Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2014 sampai dengan Mei 2015, di Laboratorium Bakteriologi Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Biologi Molekuler Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian Jakarta dan Laboratorium Bioteknologi Balai Uji Terap Teknik dan Metode Karantina Pertanian Bekasi.
Bahan
Bahan yang digunakan selama penelitian yaitu buah cabai yang bergejala antraknosa disebabkan oleh C. acutatum, daun jagung bergejala bulai yang disebabkan oleh P. sorghi, daun jeruk bergejala CVPD yang disebabkan oleh Ca. L. asiaticus diambil dari Kelurahan Situgede, Kecamatan Bogor Barat, Kota Bogor, dan daun kacang panjang yang bergejala mosaik yang disebabkan oleh BCMV diambil dari Desa Neglasari, Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor, bufer isolasi (Tris–HCl, pH 8.0; EDTA; NaCl; 1% Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (w/v), 1% 2-mercaptoethanol), etanol 70%, kloroform:isoamilalkohol (24/1 v/v), isopropanol, ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), sodium dodecyl sulphate (SDS), NaCl 5M, TE (Tris/EDTA), asam borat, Tris HCl pH 7, alkohol 90%, akuades, nuclease free water, PDB, kertas tisu, etidium bromida, agarosa, PDA, petri dish, bufer TAE 50X, primer kontrol internal (Rubisco L), primer C. acutatum, primer P. sorghi, primer Ca. L. asiaticus, primer spesifik BCMV, dream Taq green master mix PCR (Thermo Scientific), Whatman FTA®Plant Card, 0.1 M glycine; pH 9.0; 50 mM NaCl dan Triton X-100.
Penyiapan Patogen Tanaman untuk Isolasi Asam Nukleat dan Deteksi dengan PCR
Pengamatan dan dokumentasi gejala penyakit pada tanaman sasaran di lapangan dilakukan sebagai tahap awal identifikasi dan deteksi. Contoh yang diambil masing-masing tiga tanaman yang bergejala untuk setiap patogen dalam suatu lokasi pertanaman. Keempat penyakit tersebut yaitu bulai (P. sorghi) pada jagung, CVPD atau huanglongbing (Ca. L. asiaticus) pada jeruk, mosaik (BCMV) pada kacang panjang, dan antraknosa (C. acutatum) pada cabai.
Isolasi Asam Nukleat Beberapa Patogen Tanaman
Isolasi asam nukleat masing-masing patogen tanaman C. acutatum pada buah cabai dan isolat, P. sorghi pada daun jagung, Ca. L. asiaticus pada daun jeruk dan BCMV pada daun kacang panjang dilakukan dalam pendekatan berbeda yaitu secara konvensional, FTA-card dan kit komersial.
14
Isolasi Asam Nukleat Menggunakan Metode Konvensional
Isolasi asam nukleat secara konvensional berbeda-beda metodenya tergantung dari jenis patogennya, sumber contoh atau jaringan tanamannya.
Colletotrichum acutatum dari buah cabai dan Peronosclerospora sorghi dari
daun jagung. Isolasi DNA total C. acutatum dari buah cabai dan
Peronosclerospora sorghi dari daun jagung menggunakan metode yang dikembangkan oleh Warburton dan Hoisington (2001) yaitu sebagai berikut: Sebanyak 0.1 g contoh jaringan yang telah dipotong-potong halus direndam dengan nitrogen cair dalam mortar dan digerus dengan pistil hingga diperoleh bentuk tepung. Hasil gerusan dipindahkan ke tabung eppendorf 2 ml dan ditambahkan 400 µL bufer ekstraksi (1 M Tris pH 8, 5 M NaCl dan 0.5 M EDTA, CTAB 2%), 5 µL 2-mercaptoethanol v/v dan diinkubasi pada suhu 65 ºC selama 60 menit dalam waterbath. Suspensi dihomogenasi dengan dibolak-balik tiap 10 menit. Sebanyak 500 µL kloroform:isoamilalkohol (24:1, v/v) ditambahkan ke dalam suspensi, kemudian disentrifus pada kecepatan 3 500 rpm selama 20 menit pada suhu 4 ºC. Supernatan yang bening dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 1X volume isopropanol. Pelet DNA diendapkan dengan sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 20 menit. Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan etanol 70% dengan sentrifugasi 8 000 rpm selama 5 menit kemudian dikeringkan dan pelet DNA dilarutkan dalam bufer TE 1X 75 µL.
