Isolat dan Media Pertumbuhan Bakteri
Isolat-isolat bakteri penghasil fiase yang digunakan pada penelitian ini merupakan koleksi Laboratorium Riset, Fakultas Teknobiologi, Universitas Katolik Atmajaya (Yogiara et al. 2008). Untuk menumbuhkan bakteri-bakteri tersebut digunakan media Luria Berthani dengan komposisi perliternya adalah 5 g yeast extract, 10 g tripton, 10 g NaCl, dan dH2O sampai volume mencapai 1 L dan jika diperlukan media padat maka ditambahkan 20 g agar.
Pengamatan morfologi bakteri
Identifikasi awal yang dilakukan berupa pengamatan terhadap koloni bakteri yang meliputi pengamatan terhadap warna, elevasi, tepian, bentuk, dan ukurannya. Selain itu, juga dilakukan pengamatan bentuk dan penataan/pengelompokan sel serta motilitasnya menggunakan mikroskop. Untuk mengetahui tipe dinding sel masing-masing isolat bakteri dilakukan uji pewarnaan gram sesuai dengan prosedur dalam Hadioetomo (1993). Biakan bakteri yang akan diuji dioleskan pada kaca objek lalu dikeringanginkan. Untuk mempercepat proses pengeringan dibantu dengan fiksasi panas. Kemudian kaca objek tersebut diletakkan pada rak kawat. Setelah itu digenangi dengan pewarna primer ungu kristal selama 1 menit. Lalu kaca objek dimiringkan dengan pinset untuk membuang kelebihan zat warna dan dibilas dengan akuades. Sisa air yang masih menempel dihisap dengan kertas serap. Selanjutnya olesan tersebut di beri iodin selama 2 menit dengan cara yang sama. Setelah dibilas dengan akuades, olesan dicuci dengan etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik lalu dibilas dengan akuades. Kemudian diwarnai dengan safranin selama 30 detik dengan cara yang sama dengan pewarna pertama. Preparat yang sudah jadi lalu diamati di bawah mikroskop dan dibandingkan dengan kontrol. Sebagai kontrol bakteri gram positif digunakan Bacillus sp. Sedangkan kontrol bakteri gram negatif adalah
12
Pengamatan sifat-sifat fisiologis
Uji fisiologis awal yang dilakukan meliputi uji katalase dan uji oksidase. Uji katalase dilakukan dengan cara meletakkan satu tetes H2O2 3% pada kaca objek lalu sebanyak satu lup biakan bakteri yang diuji dicampurkan pada tetesan tersebut dengan cara mengaduknya. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung gas setelah beberapa saat. Uji oksidase dilakukan dengan cara mengoleskan satu lup koloni biakan yang diuji pada kertas strip oksidase. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna biru atau hitam.
Sifat-sifat fisiologis lainnya diuji menggunakan tipe 12A + 12B dari kit microbact™ (Oxoid, UK). Sebanyak 2-3 koloni masing-masing isolat bakteri yang berumur 18-24 jam disuspensikan dalam 5 ml garam fisiologis. Kemudian masing-masing sebanyak 4 tetes suspensi dimasukkan kedalam setiap sumur kit mucrobact yang telah berisi substrat yang berbeda-beda untuk menguji reaksi fisiologis yang berbeda pula (Tabel 3). Setelah itu pada sumur nomor 1, 2, dan 3 untuk tipe 12A dan sumur nomor 8 dan 12 pada tipe 12B diberi satu tetes mineral oil. Semua sumur ditutup dan diinkubasi pada suhu ruang selama 18-24 jam. Reaksi positif atau negatif dicatat dengan membandingkannya dengan tabel warna. Pada sumur nomor 8 pada tipe 12A ditambahkan 2 tetes reagen indol lalu dilakukan pembacaan setelah 2 menit. Pada sumur nomor 10 tipe 12A ditambahkan 1 tetes reagen VP I dan 1 tetes reagen VP II lalu dilakukan pembacaan setelah 15-30 menit. Pada sumur nomor 12 dari tipe 12A ditambahkan 1 tetes reagen TDA lalu langsung dilakukan pembacaan. Setelah pembacaan pada semua sumur selesai kemudian dilakukan uji tambahan pada sumur nomor 7 dari tipe 12A yaitu uji nitrat. Uji ini dilakukan dengan penambahan 1 tetes reagen nitrat A dan 1 tetes reagen nitrat B.
