Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Oktober 2008 sampai Januari 2009 di Laboratorium Biomolekuler, Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian.
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah benih caisin (Brassica
rappa L cv. group caisin) yang diambil dari tanaman terinfeksi TuMV di lapang.
Selain itu untuk melihat keberhasilan ketiga metode ekstraksi untuk mengekstraksi RNA total dari benih dengan jenis tanaman yang berbeda. maka digunakan benih
millet (Panicum miliaceum), dengan prosedur ekstraksi RNA total yang sama
dengan ekstraksi pada benih caisin.
Metode Penelitian
Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi RNA total dari benih caisin. Sampel benih uji dibedakan berdasarkan tahap perkembangannya yaitu benih dan kecambah dengan tiga macam umur perkecambahan yang berbeda, yaitu: 3, 5, dan 7 hari. Hal ini dilakukan karena virus yang berada di dalam benih umumnya memiliki kadar yang lebih rendah dibandingkan dengan setelah dikecambahkan (Albrechtsen 2006). Oleh karena itu perlakuan ini digunakan untuk melihat tingkat keberhasilan deteksi pada tahap perkembangan benih yang berbeda, dengan jumlah sampel yang sama.
Penyiapan Bahan
Benih. Sampel yang berupa benih sebanyak 1200 butir langsung digerus menggunakan nitrogen cair di dalam satu mortar. Selanjutnya sampel dipisahkan menjadi tiga bagian masing-masing terdiri atas enam ulangan. Sampel yang digunakan adalah 0,1 g untuk setiap ulangan.
Kecambah. Sebanyak 200 butir benih caisin disebar pada sebuah wadah plastik ukuran 20 x 30 cm diatas kertas tisu basah. Ekstraksi RNA total dilakukan pada saat kecambah berumur 3, 5, dan 7 hari. Untuk setiap umur kecambah
26
dilakukan ekstraksi sebanyak enam kali ulangan. menggunakan tiga macam metode ekstraksi yang berbeda.
Ekstraksi RNA total
Metode Wyllie. Metode ekstraksi dilakukan seperti diuraikan dalam
Albrechtsen (2006). Sampel jaringan tanaman sebanyak 0,1 g digerus dan ditambahkan 500 µl bufer ekstrak (TRIS-HCl 50 mM, pH 8.5, EDTA 10 mM, NaCl 200 mM) dan 500 µl fenol/kloroform/isoamilalkohol(PCI). Setelah dicampur hingga homogen larutan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13.000 xg. Supernatan dipisahkan, kemudian ditambahkan kloroform/isoamilalkohol (50:1) sebanyak 1 volume supernatan, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi 13.000 xg selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh ditambahkan 1 volume isoproponal, lalu diinkubasi pada suhu -20oC selama satu malam. Keesokan harinya dilakukan sentrifugasi 13.000 xg selama 3 menit, hingga terbentuk pelet. Pelet diresuspensi dengan penambahan 100 µl bufer TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM), 4 µl 5M NaCl, dan 250 µl etanol 96% kemudian diinkubasi di es selama 20 menit. Setelah sentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 13.000 xg pelet dikeringanginkan, kemudian dilarutkan dalam 50 µl air bebas RNase.
Metode Randles. Metode ekstraksi dilakukan seperti diuraikan dalam Hodgson et al. (1998). Sebanyak 0,1 g sampel jaringan tanaman digerus dan ditambahkan 800 µl bufer NETM (2 M NaCl, 100 mM sodium acetate, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH7.5], 0.25% [vol/vol] 2 mercaptoethanol), 40 μl 20%
(w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS), selanjutnya diinkubasi pada 25oC selama 30
menit. Setelah itu ditambahkan 750 μl PCI (25:24:1), dan disentrifugasi 10,000 ×g selama 15 menit. Supernatan ditambah dengan 1 volume isopropanol. Setelah disentrifugasi 11.000 xg selama 15 menit, pelet dicuci dengan etanol 70%, lalu dikeringanginkan. Setelah itu pelet dilarutkan dalam 50µl air bebas RNase.
RNeasy Plant mini kit (Qiagen, Germany). Sampel sebanyak 0,1 g digerus menggunakan nitrogen cair, lalu ditambahkan 450 µl bufer RLT/RLC yang mengandung 1% (v/v) 2-Merkaptoetanol. Setelah dipindahkan dalam sebuah tabung 1,5 ml, larutan diinkubasi selama 3 menit pada suhu 56oC. Kemudian larutan dipindahkan ke dalam Qiashredder spin column, dan disentrifugasi 14.000
27
rpm selama 2 menit. Setelah sentrifugasi, cairan akan melewati kolom dan terkumpul pada tabung koleksi dibawahnya. Cairan dipindahkan ke tabung 1,5 ml baru dan ke dalamnya ditambahkan etanol 96% sebanyak 0,5 volume cairan, lalu dicampur hingga merata dan dipindahkan ke dalam RNeasy spin column, untuk dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm selama 15 detik. Setelah selesai cairan yang melalui kolom dibuang dan 700µl Buffer RW1 dimasukkan lagi ke dalam RNeasy
spin column, dan disentrifugasi lagi pada 10.000 rpm selama 15 detik, cairan yang
melalui kolom lalu dibuang kembali.
