Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fitopatologi Balai Uji Terap Teknik dan Metode Karantina Pertanian (BUTTMKP) Bekasi, Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN) Jakarta, dan PT. Rel-Ion Sterilization Bekasi dari bulan Agustus 2011 sampai Januari 2012.
Metode Penelitian
Perlakuan Iradiasi terhadap BeberapaPatogen Tumbuhan
Patogen model. OPTK A1 pada bawang merah diantaranya adalah E. carotovora subsp. atroseptica, P. syringae pv. syringae, dan C. duddiae. Namun dalam penelitian ini yang akan diuji adalah beberapa patogen tumbuhan sebagai model OPTK A1 yaitu E. carotovora, Pseudomonas kelompok fluorescent, dan C. personata.
Penyediaan inokulum. Bakteri E. carotovora diisolasi dari umbi lobak (Raphanus sativus L.) bergejala penyakit busuk lunak yang disebabkan oleh E. carotovora. Umbi lobak diambil di lokasi kebun percobaan Balai Penelitian
Tanaman Sayuran Lembang propinsi Jawa Barat. Umbi lobak bergejala
disterilisasi permukaan menggunakan 0.5% kloroks selama 3 menit dan dibilas 3 kali menggunakan air destilata. Bakteri diisolasi dengan cara menggerus 1 g umbi yang diambil dari bagian umbi bergejala dalam 10 ml air destilata. Suspensi yang diperoleh dipindahkan ke tabung reaksi dan dibuat pengenceran secara berseri hingga 10-5. Sebanyak 100 µl suspensi dari tiap-tiap pengenceran disebar pada media Nutrient Agar (NA) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari. Koloni bakteri yang tumbuh selanjutnya diamati.
Koloni bakteri yang menunjukkan karakter berwarna bening kemudian diuji dengan reaksi Gram menggunakan KOH 3%, pertumbuhan pada media selektif CVP, dan uji pektolitik pada irisan umbi kentang. Bakteri yang tergolong Gram negatif, tumbuh pada media CVP dengan membentuk cekungan yang dalam, dan menunjukkan gejala busuk lunak pada irisan umbi kentang merupakan E. carotovora (Goszczynska et al. 2000).
14
Bakteri Pseudomonas kelompok fluorescent diisolasi dari bagian daun bawang merah yang bergejala nekrotik di kebun percobaan Balai Penelitian Tanaman Sayuran Lembang propinsi Jawa Barat. Daun bawang merah disterilisasi permukaan menggunakan 0.5% kloroks selama 3 menit dan dibilas 3 kali menggunakan air destilata. Daun bawang merah bergejala seberat 1 g digerus dalam 10 ml air destilata. Suspensi yang diperoleh kemudian dibuat pengenceran berseri hingga 10-5. Sebanyak 100 µl suspensi dari tiap-tiap pengenceran disebar pada media King’s B dan diinkubasi pada suhu ruang selama 2 hari. Media selanjutnya ditempatkan pada ruang gelap dan diberi sinar ultraviolet dengan panjang gelombang 366 nm.
Koloni bakteri pada media King’s B yang menunjukkan karakter berpendar hijau kebiru-biruan atau hijau kekuning-kuningan dibawah sinar ultraviolet selanjutnya dilakukan uji reaksi Gram menggunakan KOH 3%. Koloni Bakteri
yang tergolong Gram negatif merupakan bakteri Pseudomonas kelompok
fluorescent (Goszczynska et al. 2000).
Cendawan C. personata diperoleh dari daun tanaman kacang tanah (Arachis hypogaea L.) bergejala penyakit bercak daun yang disebabkan oleh C. personata
(Cock 2000). Daun kacang tanah diambil dari pertanaman kacang tanah kecamatan Bogor Barat propinsi Jawa Barat. Bagian daun yang bergejala digunting mengikuti lingkar bercak sehingga hanya diambil bagian bercak. Bagian daun yang mengandung bercak kemudian dikumpulkan dan dijadikan bahan inokulum.
Perbanyakan inokulum. Isolat bakteri E. carotovora yang digunakan adalah E. carotovora resisten Rifampicin. Isolat bakteri disiapkan dengan menumbuhkan 10 ml suspensi E. carotovora pada media Nutrient Broth (NB) yang telah ditambahkan 20 mg Rifampicin dalam 100 ml NB (Gambar 2a). Setelah 3 hari, sebanyak 100 µl larutan ditumbuhkan pada media NA yang juga telah ditambahkan 20 mg Rifampicin setiap 100 ml media. Bakteri E. carotovora
yang tumbuh dipindahkan kembali pada media yang sama hingga 6 kali ulangan. Bakteri yang tumbuh merupakan bakteri mutan Rifampicin yang akan digunakan pada tahap berikutnya. Bakteri diperbanyak dengan menumbuhkan bakteri pada
15 25 cawan petri media NA yang telah ditambahkan 20 mg Rifampicin setiap 100 ml media.
