RIWAYAT HIDUP

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Jati Adiputra, SSi. Dilahirkan di Purworejo tanggal 5 Agustus 1976, sebagai anak keenam dari enam bersaudara, pasangan Bapak Parali Setiadi dan Ibu Sri Lestari. Penulis menikah dengan Primadani Kuliahsari pada tahun 2007.

Penulis menempuh pendidikan di SMU Charitas, Jakarta, lulus pada tahun 1994. Penulis melanjutkan ke pendidikan tinggi di Universitas Nasional Jakarta, Fakultas Biologi pada tahun 1994 -2001.

Pada Tahun 2005 penulis diterima sebagai Tenaga Pengendali Organisme Pengganggu Tumbuhan di Badan Karantina Pertanian. Sejak tahun tersebut penulis bekerja sebagai Tenaga Pengendali Organisme Pengganggu Tumbuhan di Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta.

Pada tahun 2007 penulis berkesempatan melanjutkan pendidikan ke Program Magister Sains pada Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Program Studi Entomologi dan Fitopatologi. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Badan Karantina Pertanian Departemen Pertanian.

DAFTAR ISI

Halaman DAFTAR TABEL ... x DAFTAR GAMBAR ... xi DAFTAR LAMPIRAN ... xii PENDAHULUAN ... 1 Latar Belakang ... 1 Tujuan ... 3 TINJAUAN PUSTAKA ... 4 Karakteristik Turnip mosaic virus ... 4 Morfologi dan biologi ... 4 Kisaran inang, gejala dan daerah sebar ... 6 Karakteristik caisin (Brassica rappa L cv. group caisin) ... 7 Deteksi Virus Tanaman menggunakan RT-PCR ... 8 BAHAN DAN METODE ... 11 Waktu dan Tempat Penelitian ... 11 Bahan Penelitian ... 11 Metode Penelitian ... 11 Penyiapan Bahan ... 11 Benih ... 11 Kecambah ... 11 Ekstraksi RNA Total ... 12 Metode Willey ... 12 Metode Randles ... 12 RNeasy plant mini kit (Qiagen, Germany) ... 12 Kuantifikasi Hasil Ekstraksi RNA... 13 Sintesis cDNA... 13

Polymerase chain reaction... 14 Visualisasi Hasil Amplifikasi ... 15 HASIL DAN PEMBAHASAN... 16 Hasil... 16 Kondisi Perkecambahan Benih ... 16 Kuantitas dan Kemurnian RNA Hasil Ekstraksi ... 16 Duplex RT-PCR Menggunakan Kontrol Internal ... 18 Deteksi TuMV pada Benih Caisin secara RT-PCR... 20 Pembahasan... 21 SIMPULAN DAN SARAN... 26

Simpulan... 26 Saran... 26 DAFTAR PUSTAKA ... 27

DAFTAR TABEL

Halaman 1 2 3

Konsentrasi (µg/ml) dan kemurnian RNA total caisin diukur menggunakan spektrofotometer... Konsentrasi (µg/ml) dan kemurnian RNA total benih millet

diukur menggunakan spektrofotometer ... Rekapitulasi hasil deteksi TuMV pada benih caisin menggunakan tiga metode ekstraksi yang berbeda...

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1 2 3 4 5 6

Diagram genom TuMV... Posisi primer TuMV 8573F dan TuMV 9385R pada bagian gen NIb dan gen selubung protein (CP) ... Skema lokasi primer kontrol internal dalam gen nad5 pada mitokondria ... Pertumbuhan kecambah caisin ... Visualisasi hasil deteksi TuMV pada benih caisin menggunakan tiga metode ekstraksi RNA yang berbeda ... Hasil amplifikasi kontrol internal menggunakan primer nad5F dan nad5R pada kecambah millet berumur 3 hari dengan tiga metode ekstraksi RNA ...

4 14 15 16 19 20

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1

Data kemurnian dan konsentrasi (µg/ml) masing-masing metode ektraksi RNA pada stadia perkembangan benih caisin yang berbeda ... Data kemurnian dan konsentrasi (µg/ml) masing-masing metode ektraksi RNA pada stadia perkembangan benih millet

yang berbeda ...

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Turnip mosaic virus (TuMV; Potyvirus) merupakan virus terpenting kedua

yang menginfeksi pertanaman sayur-sayuran (CABI 2007). Virus ini umumnya menyerang tanaman dari famili Brassicaceae, namun dapat pula menginfeksi jenis- jenis tanaman dari famili yang lain (Noad 2004). Selain menyebabkan penurunan hasil, TuMV juga mempengaruhi kualitas produk yang dihasilkan dari tanaman yang terinfeksi (CABI 2007).