Pada RNeasy spin column yang sama, ditambahkan 500 µl Bufer RPE dan disentrifugasi 10.000 rpm selama 15 detik, kemudian cairan yang melewati kolom dibuang. Untuk mengeringkan membran maka ditambahkan lagi 500µl bufer RPE dan disentrifugasi 10.000 rpm selama 2 menit, setelah itu tabung penampung cairan dibuang beserta isinya dan digantikan dengan tabung 1,5 ml yang baru dan ditambahkan 50µl air bebas RNase melalui RNeasy spin column yang sama untuk melarutkan RNA. Cairan yang terkumpul pada tabung 1,5 ml yang baru adalah RNA total yang akan digunakan untuk proses selanjutnya.
Kuantifikasi Hasil Ekstraksi RNA
Setelah proses ekstraksi, RNA diukur kemurnian dan konsentrasinya menggunakan spektrofotometer (Perkin Elmer, USA) pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pengukuran konsentrasi RNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dengan perhitungan 1 nilai absorbansi sama dengan 40 µg/ml. Kemurnian RNA diukur pada rasio A260/A280, karena protein diserap pada panjang gelombang 280 nm (Rapley & Heptinstall 1998)
Sintesis cDNA
RNA tanaman hasil ekstraksi kemudian digunakan sebagai cetakan untuk proses sintesis cDNA (complementary DNA) dalam total volume 10 µl dengan komposisi sebagai berikut: 1µl 10x bufer untuk M-MuLV (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl 3 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol pH 8.3 ), 0,2 µl 10 mM dNTP(s) (Novagen, Germany), 0,75µl 10µM Oligo d(T), 0,32µl 40U RNase OUT (Invitrogen, USA), 0,32µl 200 unit/µl M-MuLV reverse transcriptase (New England Biolabs Inc., Beverly, MA), 4,41 µl air bebas RNase dan 3µl RNA. Reaksi
28
kemudian diinkubasi dalam Thermal cycler (Thermo Hybaid, Germany) dengan program 25oC selama 5 menit, 37o C selama 90 menit, dan 70oC selama 15 menit.
Polymerase Chain Reaction
Setelah sintesis cDNA kemudian dilakukan amplifikasi DNA menggunakan
Go Taq green master mix (Promega, USA) dalam total volume 25 µl. Primer yang
digunakan adalah TuMV 8573F (5’-AGC TCC CTA GCA CAA GAA GG-3’) dan TuMV 9385R (5’-TCG AGC TAA GCA CAT GTC GG-3’) yang mengamplifikasi potongan gen NIb dan selubung protein dengan ukuran 800 bp (Gambar 2) (Nicolas & Laliberta 1992).
Gambar 2. Posisi primer TuMV 8573F dan TuMV 9385R pada bagian gen NIb dan gen selubung protein (CP) yang menghasilkan fragmen DNA sebesar 800 bp.
Sebagai kontrol internal digunakan primer nad5F (5’- GAT GCT TCT TGG GGC TTC TTG TT -3’) dan nad5R (5’- CTC CAG TCA CCA ACA TTG G -3’) yang mendeteksi mRNA dari bagian mitokondria tanaman dan menghasilkan produk PCR berukuran 181 bp (Gambar 3) (Menzel et al. 2002). Amplifikasi cDNA kemudian dilakukan dalam thermal cycler (Thermo Hybaid, Germany) dengan siklus 1 kali 95oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus 95oC selama 30 detik, 50oC selama 90 detik, 72oC selama 60 detik, dan terakhir adalah ekstensi 72oC selama 10 menit.
Poly (A)… C CPP N NIIbb N NIIaa V VPPgg 6 6 K K 2 2 C CII 6 6 K K 1 1 P P33 H HCC-- P P P11 PRROO 8573F 800 bpbp 9385R 131 1217 2591 3656 3812 5744 5903 6479 7208 8759 9622
29
nad5R nad5F
mRNA: Transkripsi dan splicing
DNA mitokondria :
Gambar 3. Skema lokasi primer kontrol internal (tanda panah) dalam gen nad5 pada mitokondria (Menzel et al. 2002).
Visualisasi Hasil Amplifikasi
Hasil amplifikasi kemudian divisualisasi menggunakan gel agarosa konsentrasi 1,5% dalam bufer TAE, menggunakan voltase 75 volt selama 65 menit, dan direndam dalam etidium bromida konsentrasi 10% selama 30 menit.
30