Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah buah makasar, akuades, alkohol 95%, heksana, metanol, kloroform,
enzim α-glukosidase, p-nitrofenil-α-D- glukopiranosida (p-NPG), larutan buffer fosfat (pH 7), serum bovine albumin,
acarbose (glucobay), dimetilsulfoksida
(DMSO), HCl 2N, dan Na2CO3. Bahan- bahan yang dipakai untuk uji fitokimia adalah H2SO4 2M, pereaksi (Dragendorf, Mayer & Wagner), etanol 30%, asam asetat anhidrat, H2SO4pekat, dan metanol 30%.
Uji Fitokimia
Fitokimia atau kimia tumbuhan telah berkembang menjadi disiplin ilmu tersendiri, berada diantara kimia organik bahan alam dan biokimia tumbuhan, serta berkaitan erat dengan keduanya. Bidang perhatian dari fitokimia adalah keanekaragaman senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh tumbuhan, yaitu mengenai struktur kimia, biosintesis, perubahan serta metabolismenya, penyebaran secara ilmiah, dan fungsi biologisnya (Harborne 1987).
Analisis fitokimia atau uji fitokimia merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik seperti alkaloid, senyawa fenol (termasuk flavonoid), steroid, saponin, dan triterpenoid. Uji tersebut sangat bermanfaat untuk memberikan informasi jenis senyawa kimia yang terkandung dalam tumbuhan, terutama tumbuhan obat yang digunakan. Senyawa-senyawa ini merupakan metabolit sekunder yang mungkin dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat. Senyawa metabolit sekunder sangat bervariasi jumlah dan jenisnya dari setiap tumbuh-tumbuhan, beberapa dari senyawa tersebut telah diisolasi dan sebagain diantaranya memberian efek fisiologis dan farmakologis yang lebih dikenal sebagai senyawa kimia aktif (Copriyadi 2005)
Analisis ini merupakan tahapan awal dalam isolasi senyawa bahan alam sehinga menjadi panduan bersama-sama dengan uji aktivitas biologis senyawa tersebut. Salah satu tujuan pengelompokan senyawa- senyawa aktif tersebut adalah untuk mengetahui hubungan biosintesis dan famili tumbuhan (Jenner 2005). Informasi ini sangat berguna oleh ahli sintesis kimia organik untuk memprediksi subsituen senyawa aktif tersebut sehingga dapat lebih berkhasiat. Tanaman yang diuji fitokimianya dapat berupa tanaman segar, kering, serbuk, ekstrak, maupun dalam bentuk sediaan (Harborne 1987).
Ekstraksi
Keanekaragaman flora (biodiversity) berarti pula keanekaragamn senyawa kimia
(chemodiversity) yang terkandung di
dalamnya. Hal tersebut memicu dilakukannya suatu analisis terhadap metabolit sekunder yang terkandung dalam tumbuh-tumbuhan melalui teknik
pemisahan, metode analisis, dan uji farmakologi (Simpen 2008).
Ekstraksi merupakan proses penarikan komponen atau zat aktif dari suatu campuran padatan atau cairan dengan menggunakan pelarut tertentu. Pelarut yang digunakan tidak bercampur atau hanya bercampur sebagian dengan campuran padatan atau cairan. Dengan kontak yang intensif, komponen aktif pada campuran akan berpindah ke dalam pelarut (Gamse 2002). Pemilihan pelarut merupakan salah satu faktor yang dapat menentukan kesempurnaan proses ekstraksi. Pelarut yang digunakan pada proses ekstraksi harus dapat menarik komponen aktif dari campuran dalam sampel (Gamse 2002).
Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam memilih pelarut diantaranya, selektivitas, sifat pelarut dan kemampuan pelarut untuk mengekstraksi, tidak bersifat racun, mudah diuapkan, dan relatif murah (Gamse 2002). Pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi dapat menembus pori-pori bahan padat sehingga bahan yang ingin diekstrak dapat dengan mudah tertarik. Pelarut yang umum digunakan diantaranya, etil asetat, heksana, eter, benzena, toluena, etanol, isopropanol, aseton, dan air (Simpen 2008).
Metode ekstraksi dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu ekstraksi sederhana dan ekstraksi khusus. Ekstraksi sederhana terdiri atas maserasi, perkolasi, reperkolasi, evakolasi, dan dialokasi. Ekstraksi khusus terbagi atas sokletasi, arus balik, dan ultrasonik (Harborne 1987). Penelitian ini menggunakan metode maserasi.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan AlatBahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah buah makasar, akuades, alkohol 95%, heksana, metanol, kloroform,
enzim α-glukosidase, p-nitrofenil-α-D- glukopiranosida (p-NPG), larutan buffer fosfat (pH 7), serum bovine albumin,
acarbose (glucobay), dimetilsulfoksida
(DMSO), HCl 2N, dan Na2CO3. Bahan- bahan yang dipakai untuk uji fitokimia adalah H2SO4 2M, pereaksi (Dragendorf, Mayer & Wagner), etanol 30%, asam asetat anhidrat, H2SO4pekat, dan metanol 30%.
Alat-alat yang dipakai adalah spketrofotometer UV, penangas air, neraca analitik, rotavapor, corong pisah, pipet mikro, pipet volumetrik, pipet tetes, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, gelas piala, gelas ukur, bulb, batang pengaduk sudip, corong gelas, kertas saring, kapas, dan sentrifus.