Jenis virus ini tersebar secara luas di beberapa negara (Stavolone et al. 1998), termasuk Indonesia. Rusli et al. (2007) melaporkan bahwa tanaman-tanaman sawi hijau dan lobak di Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, dan Bali telah terinfeksi oleh TuMV. Meskipun demikian berdasarkan Keputusan Menteri Pertanian nomor 38 tahun 2006, TuMV masih dikategorikan sebagai organisme pengganggu tumbuhan karantina (OPTK) A1 yang perlu dicegah pemasukkannya ke wilayah Indonesia melalui beberapa jenis media pembawa termasuk diantaranya adalah benih. Berdasarkan hal tersebut tersedianya metode deteksi yang dapat dipercaya mutlak diperlukan, mengingat Indonesia hingga saat ini masih melakukan impor beberapa jenis benih tanaman sayuran seperti kubis, sawi, caisin, dan brokoli dari negara-negara yang dilaporkan merupakan daerah endemik TuMV.

Metode deteksi TuMV yang dilakukan oleh lembaga Karantina Pertanian Indonesia, terutama Balai Besar Uji Standar (BBUSKP), saat ini didasarkan pada metode deteksi benih yang telah dikecambahkan menggunakan teknik Enzyme

linked immunosorbent assay (ELISA) dan reverse transcription polymerase chain

reaction (RT-PCR). Deteksi secara ELISA didasarkan pada penggunaan antibodi

yang didapatkan dari hewan untuk mengenali protein virus. Metode ini telah lama digunakan untuk pengujian virus tanaman karena kemudahan dan sensitivitasnya yang cukup baik. Meskipun demikian metode ini mempunyai kelemahan yaitu, kemungkinan terjadinya reaksi silang dengan protein tanaman (Webster et al. 2004). Teknik RT-PCR didasarkan pada pendeteksian RNA virus. Teknik ini memiliki keunggulan dibandingkan dengan ELISA karena memiliki spesifitas dan sensitivitas yang lebih baik (Henson & French 1993). Berdasarkan laporan

BBUSKP tahun 2008, dari sekitar 60 sampel komoditi sayur-sayuran yang diuji menggunakan metode ELISA dan RT-PCR, terdapat 8 sampel benih sayur-sayuran yang terdeteksi TuMV menggunakan RT-PCR. Sedangkan menggunakan metode ELISA, TuMV hanya dapat terdeteksi pada 1 sampel benih caisin (data tidak dipublikasikan).

Di balik keunggulannya metode RT-PCR juga memiliki beberapa kekurangan diantaranya adalah keberadaan senyawa inhibitor pada ekstrak RNA total tanaman yang dapat mempengaruhi proses amplifikasi DNA target (Narayanasamy 2008). Oleh karena itu pemilihan metode ekstraksi RNA yang tepat sangat berpengaruh terhadap keberhasilan deteksi RNA virus pada jaringan tanaman.

Metode ekstraksi RNA yang sering digunakan oleh BBUSKP adalah mengikuti prosedur kit-kit ekstraksi RNA komersial yang digunakan untuk melakukan ekstraksi RNA total pada benih yang telah dikecambahkan. Penggunaan kit-kit ekstraksi komersial ini sangat praktis tetapi umumnya metode ini lebih banyak disarankan untuk ekstraksi RNA asal jaringan daun atau kecambah. Untuk mempersingkat waktu dan meningkatkan tingkat keberhasilan deteksi, maka perlu dilakukan upaya deteksi pada benih tanaman tanpa dikecambahkan terlebih dahulu. Reeves (1998) menyatakan bahwa material benih mengandung senyawa (inhibitor) yang dapat menghambat kerja enzim Taq Polymerase, pada level yang dapat menurunkan sensitivitas deteksi.

Beberapa bahan kimia dapat digunakan untuk mengeliminasi inhibitor, serta memulihkan RNA dalam proses PCR, salah satunya adalah fenol (Merante et al. 1996). Wyllie et al (1993) dalam Alberchtsen (2006) melakukan ekstraksi RNA untuk mendeteksi cucumber mosaic virus (CMV) pada benih lupin (Lupinus

angustifolius) menggunakan Fenol/kloroform untuk memisahkan RNA dari

inhibitor-inhibitor PCR. Hasilnya metode ini ternyata dapat digunakan untuk mendeteksi satu benih lupin yang terinfeksi CMV dari 2.000 benih lupin sehat. Bahan yang sama, digunakan oleh Hodgson et al.(1998) untuk melakukan ekstraksi

RNA Coconut tinangaja viroid (CTiVd) dari jaringan tanaman kelapa, dengan

Hingga saat ini Badan Karantina Pertanian belum pernah melakukan evaluasi metode preparasi RNA total dari benih Brassica untuk keperluan deteksi TuMV. Berdasarkan hal tersebut, maka perlu dilakukan evaluasi metode ekstraksi RNA dan deteksi untuk mengetahui tingkat keberhasilan yang terbaik dalam mendeteksi virus terbawa benih.