Colletotrichum acutatum dari isolat murni. Isolasi DNA C. acutatum dari biakan murni berumur 4 hari menggunakan metode yang dikembangkan oleh Abd-elsalam et al. (2003) dengan modifikasi minor sebagai berikut: Contoh berupa miselium dalam PDB sebanyak 250 mL, disaring dengan kertas saring hingga mendapatkan miselium sebanyak 0.1 g. Contoh digerus dengan nitrogen cair dalam mortar dan digerus dengan pistil. Hasil gerusan dipindahkan ke tabung eppendorf 1.5 mL dan dicuci dengan menambahkan 500 µL bufer Tris-EDTA (pH 8). Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 13 000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet ditambahkan 300 µL bufer ekstraksi (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 250 nM NaCl, 25 mM EDTA, dan 0.5% SDS) dan homogenasi dengan tangan selama 5 menit. Suspensi ditambahkan 150 µ L natrium asetat (CH3COONa) pH 5.2. Suspensi diinkubasi pada suhu 20 ºC selama 10 menit. Suspensi disentrifugasi pada 13 000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 ºC. Supernatan dimasukkan ke tabung baru dan ditambahkan isopropanol dengan volume yang sama, lalu disentrifugasi pada 13 000 rpm selama 10 menit, sehingga diperoleh pelet DNA. Pelet tersebut dicuci dengan 500 µL etanol 70%, disentrifus pada 8 000 rpm selama 5 menit, lalu dikeringanginkan pada suhu ruang. Selanjutnya pelet dilarutkan dalam 75 µ L bufer TE 1X kemudian simpan pada suhu -20 ºC.
Candidatus Liberibacter asiaticus dari tulang daun jeruk. Isolasi DNA total
Ca. L. asiaticus dari tulang daun jeruk menggunakan modifikasi metode Doyle dan Doyle (1990). Sebanyak 0.1 g tulang daun contoh digerus dengan nitrogen cair dalam mortar menggunakan pistil hingga menjadi tepung, lalu dimasukkan ke dalam tabung 2 mL. Selanjutnya masukkan 500 µL CTAB (2%), 5 µL
2-mercaptoethanol (1%), yang sudah dipanaskan 60 ºC selama 10 menit. Suspensi Ca. L. asiaticus dipanaskan pada suhu 60 ºC selama 60 menit dalam waterbath, dan dibolak-balikkan setiap 10 menit. Suspensi didiamkan selama 2-3 menit pada suhu ruang, kemudian ditambahkan 750 µL kloroform:isoamilalkohol (24:1, v/v). Suspensi digetar dengan vortek selama 3-5 menit, lalu disentrifugasi 12 000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 ºC. Supernatan dimasukkan ke tabung baru lalu dihitung volume, modifikasi dengan penambahan natrium asetat 3M pH 5.2 (1:10, v/v) dan isopropanol absolut (2:3, v/v) lalu dibolak-balik. Suspensi digetar selama 1 menit, lalu diinkubasi overnight pada -20 ºC, kemudian disentrifugasi 12 000 rpm selama 10 menit, supernatan yang diperoleh ditambahkan 500 µL etanol 80% dingin, lalu disentrifugasi 12 000 rpm selama 2 menit. Pelet dikering-anginkan pada suhu ruang, lalu diresuspensikan dengan bufer TE 1X 75 µL.
