Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman IPB, Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Kajian Buah Tropika (PKBT) IPB, dan Kebun Percobaan Tajur II PKBT IPB sejak Agustus 2007 sampai Januari 2009.
Metode Penelitian
Penelitian ini meliputi tiga kegiatan yaitu: (1) Eliminasi PMWaV melalui perlakuan air panas dan ribavirin pada planlet; (2) Eliminasi PMWaV melalui perlakuan air panas dan ribavirin pada eksplan; dan (3) Eliminasi PMWaV melalui perlakuan air panas pada bahan stek nanas.
Pengamatan Penyakit Layu dan Kutu Putih di Lapang
Pengamatan penyakit layu dan kutu putih pada tanaman nanas telah dilakukan di sentra produksi nanas di Jawa Barat yaitu di Desa Bunihayu, Kec. Jalancagak, Kab. Subang.
Tanaman nanas cv Smooth Cayenne yang bergejala layu diambil dari pertanaman nanas Kab. Subang Jawa Barat. Tanaman yang diambil adalah tanaman nanas yang menunjukkan gejala penyakit layu berwarna merah dan nekrosis pada ujung daun. Verifikasi PMWaV pada sampel tanaman dilakukan dengan TBIA. Tanaman nanas yang positif terinfeksi PMWaV ditanam dalam polibag yang berisi campuran tanah dan kompos dengan perbandingan 1:1. Tanaman nanas tersebut kemudian digunakan sebagai sumber inokulum PMWaV dalam percobaan berikutnya.
Eliminasi PMWaV melalui Perlakuan Air Panas dan Ribavirin pada Planlet
Penyiapan Planlet Nanas. Planlet yang digunakan adalah planlet nanas kultivar Smooth Cayenne klon Curug Rendeng koleksi Laboratorium Kultur Jaringan PKBT IPB yang telah ditanam pada MS0 selama 3 bulan (lebih dari 5 kali sub kultur). Sebagian daun dan akar planlet dibuang kemudian dipotong sepanjang 0,5-1,0 cm dari pangkal batang. Planlet ditanam pada media MS + 0,5µM NAA selama 30 hari
untuk menginduksi pengakaran pada planlet. Planlet tersebut kemudian diinokulasi dengan PMWaV menggunakan vektor kutu putih.
Inokulasi PMWaV pada Planlet. Kutu putih (Dysmicoccus sp.) diambil dari pelepah pangkal batang dan akar tanaman nanas kemudian diperbanyak pada buah kabocha (Cucurbita maxima). Kutu putih dipindahkan dengan menggunakan kuas basah ke buah kabocha yang diletakkan dalam kotak kardus dan disimpan pada suhu ruang. Nimfa-nimfa yang diletakkan oleh imago betina kutu putih tersebut dipelihara pada kabocha sampai menghasilkan kutu putih generasi ke dua yang selanjutnya digunakan sebagai vektor penularan PMWaV. Nimfa kutu putih generasi ke dua dibiarkan makan akuisisi pada tanaman nanas sumber PMWaV selama 72 jam, kemudian dibiarkan makan inokulasi pada planlet dalam botol kultur selama 7-14 hari. Jumlah planlet yang diinokulasi adalah sebanyak 10 botol kultur, masing-masing 3 planlet/botol. Jumlah kutu putih yang digunakan sebagai vektor adalah 10 individu/planlet.
Eliminasi PMWaV dengan Perlakuan Air Panas dan Ribavirin. Planlet yang telah diinokulasi PMWaV kemudian diberi perlakuan air panas atau ribavirin. Planlet terlebih dahulu diberi pre-treatment dalam penangas air (waterbath) pada suhu konstan 35°C selama 24 jam untuk mengurangi kejutan (shock) terhadap suhu panas yang diberikan selanjutnya. Segera setelah pre-treatment ini, suhu waterbath dinaikkan menjadi 58°C kemudian planlet dimasukkan ke waterbath selama 30-40 menit atau 56°C selama 30-60 menit. Selanjutnya planlet ditanam kembali pada media Murashige & Skoog (MS). Percobaan ini terdiri dari 6 taraf perlakuan suhu yaitu perlakuan air panas 35 ºC selama 24 jam; perlakuan 35 ºC selama 24 jam dilanjutkan dengan 56 ºC selama 30 menit; perlakuan 35 ºC selama 24 jam dilanjutkan 56 ºC selama 60 menit; perlakuan 35 ºC selama 24 jam 58 ºC selama 30 menit; perlakuan 35 ºC selama 24 jam dilanjutkan 58 ºC selama 40 menit; dan tanpa perlakuan panas sebagai kontrol negatif. Setiap perlakuan terdiri dari 3 botol kultur sebagai ulangan, dan masing-masing ulangan terdiri dari 4 planlet sehingga terdapat 72 unit percobaan.