Tabel 3 Uji fisiologis yang tersedia pada kit microbact™ tipe 12A dan 12B
Tipe Uji Fisiologis
12A 1 Lisin 2 Ornitin 3 H2S 4 Glukosa 5 Manitol 6 Silosa
7
ONPG 8 Indol 9 Urease 10 VP 11 Sitrat 12 TDA
12B 1Gelatin 2 Malonat 3 Inositol 4 Sorbitol 5 Ramnosa 6 Sukrosa
7
13
Isolasi DNA Genom
DNA genom bakteri diisolasi menggunakan metode CTAB (Murray & Thomson 1980) dengan sedikit modifikasi. Bakteri ditumbuhkan pada media LB selama ± 24 jam lalu dipanen. Masing-masing biakan disentrifusi pada 6000 rpm selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Endapan sel direuspensi dala buffer TE lalu disentrifusi kembali pada 6000 rpm selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Endapan diresuspensi dalam 500 µl TE, selanjutnya ditambahkan 40 µl 10% SDS dan 8 µl proteinase-K (10 mg/ml) lalu dicampur dengan cara membolak-balikan tabung. Kemudian diinkubasi pada 370C selama 1 jam. Setelah itu ditambahkan 100 µl 5 M NaCl dan 100 µl 10% CTAB/NaCl yang sudah dipanaskan pada 650C. Setelah dicampur dengan baik, diinkubasi pada 650C selama 20 menit.
Kemudian ditambahkan 500 µl PCI (25:24:1) dan dicampur dengan membolak-balikan tabung secara kuat. Lalu tabung disentrifugasi pada 10 000 rpm selama 10 menit. Lapisan atas yang terbentuk dipindahkan pada tabung baru. Ekstrasi kedua menggunakan 500 µl CI (24:1) dengan cara yang sama. Selanjutnya ditambahkan 500 µl isopropanol dingin dan dicampur perlahan lalu diinkubasi pada -200C selama 20 menit. Setelah itu dilakukan sentrifusi pada kecepatan maksimum selama 5 menit dan supernatan dibuang. Endapan DNA ditambah dengan 1 ml etanol 70% lalu dicampur perlahan. Kemudian dilakukan sentrifusi pada kecepatan maksimum selama 2 menit dan supernatannya dibuang. Tabung yang berisi DNA ini disimpan pada temperatur ruang secara terbuka sampai semua etanol menguap. Selanjutnya DNA dilarutkan dalam ± 50 µl buffer elusi atau ddH2O. DNA dideteksi menggunakan elektroforesis gel agarosa dengan pewarna 0.5 µg/ml ethidium bromida.
Amplifikasi Gen Penyandi 16S rRNA
Gen penyandi 16S rRNA diamplifikasi menggunakan primer 63f
(5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC) dan primer 1387r
(5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC) (Marchesi et al. 1998). Kondisi PCR yang digunakan adalah pre-PCR pada 940C selama 2 menit, denaturasi pada 920C selama 30 detik, penempelan primer pada 550C selama 30 detik, perpanjangan
14
rantai pada 750C selama 1 menit dan post PCR pada 750C selama 20 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus. Komposisi PCR yang digunakan adalah 100 ng DNA, 5 pmol primer 63f, 5 pmol primer 1387r, 0.5 µl enzim polymerase termostabil (5U/µl), 2.5 µl 10 X buffer, 2 µl dNTPmix, dan ddH2O sampai volume mencapai 25 µl. Setelah itu, fragmen DNA hasil PCR dipurifikasi menggunakan QiaexII Gel Extraction Kit (Qiagen, USA)
Amplifikasi gen penyandi fitase
Mengingat belum diketahuinya termasuk ke dalam kelas apa enzim fitase yang dihasilkan oleh keempat isolat pada penelitian ini maka dipakai sepasang primer yang diambil dari sekuen gen penyandi fitase dari bakteri yang sekerabat
yaitu Escherichia coli dengan sekuen primer Ecf
5’-GCTAATCCCCTATCTCGGAC-3’ dan Ecr 5’-TAATAACGGGGTGGCGCGG-3’.
Komposisi PCR yang digunakan adalah 100 ng DNA, 5 pmol primer forward, 5 pmol primer riverse, 22.5 µl Platinum Blue PCR supermix (Invitrogen, USA), dengan volume akhir mencapai 25 µl. Kondisi PCR terdiri dari prePCR pada 94ºC selama 4 menit, denaturasi pada 92ºC selama 2 menit, penempelan primer pada 50ºC selama 30 detik, perpanjangan primer pada 72ºC selama 1 menit, dan post PCR pada 72ºC selama 10 menit dengan jumlah siklus sebanyak 30. Hasil amplifikasi kemudian dideteksi menggunakan elektroforesis gel mini lalu dipurifikasi menggunakan QiaexII Gel Extraction Kit (Qiagen, USA).