Bean common mosaic virus (BCMV) dari daun kacang panjang. Isolasi total asam nukleat BCMV dari daun kacang panjang menggunakan metode Doyle dan Doyle (1990). Sebanyak 0.1 g tulang daun contoh digerus dengan nitrogen cair dalam mortar menggunakan pistil hingga menjadi tepung, lalu dimasukkan ke dalam tabung 2 mL. Selanjutnya masukkan 500 µL CTAB (2%), 5 µL 2- mercaptoethanol (1%), yang sudah dipanaskan 60 ºC selama 10 menit. Suspensi dipanaskan pada suhu 65 ºC selama 60 menit dalam waterbath, dan dibolak-balikkan setiap 10 menit. Suspensi didiamkan selama 2-3 menit pada suhu ruang, kemudian ditambahkan 750 µ L kloroform:isoamilalkohol (24:1, v/v). Suspensi digetar selama 3-5 menit, lalu disentrifugasi 12 000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 ºC. Supernatan dimasukkan ke tabung baru lalu dihitung volume, lalu ditambahkan 600 µ L isopropanol. Contoh digetar selama 1 menit, lalu disentrifugasi 12 000 rpm selama 10 menit. Fase larutan bagian atas diambil dan ditambahkan 500 µL etanol 80% dingin, lalu disentrifugasi 8 000 rpm selama 15 menit. Pelet dikeringkan di suhu ruang, lalu diresuspensikan dengan bufer TE 1X 75 µL.
Isolasi Asam Nukleat dari Kit Komersial
Isolasi DNA total C. acutatum, P. sorghi dan Ca. L. asiaticus dari bagian tanaman yang bergejala menggunakan Kit Komersial XPrep Plant DNA Mini Kit (Phile Korea Technology/PKT) sesuai dengan protokol yang tersedia. Sebanyak 0.1 g contoh dimasukkan ke dalam mortar, digerus dengan nitrogen cair menggunakan pistil hingga menjadi tepung, lalu dimasukkan ke dalam tabung 2 mL. Sebanyak 400 µL XPPG1 dan 8 µL RNase A dimasukkan ke dalam tabung 2 mL tersebut, lalu digetar selama 1 menit, diinkubasi pada suhu 65 ºC selama 10 menit dalam waterbath, dan dibolak-balik setiap lima menit. Kemudian ditambahkan 200 µL elution buffer yang telah dipanaskan 65 ºC. Sebanyak 130 µL XPPG2 dimasukkan ke dalam suspensi tersebut, dan digetar selama 1 menit, lalu diinkubasi dalam lemari es selama 5 menit, kemudian dipindahkan ke kolom filter dalam 2 mL tabung koleksi dan disentrifugasi 13 000 rpm selama 3 menit pada suhu 4 ºC. Supernatan dipindahkan ke tabung ependorf 1.5 mL, ditambahkan XPPG3 1.5 kali volume supernatan, kemudian digetar selama 5 detik, selanjutnya suspensi dipindahkan ke dalam tabung kolom berfilter XPPG dalam tabung koleksi 2 mL, lalu disentrifugasi 13 000 rpm selama 2 menit pada suhu 4 ºC. Sisa suspensi dimasukkan ke dalam XPPG, kemudian disentrifugasi 13 000 rpm
16
selama 2 menit. Supernatan dibuang dan dimasukkan kembali XPPG ke dalam tabung 2 mL. Sebanyak 500 µL wash buffer1 dimasukkan ke dalam kolom XPPG, disentrifugasi 13 000 rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang dan ditambahkan kembali 750 µL wash buffer2 ke XPPG, kemudian disentrifugasi 13 000 rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang dan diulang sentrifugasi 13 000 rpm selama 3 menit. XPPG dipindahkan ke tabung 1.5 mL, kemudian ditambahkan 75 µ L elution buffer ke dalam XPPG dan diinkubasi di suhu ruang selama 3 menit. Contoh disentrifugasi 13 000 selama 2 menit untuk mendapatkan suspensi DNA.