Eliminasi PMWaV dengan perlakuan kimia dilakukan dengan cara penambahan 10 mg/l ribavirin dalam media MS. Ribavirin 10 mg dilarutkan dalam
aquades kemudian ditambahkan pada media MS yang masih cair dalam botol kultur dan ditutup rapat dengan plastik bening. Selanjutnya media+ ribavirin disimpan pada suhu ruang sampai media menjadi padat. Percobaan ini terdiri dari 3 macam perlakuan yaitu planlet terinfeksi PMWaVyang ditumbuhkan pada media ribavirin 10 mg/l, planlet terinfeksi PMWaV pada media MS tanpa ribavirin sebagai kontrol positif, dan planlet sehat pada media MS tanpa ribavirin sebagai kontrol negatif. Perlakuan ribavirin 10 mg/l terdiri dari 11 botol kultur sebagai ulangan, setiap ulangan terdiri dari 4 planlet, sedangkan kontrol positif dan kontrol negatif masing- masing dilakukan 1 ulangan yang terdiri dari 4 planlet. Sehingga jumlah planlet yang digunakan dalam percobaan ini adalah 52 planlet.
Eliminasi PMWaV dengan Perlakuan Air Panas dan Ribavirin pada Eksplan
Bahan Tanaman Nanas. Bahan tanaman yang digunakan untuk kultur jaringan adalah mahkota buah (crown) nanas cv Smooth Cayenne terinfeksi PMWaV yang diambil dari pertanaman nanas di Desa Bunihayu, Kecamatan Jalancagak, Kabupaten Subang, Provinsi Jawa Barat. Verifikasi infeksi PMWaV pada crown yang digunakan sebagai bahan kultur jaringan dilakukan dengan tissue blot immunoassay (TBIA) berdasarkan metode Hu et.al (1997). Sebagai kontrol negatif digunakan crown tanaman sehat. Eksplan yang digunakan untuk inisiasi kultur nanas yaitu tunas aksilar dan tunas apikal yang diambil dari crown.
Perlakuan Air Panas. Crown yang terinfeksi dan yang tidak terinfeksi PMWaV (kontrol negatif) diberi pre-treatment air panas 35 ºC selama 24 jam di dalam penangas air. Kemudian crown diberi perlakuan air panas. Perlakuanair panas terdiri dari empat taraf yaitu crown sakit dengan perlakuan air panas 56 °C selama 60 menit; crown sakit dengan perlakuan air panas 58°C selama 40 menit; crown sakit tanpa perlakuan pemanasan (kontrol positif); serta crown sehat tanpa perlakuan air panas (kontrol negatif). Setiap perlakuan diulang 3 kali, setiap ulangan terdiri dari 5 botol kultur dengan 10 eksplan/botol sehingga terdapat 150 unit percobaan. Peubah yang diamati adalah pertumbuhan eksplan.
Kultur Jaringan Nanas. Daun crown dilepaskan dari bonggol, kemudian bonggol direndam dalam larutan detergen selama 30 menit dan dibilas dengan air mengalir selama 30-60 menit. Mata tunas aksilar dan tunas apikal dari bonggo crown diambil dengan menggunakan scalpel dan langsung direndam dalam larutan fungisida dan bakterisida selama 30 menit, dan dibilas dengan aquades steril sebanyak 2 kali. Selanjutnya, mata tunas tersebut direndam dalam NaOCl 20% dan 10% masing- masing selama 5 menit, dan dibilas dengan aquades steril. Mata tunas tersebut kemudian ditanam pada media inisiasi yaitu media MS dasar yang terdiri dari larutan makro, larutan mikro A, larutan mikro B ditambah NAA 2 mg/l, BA 2 mg/l (Lampiran 1) dipelihara sampai 12 minggu, selanjutnya tunas dipindahtanam ke media B2N1 (Lampiran 2) untuk menginduksi pembentukan tunas dan akar.
Eliminasi PMWaV dengan Perlakuan Air Panas pada Bahan Stek
Penyiapan Bahan Tanaman. Bahan tanaman diambil dari tanaman nanas induk yang menunjukkan gejala penyakit layu (diverifikasi dengan TBIA) dan tanaman sehat sebagai kontrol negatif dari Kebun Percobaan PKBT Tajur II. Bahan stek yang digunakan adalah daun, batang, dan crown.
