Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan April-Oktober 2008 di Laboratorium Mikrobiologi Pusat Peneitian Bioteknologi dan Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.
Alat dan Bahan. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah pH meter, spektrofotometer, laminar air flow, sentrifugator, inkubator, timbangan analitik, PCR, squencer ABI PRISM 3100 (Applied Biosystem), elektroforesis, pipet mikro, water bath, consentrator vakum, freeze drying. Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah isolat Lactobacillus plantarum BTCC570, Leuconostoc sp. BTCC 531, sapi PO fistula pada bagian rumen, rumput gajah, konsentrat produksi PT. Indofeed, silase pakan dasar, kapsul probiotik Leuconoctoc sp. BTCC531, primer 6FAM-46F (Sigma) yang dilabel dengan 6-carboxylfluoresens, primer 1080R, enzim restriksi HaeIII,
HhaI, dan MspI (Takara Bio Inc.), bahan-bahan untuk PCR dan bahan kimia standar p.a.
Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu 1) Persiapan percobaan meliputi; penumbuhan isolat, pembuatan silase, pembuatan probiotik, pembuatan lubang fistula pada kedua sapi PO, 2) perlakuan percobaan, 3) pengambilan sampel percobaan, 4) analisis sampel percobaan, dan 5) analisis data.
Penumbuhan Isolat. Isolat L. plantarum BTCC570 dan Leuconostoc
Sharpe (MRS) (deMan et al. 1960) pada suhu inkubasi sekitar 30-32oC selama 18 jam. Isolat L. plantarum BTCC570 digunakan sebagai stok dalam pembuatan inokulum silase dan Leuconostoc sp.BTCC531 digunakan sebagai probiotik yang dikemas dalam kapsul dan disimpan di dalam refrigerator sampai digunakan saat percobaan. Untuk keperluan produksi maka diambil sekitar 2 ose yang ditransfer ke dalam medium prekultur MRS cair yang bervolume 5% dari medium produksi (v/v).
Pembuatan Silase. Silase dibuat dari campuran 90% bahan segar
Pennisetum purpureum (rumput gajah) yang sebelumnya telah dipotong-
potong sekitar 3cm oleh mesin pemotong dengan 10% w/w konsentrat pakan produksi PT. Indofeed yang dalam 1kg mengandung 140g protein kasar (PK), 40g lemak (L), 80g serat kasar (SK), dan 100g abu. Konsentrat tersebut memiliki protein dapat dicerna 11% dan total digestable nutrient
(TDN) 68%. Setelah dicampur merata, kemudian ditambahkan 0.1% (v/w) inokulum silase L. plantarum BTCC570 dengan kepadatan populasi awal 1010cfu/ml ke dalam bahan silase. Bahan silase ditempatkan ke dalam silo tong plastik biru (diameter 50cm dan tinggi 120cm) sambil dilakukan pemadatan sampai penuh sekitar 75kg bahan silase/silo.
Selanjutnya dilakukan penutupan dengan ditambahkan alas plastik, dan disegel. Silase diinkubasikan selama 21-30 hari pada suhu ruang. Kualitas silase yang sudah dipanen ditentukan dengan analisis proksimat, pH, dan kepadatan populasi BAL silase (Cappuccino et al. 2001).
Pembuatan Probiotik. Probiotik dibuat dari isolat Leuconostoc sp. BTCC531 5% v/v dari jumlah probiotik yang dibuat dengan menggunakan medium MRS cair. Kemudian diinkubasikan dalam inkubator selama 18 jam pada suhu 30-32oC. Prekultur yang tumbuh ditandai dengan
kekeruhan dari medium asal dan diukur absorbansinya (OD600)
menggunakan spektrofotometer. Selanjutnya dipindahkan prekultur ke dalam medium produksi, dan diinkubasikan dalam inkubator selama 18 jam pada suhu 30-32oC. Kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4-10oC. Endapan hasil sentrifugasi (biomassa sel bakteri probiotik) dicampurkan ke dalam 100ml larutan skim milk steril 10-20% w/v secara merata. Kemudian dibekukan dalam freezer -80oC selama satu malam.
Campuran biomasa dengan carrier selanjutnya dilakukan pengeringbekuan dengan menggunakan freeze-drying selama 48 jam pada suhu -50oC sampai -80oC dalam keadaan vakum. Proses
freeze drying
selesai dengan ditandai biomasa campuran yang awalnya basah menjadi kering dengan kandungan BK sekitar 95%. Probiotik kering dihaluskan menjadi probiotik bubuk dengan menggunakan blender yang telah dilakuan sterilisasi. Kualitas probiotik dilihat dari kepadatan populasi
Leuconostoc sp. BTCC531 dalam medium MRS agar (Cappuccino et al.