Isolasi RNA total BCMV dari daun sakit menggunakan metode RNA XPrep Plant Total RNA Mini Kit (Phile Korea Technology/PKT) sesuai dengan protokol yang tersedia. Sebanyak 0.1 g dimasukkan ke dalam mortar, digerus dengan nitrogen cair menggunakan pistil hingga menjadi tepung, lalu dimasukkan ke dalam tabung 2 mL, dan ditambahkan 450 µL XPRB yang sudah ditambahkan 2-mercaptoethanol (1%). Suspensi dimasukkan ke tabung filter, dan disentrifugasi 12 000 rpm selama 2 menit, supernatan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 mL, lalu ditambahkan etanol 96% sebanyak 0.5 kali volume supernatan, dan dicampur menggunakan mikropipet. Suspensi dimasukkan ke dalam tabung berfilter XPPLR mini dalam tabung koleksi 2 mL, disentrifugasi 12 000 rpm selama 2 menit. Sisa suspensi disentrifugasi ulang 12 000 rpm selama 2 menit. Suspensi ditambahkan 500 µL wash buffer1, dan disentrifugasi 12 000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang, XPPLR mini dicuci kembali dengan 700 µL wash buffer2, suspensi disentrifugasi 12 000 rpm selama 1 menit, disentrifugasi kembali 12 000 rpm selama 3 menit. Supernatan dibuang dan XPPLR mini diletakkan ke tabung 1.5 mL. XPPLR mini ditambahkan 75 µ L bufer TE 1X, kemudian diamkan selama 1 menit. Contoh disentrifugasi 12 000 rpm selama 2 menit. Suspensi RNA disimpan di suhu -70 ºC.
Isolasi Asam Nukleat dari FTA-card
Metode standar. Bagian tanaman yang bergejala penyakit diambil
sebanyak 0.1 g dan dari biakan murni C. acutatum diambil berdiameter 3 cm. Contoh diletakkan di atas kertas FTA-card, ditutup dengan kertas penutup lalu digerus. Contoh daun dan isolat cendawan digerus menggunakan pinset sedangkan contoh tulang daun jeruk yang sudah dipisahkan dari daging daun ditekan dengan palu kecil pada bagian kertas penutup hingga contoh menempel pada kertas lalu sisa contoh tersebut dibuang dari card. Contoh pada FTA-card dikeringkan selama 60 menit lalu diletakkan di atas cutting mat, kemudian dipotong dengan diameter 2 mm menggunakan Harris Micro Punch, atau menggunakan scalpel yang tajam.
Contoh pada potongan FTA-card (punch) dimasukkan ke dalam tabung PCR 250 μL masing-masing sebanyak 1, 2, 3 punch, lalu ditambahkan 200 μL purification reagent, dan dibolak-balik sebanyak dua kali, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 4-5 menit. Reagen dan punch diaduk menggunakan mikropipet dengan cara menaik-turunkan sebanyak dua kali. Purification reagent dibuang sebanyak mungkin menggunakan mikropipet serta tinggalkan punch tetap di dalam tabung. Prosedur di atas diulangi satu kali lagi. Punch ditambahkan 200
μL bufer TE0.1 (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA), dan dibolak-balik sebanyak dua kali, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 4-5 menit. Reagen dan punch diaduk menggunakan mikropipet dengan cara menaikturunkan sebanyak dua kali.
Contoh diinkubasi dalam suhu ruang selama 4-5 menit. Bufer TE0.1 dibuang sebanyak mungkin menggunakan mikropipet serta tinggalkan punch tetap di dalam tabung. Prosedur di atas diulangi satu kali lagi. Punch dikeringanginkan pada suhu ruang selama 1 jam (dengan membuka penutup tabung PCR) atau dikeringkan di dalam oven bersuhu 56 °C selama 20 menit. Selanjutnya punch dapat digunakan untuk PCR atau disimpan pada suhu 4 °C atau 20 °C.
Metode isolasi yang dimodifikasi. Biakan murni cendawan C. acutatum
berumur 4 hari pada media PDA dengan diameter 3 cm diambil menggunakan tusuk gigi, lalu dimasukkan ke dalam tabung PCR yang berisi 25 µL bufer TE 1X (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA). Tabung PCR dengan tutup terbuka dimasukkan ke dalam microwave dengan daya 1100 Watt selama 1 menit, selanjutnya contoh dan bufer diaduk dengan menaik turunkan menggunakan mikropipet sebanyak dua kali. Pemanasan dengan microwave diulang satu kali (modifikasi metode Suzuki et al. 2006). Suspensi cendawan dalam tabung PCR tersebut diambil 5 µ L, lalu diteteskan pada FTA-card dan dikeringkan pada suhu ruang selama 10 menit. FTA-card dipotong menjadi berukuran diameter 2 mm (punch) menggunakan Harris Micro Punch, selanjutnya sebanyak 1, 2 dan 3 punch siap untuk dijadikan sebagai sumber cetakan dalam PCR.