Bakteri Pseudomonas kelompok fluorescent dibiakkan pada media King’s B (Gambar 2b) mengikuti petunjuk Schaad et al. (2001). Isolat bakteri digoreskan pada media King’s B sebanyak 25 cawan petri dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 2 hari. Bakteri Pseudomonas kelompok fluorescent yang tumbuh akan digunakan pada tahap berikutnya.
Perbanyakan cendawan C. personata (Gambar 2c) dilakukan dengan
mengumpulkan bagian daun kacang tanah bergejala bercak daun. Untuk 100 butir umbi bawang merah yang akan diuji dibutuhkan 4 g daun bergejala.
Gambar 2 Perbanyakan inokulum, a) perbanyakan isolat E. carotovora pada media NA yang ditambah dengan Rifampicin; b) perbanyakan
Pseudomonas kelompok fluorescent pada media King’s B; dan c) perbanyakan C. personata dari daun kacang tanah bergejala penyakit bercak daun, spora C. personata (insert).
Penularan bakteri dan cendawan. Bawang merah varietas Bima Curut sebanyak 5 butir untuk setiap perlakuan diinokulasi dengan suspensi bakteri E. carotovora dan Pseudomonas kelompok fluorescent secara terpisah, dengan cara direndam dalam suspensi bakteri berumur 24 sampai 48 jam dengan kepadatan 108 cfu/ml. Perendaman dilakukan selama 3 jam (Beraha et al. 1959). Bawang merah selanjutnya dikering-anginkan dan ditempatkan dalam kantong plastik.
Inokulasi cendawan C. personata dilakukan dengan mencampurkan daun bergejala pada tepung talk murni dengan perbandingan 1:10 g (b/b). Campuran tepung dilumurkan pada permukaan umbi bawang merah yang sebelumnya
16
dibasahi dengan air destilata, kemudian dikering-anginkan dan ditempatkan dalam kantong plastik. Untuk setiap perlakuan digunakan 5 butir bawang merah.
Perlakuan iradiasi sinar gamma. Bawang merah yang telah diinokulasi patogen diberi perlakuan iradiasi sinar gamma, dengan dosis 0 (kontrol), 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, dan 5000 Gy (Arabi
et al. 2004). Sinar gamma yang digunakan memiliki panjang gelombang sebesar 3x10-9 cm sampai 3x10-11 cm, dan energi yang dihasilkan sebesar 1.17 MeV sampai 1.33 MeV. Pengujian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 3 ulangan.
Penghitungan kelimpahan patogen. Pada bawang merah yang telah mendapat perlakuan sinar gamma dilakukan pengujian terhadap keberadaan C. personata dengan metode pencucian menggunakan teknik sentrifugasi. Bawang merah sebanyak 1 butir dimasukkan dalam tabung plastik volume 50 ml yang berisi 20 ml air destilata, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 500 rpm. Supernatan diambil dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 6.000 rpm. Padatan berisi spora cendawan yang diperoleh kemudian dicampur dengan larutan dekstrosa dan L-arginin masing-masing 0.5 g/l untuk merangsang perkecambahan spora. Selanjutnya perkecambahan spora diamati menggunakan mikroskop kompon. Penghitungan persentase perkecambahan spora dilakukan dengan menjumlahkan spora yang berkecambah pada 4 bidang pandang pengamatan.
Penghitungan kelimpahan E. carotovora dan Pseudomonas kelompok
fluorescent dilakukan dengan cara menggerus 1 g umbi yang diambil dari 1/4 bagian umbi dalam 30 ml air destilata. Seluruh hasil gerusan disentrifugasi dengan kecepatan 500 rpm. Supernatan yang diperoleh disentrifugasi kembali dengan kecepatan 6000 rpm. Endapan yang terbentuk dipisahkan dari supernatan dan selanjutnya diresuspensikan dengan 10 ml air destilata steril. Dari suspensi tersebut kemudian dibuat pengenceran berseri hingga 10-7. Sebanyak 100 µl suspensi dari tiap-tiap pengenceran selanjutnya ditumbuhkan pada media NA modifikasi (NA ditambah 20 mg Rifampicin) untuk E. carotovora, dan King’s B untuk Pseudomonas kelompok fluorescent. Koloni bakteri yang tumbuh dihitung setelah diinkubasikan pada suhu ruang selama 24 sampai 48 jam.