2001). Bubuk probiotik kering kemudian dikemas ke dalam kapsul 0,4g/kapsul.
Pembuatan Lubang Fistula. Lubang fistula dibuat pada bagian flang rumen yang berada di sebelah kiri atas oleh tim dokter hewan ahli bedah hewan besar dari Fakultas Kedokteran Hewan IPB (Gambar 2). Sapi PO yang telah selesai dioperasi dilakuan pengecekan kesehatan secara rutin dan diberikan masa adaptasi selama 1 bulan sebelum memasuki perlakuan percobaan.
Gambar 2. Sapi PO fistula pada bagian rumen
Perlakuan Percobaan. Penelitian ini menggunakan dua ekor sapi PO yang telah diadaptasikan selama satu bulan pasca operasi pembuatan fistula sebagai ulangan. Sebanyak empat perlakukan pemberian pakan dilakukan secara serial pada kedua sapi tersebut meliputi: 20kg bahan segar (BK 31,65%) pakan dasar mengandung (90% rumput gajah dan 10% konsentrat pakan produksi PT. Indofeed (R0), 20kg bahan segar silase (BK 32,72%) (R1), 20kg silase ditambah 1 butir kapsul probiotik/ekor/hari (R2) dan 20kg pakan dasar ditambah 1 butir kapsul probiotik/ekor/hari (R3). Waktu setiap perlakuan pemberian pakan adalah dua minggu dan waktu pencucian rumen setiap perlakuan adalah 10 hari menggunakan pakan dasar (R0).
Pengambilan Sampel Percobaan. Sampel isi rumen diambil dari setiap perlakuan melalui lubang fistula sebanyak 3 kali, yaitu pada hari ke-5, ke- 10 dan ke-14 (Gambar 3). Pengambilan sampel dilakukan 3 jam setelah pemberian pakan. Sebanyak 200gram substrat rumen dari setiap perlakuan diambil menggunakan pinset besar dan ditempatkan pada 4 tabung steril (corning tube). Sampel disimpan pada suhu –20oC untuk keperluan analisis berikutnya meliputi pengukuran nilai pH dengan pH meter, VFA parsial dengan metode kromatografi gas, aktivitas enzim karboksimetilselulase dengan metode DNS (Ghose 1987, Wang 2000) dan analisis populasi mikroba rumen dengan metode T-RFLP.
Ekstraksi DNA Genom Bakteri Rumen. Sampel isi rumen dari setiap perlakuan dari masing-masing perlakuan dilakukan ekstraksi DNA genom dengan menggunakan kit dari Qiagen-Jepang. Persiapan sampel ekstraksi DNA genom bakteri, sekitar 10 gram substrat rumen 9-10% BK dilakukan pemerasan dengan saringan kain kasa steril. Sebanyak 3-5ml cairan rumen hasil pemerasan divortek selama 2 menit dan dengan segera disimpan dalam es. Kemudian sebanyak 200µl cairan rumen dicuci 2 kali dengan 1x
phospat buffer saline 800µl menggunakan sentrifuge 10.000rpm selama 2
menit. Endapan yang didapatkan selanjutnya dilakukan ekstrak DNA genom bakteri dengan kit DNeasy Blood and Tissue dari Qiagen Jepang sesuai dengan prosedur kerja yang disaranankan oleh perusahaan tersebut.
Analisis T-RFLP. Analisis T-RFLP yang dilakukan berdasarkan modifikasi tahapan yang dilaporkan oleh Dinoto et al. (2006a) yaitu tahap pertama adalah mengamplifikasi dengan PCR. DNA genom bakteri rumen hasil dari ekstraksi DNA genom bakteri rumen digunakan sebagai template (cetakan)
dalam amplifikasi PCR. Kondisi reaksi PCR, campuran reaksi 50µl ; DNA template kurang dari 1µg (2µl), primer 6FAM-46F (5’-GCYTAACACATGCAAGTCGA-3’) 0,4µM (10pqmol; 2µl) yang dilabel dengan 6-carboxylfluoresens, 1080R (5’-CCCAACATCTCACGAC-3’) 0.4µM (10pqmol; 2µl), Premix Taq®25µl (Takara Bio Inc, Otsu Japan, yang terdiri dari; 25mM TAPS, 50mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 200
µM (masing-masing mengandung dATP, dGTP, dTTP), 100 µM (α 32P)- dCTP, aktivasi 0,25mg/ml DNA sperma salmon, Takara ExTaqTM 1,25 Unit/25 µl, dNTP mixture 2x cons @ 0.4 mM, dan ExTaq buffer 2x cons 4 mM Mg2+), dan H2O 19 µl. Kondisi PCR, pradenaturasi pada suhu 94oC
selama 2 menit; sebanyak 30 siklus pada suhu 94oC selama 2 menit,
48,5oC selama 1 menit dan 72oC selama 1 menit; selanjutnya tahap terakhir pada suhu 72oC selama 10 menit. Produk PCR dilihat keberhasilannya dengan gel elektroforesis pada 1,2% agarosa. Selanjutnya produk PCR dilakukan pemurnian dengan menggunakan SUPREC PCR (Takara Bio Inc, Otsu Japan).