Contoh dari daun yang bergejala Ca. L. asiaticus, P. sorghi dan buah dari C. acutatum sebanyak 0.1 g digerus dengan benda tumpul. Contoh daun dan isolat cendawan digerus menggunakan pinset besi putih sedangkan contoh tulang daun jeruk yang sudah dipisahkan dari daging daun ditekan dengan palu kecil pada bagian kertas penutup hingga contoh menempel pada kertas lalu sisa contoh tersebut dibuang dari FTA-card. Contoh pada FTA-card dikeringkan selama 60 menit lalu diletakkan di atas cutting mat, kemudian dipotong dengan diameter 2 mm menggunakan Harris Micro Punch, atau menggunakan scalpel yang tajam. Contoh pada potongan FTA-card (punch) dimasukkan ke dalam tabung PCR 250
μl masing-masing sebanyak 1, 2, 3 punch, lalu ditambahkan 200 μl purification reagent, dan dibolak-balik sebanyak dua kali, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 4-5 menit. Reagen dan punch diaduk menggunakan mikropipet dengan cara menaikturunkan sebanyak dua kali purification reagent dibuang sebanyak mungkin menggunakan mikropipet serta tinggalkan punch tetap di dalam tabung. Prosedur di atas diulangi satu kali lagi. Contoh ditambahkan 10 µL bufer TE0.1 ke dalam tabung PCR, dalam posisi tabung PCR terbuka contoh di microwave dengan daya 1100 watt selama 1 menit, selanjutnya bufer dan punch diaduk dengan menaikturunkan bufer menggunakan mikropipet sebanyak dua kali. Pemanasan dengan microwave diulang sekali lagi. Kertas punch dikeluarkan dan dikeringanginkan pada suhu ruang. Contoh siap digunakan dalam PCR.
Isolasi asam nukleat BCMV dari FTA-card dilakukan modifikasi sesuai dengan metode Alabi et al. (2008b). Contoh sebanyak 0.1 g digerus dengan benda tumpul. Contoh daun digerus menggunakan pinset besi putih pada bagian kertas penutup hingga contoh menempel pada kertas lalu sisa contoh tersebut dibuang dari FTA-card. Sap yang tertinggal di atas kertas FTA-card dikeringanginkan selama 60 menit. Contoh pada FTA-card diletakkan diatas cutting mat, kemudian dipotong dengan diameter 2 mm menggunakan Harris Micro Punch, atau menggunakan scalpel yang tajam. Contoh potongan FTA-card dimasukkan ke dalam tabung 250 µL masing-masing sebanyak 1, 2, 3 punch, lalu ditambahkan 25
18
µL bufer denaturasi (GES bufer: 0.1 M glycine; pH 9.0; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100) dan 2 µL 2-mercaptoethanol (1%). Contoh FTA-card diinkubasi di water bath pada suhu 95 ºC selama 10 menit dan segera didinginkan dalam lemari es selama 5 menit atau sampai digunakan dalam proses RT-PCR.
Pengukuran Asam Nukleat Hasil Isolasi
Konsentrasi asam nukleat total pada metode kit dan konvensional langsung diukur dari hasil isolasi asam nukleat. Asam nukleat yang melekat pada potongan (punch) FTA-card diameter 2 mm diresuspensi dengan bufer elusi 10 µ L yang sudah dipanaskan dengan suhu 65 ºC selama 10 menit dan bufer TE 1X untuk BCMV dalam tabung PCR. Setiap tabung PCR disentrifugasi kecepatan 13 000 rpm selama 3 menit agar asam nukleat keluar dari punch FTA-card tersuspensi ke dalam bufer tersebut. Cetakan DNA hasil isolasi diukur dengan meneteskan sebanyak 1 µ L suspensi ke atas UV-Vis nanodrop-spektrofotometer (Thermo Scientific) dan diulang sebanyak tiga kali.
Kemurnian asam nukleat dengan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang A260/A280 dianggap baik pada kisaran nilai 1.8-2.0. Jika nilai kemurnian kurang dari kisaran tersebut maka konsentrasi protein bawaan cukup tinggi, sedangkan jika lebih besar nilainya maka konsentrasi RNA bawaan cukup tinggi.