Eliminasi PMWaV dengan Perlakuan Air Panas. Perendaman bahan stek di dalam air panas dengan suhu 35°C selama 24 jam sebagai pre-treatment. Perlakuan terdiri dari dua macam yaitu perlakuan panas dan jenis stek. Perlakuan panas terdiri dari empat taraf yaitu perlakuan air panas 56 °C selama 60 menit pada tanaman sakit; perlakuan air panas 58°C 40 menit pada tanaman sakit; tanpa perlakuan air panas pada tanaman sakit (kontrol positif); serta tanpa perlakuan pemanasan pada tanaman sehat (kontrol negatif). Perlakuan kedua yaitu jenis stek, terdiri dari 3 taraf antara lain stek daun, stek batang, dan crown. Sehingga percobaan ini terdiri dari 12 kombinasi perlakuan. Setiap kombinasi perlakuan diulang 3 kali, setiap ulangan terdiri dari 10 unit percobaan sehingga terdapat 360 unit percobaan.
Penanaman Stek. Bahan stek daun diperoleh dengan cara pemotongan bagian dasar daun sampai mengenai jaringan meristem kulit batang dengan tunas lateral (Gambar 2a). Sedangkan stek batang didapatkan dengan cara memotong batang secara longitudinal menjadi 2 bagian potongan (Gambar 2b). Crown digunakan utuh, tanpa pemotongan karena crown masih sangat muda.
Gambar 2 Stek daun (a) dan stek batang (b) tanaman nanas
Media semai yang digunakan adalah sekam bakar. Sekam bakar dibasahi sampai basah kapasitas lapang untuk menjaga kelembaban kemudian sekam ditebar pada meja pesemaian seluas 1-2 m2 dengan ketebalan media tanam 10 cm. Semua bahan stek direndam dalam larutan fungisida dan bakterisida. Kemudian bahan stek ditanam pada media semai dengan jarak tanam 5 cm. Selama 2 minggu pertama penyemaian, meja semai disungkup plastik bening untuk mengurangi laju penguapan supaya stek tidak cepat mengering.
Bibit stek yang telah berumur 7 minggu dipindah tanam ke media tanam dalam polibag 15x25 cm. Media tanam yang digunakan adalah sekam bakar dan kompos (1:1). Bibit dipelihara sampai 4 minggu, dan dilakukan pengamatan jumlah daun yang tumbuh dan tinggi tanaman. Kemudian daun dipanen untuk deteksi PMWaV dengan TBIA.
Data daya tumbuh stek dan persentase infeksi PMWaV dianalisis dengan ANOVA program SAS versi 9.0. Apabila terdapat beda nyata di antara perlakuan maka dilakukan uji lanjut Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) ( =0,05).
Verifikasi Infeksi PMWaV dengan Tissue Blot Immunoassay (TBIA)
PMWaV pada tanaman dideteksi secara serologi dengan TBIA berdasarkan metode Hu et al. (1997). Daun dipotong melintang pada bagian dasar daun dengan
potongan yang rata. Potongan ini kemudian diblot pada 0,45 m Nitro ME nitrocellulose membrane (Amersham Pharmacia Biotec, USA) selama 60 detik. Pola jaringan pembuluh daun menempel dan meninggalkan jejak pada membran. Membran dapat disimpan kering di antara lipatan kertas saring pada suhu ruang sampai siap dianalisis.
Membran yang telah diblot ditempatkan dalam wadah plastik dan diblocking dengan 2% (wt/vol) susu skim yang dilarutkan dalam larutan penyangga phosphate buffer saline (PBS) ( 8g sodium chloride; 1,15g sodium phosphate dibasic; 0,2g potasium phosphate monobasic; 0,2g potasium chloride; 1000 ml aquades; pH 7,4) digoyang 50 rpm dengan rotary shaker selama 30 menit pada suhu ruang. Kemudian membran diinkubasikan dalam wadah plastik atau kantung plastik segel dengan antibodi monoklonal PMWaV (Agdia Inc., USA) dengan pengenceran 1:10 dalam PBS digoyang 50 rpm dengan rotary shaker pada suhu ruang selama 1-2 jam, atau diinkubasi pada suhu 4 ˚C selama satu malam. Kemudian membran dicuci dengan PBST (PBS + 0,05% Tween 20) digoyang 125 rpm selama 10 menit pada suhu ruang, pencucian diulang sebanyak 5 kali. Setelah pencucian, membran kemudian diinkubasikan dengan konjugate alkaline phosphatase (Shigma Chemical Co. St. Louise, USA) pada pengenceran 1:1000 dalam PBS selama 2-3 jam sambil digoyang 50 rpm pada suhu ruang. Membran kemudian dicuci seperti di atas, diwarnai dengan substrat 5-bromo-4-chloro-3-Indolyl Phosphate/Nitro Blue Tetrazolium (BCIP/NBT) (Shigma Chemical Co., USA) mengunakan satu tablet BCIP/NBT yang dilarutkan dalam 10 ml larutan penyangga Alkaline Phosphatase (AP). Pewarnaan dilakukan pada suhu ruang sampai terjadi perubahan warna pada membran. Reaksi pewarnaan dihentikan dengan mencuci membran dengan air mengalir kemudian dikeringanginkan.