Tahap selanjutnya adalah sekitar kurang dari 1µg DNA amplikon gabungan dari 3 waktu pengambilan sampel pada masing-masing perlakuan dipotong dengan enzim restriksi HaeIII (50U/µl), HhaI(10U/µl), dan MspI (50U/µl) (Takara Bio Inc.) pada suhu 37oC selama 24 jam dan diberhentikan dengan diinkubasikan pada suhu 65oC dalam water bath selama 20 menit, selanjutnya dengan segera dimasukan ke dalam box es. Hasil potongan dipresipitasi dengan etanol dan dikering vakumkan. Tahap terakhir dilakukan scaning menggunakan genescaning (ABI PRISM 3100; Applied Biosystem) di Universitas ATMAJAYA Jakarta dengan standar Lz 500 ROX.
Analisis Data Ekologi. Data yang didapatkan dari genescan dilakukan normalisasi mengikuti Sait et al. (2003) dengan batasan nilai 5% area puncak T-RF relatif. Untuk melihat kedekatan bakteri yang didapatkan dihitung berdasarkan pendekatan koefisien similaritas (Cs), dimana ;
Cs=2j/(a + b),
j; jumlah populasi organisme yang ada di dua sampel
a; total populasi di sampel a
b; total populasi disampel b.
Penentuan keragaman filotipe ekologi dari bakteri rumen (S) ditentukan oleh perbedaan jumlah T-RF yang didapatkan. Keragaman populasi bakteri rumen ditentukan dengan indeks keragaman Smith and Wilson evenness (Evar), dimana pi (relatif area) merupakan perbandingan area puncak T-RF tertentu terhadap jumlah total area puncak T-RF (Blackwood et al. 2007). Perhitungan indeks keragaman Evar mengikuti persamaan berikut :
Evar=1 - 2 arctan ∑ ln(pi) - ∑ ln (pi)/S S
Pengukuran pH Rumen. Substrat rumen dari setiap perlakuan dilakukan pengukuran pH dengan menggunakan pH meter. Analisis dilakukan langsung setelah pengambilan sampel isi rumen dilakukan.
Analisis VFA Parsial. Sebanyak 5ml sampel cairan rumen (hasil pemerasan substrat rumen) ditambahkan 1ml pengendap protein (Metaphosphoric acid, 12,5g; air steril 50ml), kemudian dilakukan sentifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya 1ul supernatan diinjeksikan ke dalam GC (Gas Chomatography). Konsentrasi VFA parsial yang diukur adalah asam asetat, asam propionat, asam butirat, asam
2
i=1 π
s s
valerat, asam isobutirat, dan asam isovalerat. Perhitungan VFA parsial substrat rumen masing-masing perlakuan dihitung berdasarkan rumus: Konsentrasi VFA parsial (mM) = Luas area sampel x FP x Konsentrasi
Luas area standar
BM sampel FP = Faktor pengenceran
BM = Berat Molekul
Aktivitas Enzim Selulase. Analisis aktivitas enzim yang diukur adalah aktivitas selulase sampel menggunakan karboksimetilselulase (CMC). Aktivitas enzim tersebut digunakan dalam melihat hubungan populasi bakteri tertentu dengan aktivitas enzim selulase yang dihasilkan pada saat pengambilan sampel dari masing-masing perlakuan dengan menggunakan metode pengukuran dengan DNS (Ghose 1987, Wang et al. 2000).
Analisis Data. Data yang diperoleh pada parameter pH, VFA, dan aktivitas enzim selulase isi rumen dianalisis dengan menggunakan sidik ragam berdasarkan rancangan percobaan tukar ganti (Jones et al. 2003) dan dilanjutkan dengan uji Tukey pada taraf nyata 5% untuk melihat perbedaan yang nyata dari setiap perlakuan. Perhitungan dibantu dengan menggunakan software program SAS versi 9 for windows. Analisis indeks keragaman Evar dihitung dengan merata-ratakan data gabungan kedua sapi dari periode pengambilan sampel setiap perlakuan.