17
Uji Pengaruh Iradiasi terhadap Perkecambahan dan Daya Tumbuh Bawang Merah
Pengujian perkecambahan (viabilitas) bawang merah dilakukan dengan menghitung persentase umbi yang berkecambah setelah iradiasi. Pengujian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 3 ulangan. Sinar gamma yang digunakan memiliki panjang gelombang sebesar 3x10-9 cm sampai 3x10-11 cm, dan energi yang dihasilkan sebesar 1.17 MeV sampai 1.33 MeV. Dosis iradiasi yang diujikan adalah 0 (kontrol), 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, dan 1000 Gy. Bahan uji berupa bawang merah varietas Bima Curut sebanyak 100 butir per dosis iradiasi. Setelah perlakuan iradiasi bawang merah ditempatkan pada wadah nampan plastik yang disusun secara acak pada rak-rak penyimpanan selama 4 bulan, dengan kelembaban ruang 60–95% dan suhu 24 oC–34 oC. Umbi yang berkecambah dihitung setiap 7 hari selama 4 bulan. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA), dan jika terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) dengan tingkat kesalahan 5% (Gomes & Gomes 1995).
Pada uji daya tumbuh, bawang merah yang telah mendapat perlakuan iradiasi ditumbuhkan dengan cara memotong 1/3 bagian atas umbi untuk merangsang pertunasan. Selanjutnya umbi ditumbuhkan pada nampan plastik yang telah ditempatkan 6 lapis kertas tisu yang dibasahi dengan air destilata steril dan ditutup dengan plastik. Umbi tumbuh normal memiliki ciri tunas panjang dan berwarna hijau seperti daun, akar panjang dan kurus, sedangkan umbi tumbuh tidak normal memiliki ciri tunas sangat pendek, lemah dan membusuk (Gambar 3). Pada umbi tumbuh tidak normal bagian pangkal umbi tidak tumbuh akar, atau jika tumbuh ukurannya pendek dan lemah (Kamil 1979). Pengamatan persentase umbi tumbuh normal dan panjang tunasnya dilakukan setiap 3 hari selama 60 hari.
18
Gambar 3 Kondisi pertumbuhan umbi setelah perlakuan iradiasi, a) umbi tumbuh normal; b) umbi tumbuh tidak normal.
Uji Pengaruh Iradiasi terhadap Persentase Umbi Layak Jual
Persentase umbi layak jual dihitung dari jumlah total umbi yang diuji dikurangi jumlah umbi yang busuk, berkecambah, dan kering setelah perlakuan iradiasi. Dosis iradiasi yang digunakan adalah 0 (kontrol), 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, dan 1000 Gy. Bawang merah setelah perlakuan iradiasi disimpan pada rak penyimpanan pada suhu ruang 26.oC-30.oC. Pengamatan dilakukan setiap 7 hari selama 4 bulan. Pengujian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 3 ulangan.
Penilaian Kelayakan Iradiasi Sinar Gamma
Penilaian kelayakan penggunaan iradiasi sinar gamma sebagai teknik perlakuan karantina terhadap bawang merah didasarkan pada asumsi-asumsi ideal. Asumsi ideal tersebut dibuat berdasarkan tujuan kegiatan impor, pelaksanaan tindakan karantina di tempat-tempat pemasukan, dan perilaku konsumen (petani) dalam pemanfaatan bawang merah impor.
Suatu teknik perlakuan karantina harus mampu mengeliminasi OPTK yang terbawa umbi bawang merah. Perlakuan karantina juga harus mampu menghilangkan atau menghambat daya kecambah umbi bawang merah agar tidak dijadikan sebagai bibit oleh petani. Persentase umbi berkecambah maksimal 30% pada 2 bulan setelah perlakuan. Pada persentase tersebut diasumsikan akan
19 merugikan bagi petani jika tetap menggunakan umbi yang telah diberi perlakuan sebagai bibit tanaman. Waktu 2 bulan yang diberikan berkaitan dengan waktu kecepatan distribusi bawang merah untuk sampai ke konsumen. Selain itu, bawang merah yang telah diberi perlakuan harus tetap layak jual agar tidak merugikan pihak importir. Persentase umbi layak jual minimal 90% pada 2 bulan setelah perlakuan, dengan asumsi jumlah tersebut masih menguntungkan bagi importir.
Asumsi ideal dalam penilaian kelayakan penggunaan iradiasi sinar gamma meliputi kemampuan teknik perlakuan untuk menghasilkan 1) persentase umbi berkecambah maksimal 30% pada 2 bulan setelah perlakuan; 2) persentase umbi layak jual minimal 90% pada 2 bulan setelah perlakuan; dan 3) tidak ditemukan OPTK setelah perlakuan. Data hasil penelitian berupa persentase umbi berkecambah, persentase umbi layak jual, dan kelimpahan patogen tumbuhan selanjutnya dibandingkan dengan hasil ideal. Perlakuan iradiasi sinar gamma dikatakan layak sebagai teknik perlakuan karantina jika hasil penelitian memenuhi asumsi ideal seperti dalam Gambar 4.
Gambar 4 Hasil ideal yang diharapkan dari perlakuan iradiasi sinar gamma sebagai teknik perlakuan karantina pada bawang merah.
0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Idea l L o g cf u /g u m b i b er k ec am b ah d an l ay ak j u al ( % )
20