _
I 1.5•
p-o .... I:
e e
=I.";;
1...,.w