Kloning gen penyandi fitase
Kloning gen fitase dilakukan menggunakan TOPO TA Cloning® kit (Invitrogen, USA). Fragmen DNA hasil amplifikasi gen penyandi enzim fitase disisipkan pada pCR®2.1-TOPO (Gambar 2). Ligasi dilakukan dalam suatu reaksi menggunakan 1 µl dilute salt solution, 1µl (10 ng/µl) vektor, 2 µl DNA hasil PCR dan ddH2O sampai volume mencapai 6 µl. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit lalu dipindahkan ke es.
Kultur E. coli TOP10 elektrokompeten disiapkan berdasarkan metode yang diterangkan dalam MicroPulser™ Electroporation Apparatus Operating
15
Instructions and Applications Guide (Biorad, USA). Kemudian sebanyak 2,5 µl plasmid rekombinan dicampur dengan 40 µl sel E. coli kompeten. Campuran ini diinkubasi di atas es selama 1 menit lalu dipindahkan pada kuvet berukuran 0,2 cm. Elektroporasi dilakukan menggunakan micropulser™ electroporator apparatus (Biorad, USA). Setelah itu ditambahkan 800 µl Luria Berthani Broth dan diresuspensi lalu dibagi dalam 2 tabung. Inkubasi dilakukan selama 1 jam pada suhu 370C pada shaker bath lalu disebar pada media LA yang mengandung 40 µg/ml X-gal dan 50 µg/ml kanamisin dan diinkubasi selama semalam. Hasil transformasi diamati keesokan harinya. Koloni bakteri transforman yaitu yang berwarna putih diambil dan dibiakkan. Sebagai kontrol negatif digunakan E. coli
kompeten yang tidak ditambahkan plasmid, sedangkan control positif terdiri dari kontrol ligasi yaitu E. coli kompeten yang diintroduksi dengan plasmid vector yang diligasikan dengan kontrol insert, dan kontrol transformasi yaitu E. coli
kompeten yang diintroduksi dengan pUC19.
Verifikasi transforman
Koloni transforman yang sudah dibiakkan masing-masing diambil menggunakan tusuk gigi steril lalu diresuspensi dalam pereaksi PCR yang terdiri dari 5 pmol primer M13f, 5 pmol primer M13r, 22.5 µl Platinum Blue PCR supermix, dengan volume akhir mencapai 25 µl. Kemudian diinkubasi pada 940C selama 10 menit untuk melisis sel dan menonaktifkan nuklease. Amplifikasi dilakukan sebanyak 25 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 940C selama 1 menit, penempelan primer pada 550C selama 1 menit, perpanjangan primer pada 720C selama 1 menit dan post PCR pada 72oC selama 10 menit. Hasil amplifikasi dideteksi dengan elektroforesis gel agarosa lalu dipurifikasi menggunakan
QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen, USA).
Verifikasi Plasmid Rekombinan
Selain itu, koloni transforman juga diisolasi plasmid rekombinannya menggunakan HiYield™ Plasmid kit (RBC). Plasmid rekombinan yang telah diisolasi dari E. coli transforman diverifikasi dengan cara memotongnya menggunakan enzim restriksi EcoRI. Fragmen DNA hasil pemotongan ini
16
kemudian dimigrasikan pada gel agarosa untuk melihat besarnya ukuran vector dan DNA sisipan.
+
A B
CCCCCCC C
Gambar 2. Penyisipan produk PCR yang diduga gen penyandi fitase pada pCR®2.1-TOPO® A = pCR®2.1TOPO®, B = produk PCR yang diduga gen penyandi fitase, C = Plasmid rekombinan (pRA)
17
Penentuan Urutan Sekuen DNA
Fragmen DNA ditentukan urutan sekuennya dengan cara mengamplifikasinya dalam suatu reaksi cycle sequencing. Pada proses ini digunakan salah satu dari pasangan primer (F/R), DNA cetakan, Bigdye terminator ready reaction mix (ddNTP berlabel, dNTP, DNA polimerase, MgCl2, buffer Tris-HCl pH 9.0). Setelah dilakukan purifikasi, hasil amplifikasi ini dideteksi dengan elektroforesis menggunakan ABI Prism 310 Genetic analyzer®.
Analisis Sekuen DNA
Data sekuen DNA disimpan pada notepad dengan format fasta. Selanjutnya data sekuen DNA ini dibandingkan dengan data base pada genebank (http://www.ebi.ac.uk) menggunakan program Blast (Basic local aligment search tool). Dari hasil ini dipilih sejumlah data sekuen DNA yang diperlukan sesuai dengan kata kunci yang diinginkan lalu dipindahkan pada notepad dengan format fasta. Kemudian dilakukan multiple sequence alignment melalui program Clustal W. Data yang keluar dari hasil analisis ini dipindahkan ke notepad (dalam format
phylip) lalu digunakan sebagai input untuk membuat pohon filogenetik menggunakan program treecon (Van de Peer & De Wachter 1994).