Jumlah berat asam nukleat total yang berhasil diisolasi dari FTA-card menggunakan metode standar dan modifikasi dihitung berdasarkan hasil kali konsentrasi asam nukleat (ng µL-1), volume suspensi yaitu 10 µ L dan luas kertas FTA yang berisi contoh dibagi dengan luas satu punch (3.14 mm2). Penghitungan konsentrasi asam nukleat dari metode konvensional dan kit berdasarkan hasil kali konsentrasi asam nukleat (ng µL-1) dengan volume larutan hasil resuspensi asam nukleat dari total volume 75 µL.
Analisis Statistika
Data konsentrasi dan total asam nukleat hasil isolasi dengan ketiga cara di atas untuk masing-masing patogen dilakukan analisis ragam (ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji perbedaan nilai tengah metode Tukey pada taraf nyata 5%. Perhitungan ANOVA dan uji Tukey tersebut dilakukan menggunakan program Minitab 16.
Deteksi Patogen Tanaman Menggunakan PCR dan RT-PCR
Deteksi secara molekuler untuk keempat patogen menggunakan teknik yang berbeda bergantung pada asam nukleat cetakannya yaitu PCR terhadap DNA asal C. acutatum, P. sorghi dan Ca. L. asiaticus dan RT-PCR untuk RNA asal BCMV. PCR atau RT-PCR untuk setiap patogen juga berbeda dalam hal primer spesifik patogen dan kondisi PCR yang digunakan. Untuk mendapatkan hasil deteksi PCR yang baik dilakukan optimasi dari beberapa komponen PCR di antaranya adalah konsentrasi primer.
PCR untuk C. acutatum, P. sorghi dan Ca. L. asiaticus
Proses PCR selanjutnya adalah amplifikasi DNA target dengan menentukan komposisi dari komponen PCR yaitu di antaranya pasangan primer spesifik dan pengaturan siklus amplifikasi DNA sesuai dengan target yang diinginkan (Tabel 1) dan komposisi volume reaktan standar amplifikasi PCR (Tabel 2).
RT-PCR untuk Bean common mosaic virus
Reaksi transkripsi balik PCR dengan dua tahap (tabung terpisah) yaitu tahap pertama 1.5 µL nuclease free water, 1 µL (10 µM µL-1) Primer BlC-cpr, dan 3 µ L RNA total dengan total volume 5.5 µL, dipanaskan di 65 ºC selama 5 menit, segera didinginkan. Tambahkan 2 µL bufer RT 5x, 0.5 µL dNTP 10 mM, 1 µL DTT (Dithiothreitol) 0.1 µM, 0.5 µL RNase inhibitor (Thermo Scientific) (40 U uL-1), 0.5 µL Reveraid Reverse Transcriptase (M-MuLV) (Thermo Scientific) (200 U µL-1) dengan total volume 10 µL dalam tabung mikro. Reagen RT diinkubasi pada suhu 42 ºC selama 1 jam. Hasil akhir reaksi transkripsi balik adalah produk cDNA (1 µL) yang digunakan pada tahap kedua yaitu amplifikasi cDNA. Pasangan primer, urutan nukleotida dan siklus PCR dapat dilihat pada tabel 1.
Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan mesin thermal cycle AB (Applied Biosystem) Veriti dengan komponen reaksi PCR untuk keempat patogen dapat dilihat pada tabel 2.
Optimasi PCR
Optimasi PCR dilakukan untuk mendapatkan PCR yang baik, di antaranya modifikasi konsentrasi komponen-komponen atau kondisi PCR dari metode yang diacu. Komponen PCR yang dioptimasi pada penelitian ini adalah konsentrasi primer target. Konsentrasi cetakan DNA atau RNA yang digunakan dalam optimasi adalah 15 ng µL-1. Khusus untuk optimasi metode FTA-card, cetakan DNA terlebih dahulu diteteskan pada punch FTA-card, untuk selanjutnya digunakan pada uji PCR. Untuk mengevaluasi keberhasilan isolasi asam nukleat patogen (kecuali P. sorghi) digunakan primer kontrol internal Rubisco L.