Metode
Ekstraksi Buah Makasar (Usman 2000) Ekstrak buah makasar dibuat menjadi dua fraksi yaitu fraksi air dan heksana. Buah makasar yang telah kering dan menjadi serbuk kemudian direndam dalam alkohol 95% selama 24 jam dan disaring. Residu yang didapat kemudian direndam kembali dengan alkohol 95% dan dilakukan berulang kali hingga larutan hasil ekstraksi tidak berwarna lagi. Semua filtrat kemudian dijadikan satu dan dipekatkan dengan rotavapor 40oC sehingga bebas alkohol.
Ekstrak kasar yang telah diperoleh kemudian dipartisi dengan campuran heksan, metanol, dan air dengan perbandingan 5:9:1 (v/v). Partisi dilakukan dengan menggunakan corong pisah sehingga diperoleh fase heksan dan fase metanol air. Bahan dalam fase heksan yang telah diperoleh kemudian dikeringkan dengan rotavapour 40oC, hingga diperoleh fraksi heksanayang siap untuk diuji. Bahan dalam fase metanol air, setelah dikeringkan dengan rotavapor 40oC, kemudian dipartisi kembali dengan campuran kloroform dan air dengan perbandingan 1:1 hingga diperoleh dua fase, fase kloroform dan fase air. Masing-masing fase kemudian dikeringkan dengan rotavapour 40oC hingga diperoleh fraksi air untuk diujikan.
Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Analisis fitokimia yang dilakukan dalam penelitian ini hanya dilakukan secara kualitatif, analisis ini dilakukan untuk mengetahui senyawa-senyawa aktif yang terkandung dalam fraksi heksana dan air ekstrak buah makasar. Senyawa yang diidentifkasi adalah senyawa flavonoid, alkaloid, dan triterpenoid.
Uji Alkaloid. Sebanyak 0.05 gram ekstrak buah makasar ditambahkan 5 mL kloroform dan amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 1 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam dibagi menjadi tiga tabung kemudian masing-masing ditambahkan
pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner.
Uji Flavonoid. Sebanyak 0.05 gram ekstrak buah makasar ditambahkan dengan metanol 30% kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat ditambahkan dengan H2SO4, senyawa flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah karena adanya penambahan H2SO4.
Uji Triterpenoid. Sebanyak 0.05 gram ekstrak buah makasar ditambahkan dengan 12.5 mL etanol 30% lalu dipanaskan selama 5 menit dan disaring. Filtratnya kemudian diuapkan dan kemudian ditambahkan dengan eter. Lapisan ditambahkan dengan pereaksi Lieberman Burchard (3 tetes asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu yang terbentuk menunjukkan adanya triterpenoid.
Pembuatan Kurva Standar
Kurva standar dibuat melalui enam titik deret standar, diantaranya pada konsentrasi
15 M, 30 M, 45 M, 60 M, 75 M, dan λ0 M. Larutan standar dibuat dengan melarutkan 4-nitrofenol dalam larutan buffer fosfat (pH 7) dan dibuat menjadi enam konsentrasi seperti di atas. Kemudian larutan standar diukur pada panjang gelombang 400 nm. Percobaan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan.
Uji Inhibisi α-Glukosidase (Sutedja 2003) Pengujian terhadap daya hambat aktivitas enzim α-glukosidase menggunakan substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (p- NPG) dan enzim α-glukosidase, pada pengujian tersebut α-glukosidase akan menghidrolisis substrat p-NPG menjadi glukosa dan p-nitrofenol yang berwarna kuning. Sampel yang ditambahkan ke dalam campuran substrat diharapkan akan menghambat kerja enzim sehingga mengurangi terbentuknya glukosa dan intensitas warna kuning yang terbentuk.
Larutan enzim dibuat dengan
melarutkan 1.0 mg enzim α-glukosidase dalam larutan buffer fosfat (pH 7) yang mengandung 200 mg serum bovin albumin, sebelum digunakan enzim diencerkan 25 kali dengan buffer fosfat (pH 7). Campuran pereaksi terdiri atas 250 Lp-nitrofenil α-D- glukopiranosida (p-NPG) 20 mM sebagai
substrat, 4λ0 Llarutan buffer fosfat (pH 7)
DMSO 1% (b/v). Kemudian campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 5 menit, setelah itu ditambahkan larutan enzim
sebanyak 250 L dan diinkubasi kembali selama 15 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan menambahkan Na2CO3 200 mM
sebanyak 1000 L. Kemudian larutan diukur pada panjang gelombang 400 nm.
Tablet Acarbose (glukobay) dilarutkan dalam buffer dan HCl 2N (1:1) dengan konsentrasi 1% (b/v) sebagai blanko, kemudian disentrifuse dan supernatan diambil sebanyak 10 L dan dimasukkan ke dalam campuran reaksi seperti dalam sampel. Hasil campuran tersebut diukur dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm. Percobaan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan.
Analisis Data (Mattjik 2002)
Rancangan percobaan pada penelitian ini adalah rancanan acak lengkap (RAL) satu faktor dengan tiga kelompok perlakuan dan tiga kali ulangan. Analisis data menggunakan ANOVA dengan model rancang sebagai berikut:
Yij= + αi+ εij Keterangan:
= Pengaruh rataan umum
αi= Pengaruh perlakuan ke-I, i = 1,2,3,4
εij =Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1,2,3
i = 1 adalah blanko
i = 2 adalah fraksi air buah makasar 1% i = 3 adalah fraksi heksana buah makasar
1%
i = 4 adalah pembanding atau kontrol positif
Acarbose1%