Optimasi dilakukan dengan tiga proses PCR. Proses pertama PCR menggunakan tanpa konsentrasi primer optimum dan cetakan DNA dari biakan murni cendawan atau tanaman yang bergejala dari contoh pertama. Tahap tersebut dilakukan untuk memastikan DNA keempat patogen bisa teramplifikasi. Proses kedua PCR menggunakan konsentrasi cetakan DNA 15 ng µL-1 dan beberapa konsentrasi primer 0.4, 0.6, 0.8 dan 1 µM untuk mendapatkan konsentrasi primer optimum. Proses ketiga PCR menggunakan salah satu konsentrasi primer yang optimum dengan konsentrasi cetakan DNA 15 ng µ L-1 dari biakan murni cendawan atau tanaman yang bergejala dari contoh kedua dan ketiga.
20
Tabel 1 Primer dan siklus PCR yang digunakan untuk deteksi keempat patogen Primer Urutan nukleotida (5’3’) dan siklus
PCR Amplikon dan target gen Sumber C. acutatum CaInt2 GGGGAAGCCTCTCGCGG ±500 pb Gen ITS1, 25/28S-rDNA Brown et al. 1996 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC [95 °C 5 min; 40X (95 °C 30 sec, 60 °C 30 sec, 72 °C 1 min); 72 °C 7 min, 4
˚C] P. sorghi PsUF CCAGCAACTCCAGTTATGGAA ±154 pb Gen Cytochrome oxidase 2 (COII) Rustiani et al. 2015a PsUR CATGTACAATGGTRCTTGGAA [94 °C 2 min; 30X (94 °C 30 sec, 56 °C 1 min, 72 °C 1 min); 72 °C 5 min, 4
˚C] Ca. L. asiaticus A2 TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT ±703 pb Gen protein rplKAJL-rpoB operon Hocquellet et al. 1999 J5 ACAAAAGCAGAAATAGCACGAAC AA [94 °C 2 min; 35X (94 °C 20 sec, 45 °C 30 sec, 68 °C 1.5 min); 68 °C 5 min, 4
˚C] BCMV BlC-CPf TCAGGAACTGGGCAGCCGCAAC ±850 pb Gen protein selubung (CP) Anggraini & Hidayat 2014 BlC-CPr CTGCGGGGAACCCATGCCAAG 35X [94 °C 2 min, 68 °C 1 min, 72 °C 1 min); 72 °C 10 min, 4 ˚C]
Kontrol internal Rubisco L RBCL F535 CTTTCCAAGGCCCGCCTCA ±171 pb Gen Ribulose biphosphate carboxylase oxygenase Nassuth et al. 2000 RBCL R705 CATCATCTTTGGTAAAATCAAGTC CA
Tabel 2 Reaktan standar PCR
Reaktan Volume (L) Konsentrasi akhir 2X Dream taq green (Thermo Scientific)
Primer Forward 10 M Reverse 10 M Rubisco Forward 10 M Reverse 10 M DNA cetakan
Air bebas nuklease
12.5 1.0 1.0 0.5 0.5 1.0 8.5 1x 0.4 M* 0.4 M* 0.2 M** 0.2 M** 15 ng µL-1 - Total volume 25
Ket. * Optimasi konsentrasi finalnya (0.4, 0.6, 0.8, 1.0 M)
Elektroforesis Gel Agarosa dan Visualisasi Asam Nukleat
Elektroforesis menggunakan agarosa 1.5%, dalam larutan penyangga TAE 1X, pada 50 V, 70 mA, selama 50 menit. Gel agarosa diwarnai dengan larutan EtBr 10% selama 30 menit. Elektroforesis DNA total hasil isolasi dari jaringan tanaman hanya dilakukan untuk penyakit huanglongbing dengan volume cetakan DNA 5 µL. Elektroforesis DNA amplikon PCR dan RT-PCR dilakukan dengan volume 5 µL dan 7.5 µL. Gel agarosa yang telah dibilas dengan akuades kemudian dipapar UV pada transiluminator Ultra-Lum untuk visualisasi DNA dan dokumentasi dengan kamera digital.
22