Tujuan Penelitian

Penelitian dilakukan untuk mengevaluasi tingkat keberhasilan tiga metode ekstraksi RNA total untuk mendeteksi TuMV dari benih Brassica sp. dengan RT- PCR. Ketiga metode ekstraksi tersebut adalah metode Randles, Willey dan RNeasy plant mini kit

TINJAUAN PUSTAKA

Karakteristik Turnip mosaic virus

Morfologi dan Biologi

Turnip mosaic virus termasuk ke dalam famili Potyviridae (CABI

2007).Virus ini mempunyai partikel berbentuk filamen dengan panjang 720 nm dan berdiameter 12 sampai 15 nm. Genom virus ini terdiri dari RNA utas tunggal berorientasi positif dengan panjang nukleotida 9834 nukleotida (APS 1997; Tomlinson & Walkey 1967, diacu dalam CABI 2007). Genom TuMV terdiri atas

open reading frame (ORF) tunggal sepanjang 9489 basa, sedangkan daerah yang

tidak mengkode asam amino (non coding region-NCR) sepanjang 129 nukleotida Genom TuMV mengkode polyprotein besar sebanyak 3863 asam amino yang kemudian diproses secara proteolitik menjadi delapan macam protein oleh tiga proteinase, yaitu: protein N-terminal (P1), helper component-proteinase (HC-Pro),

nuclear inclusion a protein(NIa-pro) Protein virus lain diantaranya adalah:

cytoplasmic inclusion protein (CI), genome-linked protein (VPg), protein nuclear

inclusion b (NIb), coat protein (CP) (Mahajan et al. 1996, diacu dalam Firdaus

2005; Nicolas & Laliberte 1992). Revers et al. (1999) melaporkan bahwa beberapa protein seperti: P1, HC-Pro, CI, NIa, Nib, dan CP berperan dalam replikasi RNA virus. Sedangkan protein P3 virus TuMV berperan penting dalam siklus infeksi dan penentuan kisaran inang (Gambar1) (Suehiro et al. 2004).

Gambar 1. Diagram genom TuMV, menunjukkan potongan-potongan fragmen yang disintesis. 5’UTR = 5’-untranslated region; P1 = protein 1; HC- Pro = helper component proteinase; P3 = protein 3; 6K1 = peptida 1; CI = cylindrical inclusion protein; 6K2 = peptida 2; VPg = viral

genome-linked protein; NIa = nuclear inclusion a (proteinase); NIb =

nuclear inclusion b (viral replicase); CP = coat protein; 3’UTR = 3’-

untranslated region. Poly (A)… C CPP N NIIbb N NIIaa V VPPgg 6 6 K K 2 2 C CII 6 6 K K 1 1 P P33 H HCC-- P P P11 PRROO 5’UTR 131 1217 2591 3656 3812 5744 5903 6479 7208 8759 9622 3’UTR

Virus TuMV dapat ditularkan oleh lebih dari 40 jenis kutudaun secara non- persisten, virus dapat bertahan pada kutudaun selama 4 jam setelah akuisisi, seringkali kurang dari waktu tersebut (Noad 2004, APS 1997). Wang dan Pirone (1999) melaporkan bahwa protein HC-Pro berperan sangat besar dalam penularan

Potyvirus melalui kutudaun, selain itu protein ini juga menentukan dalam spesifitas

kutudaun yang menjadi vektor untuk masing-masing jenis Potyvirus. Selain ditularkan dengan kutudaun virus ini juga dapat ditularkan melalui perbanyakan vegetatif pada tanaman-tanaman jenis Brassica yang mengandung TuMV (CABI 2007).

Hingga saat ini belum banyak laporan yang menerangkan mengenai penularan TuMV melalui benih. Namun Kartiningtyas dan Hidayat (2006) melaporkan terdeteksinya TuMV pada benih-benih caisin lokal dari daerah Jawa Barat dan Jawa Tengah dengan teknik ELISA. Berdasarkan hasil deteksi tersebut diketahui tingkat infeksi TuMV pada benih berkisar antara 2 sampai 15%. Hasil ini menunjukkan bahwa TuMV adalah virus yang terbawa benih. Jenis-jenis virus yang sebelumnya dikenal tidak ditularkan melalui benih, mungkin terbawa benih pada persentase yang rendah di dalam inangnya (Agarwal & Sinclair 1996).

Virus pada umumnya terbawa benih pada bagian embrio. Infeksi dari bagian lain pada saat perkembangan benih mungkin terjadi, karena sebagian besar virus bergerak dari sel satu ke sel lainnya melalui sitoplasma (Agarwal & Sinclair 1996; Khan & Djikstra 2002). Virus-virus yang ditransmisikan melalui embrio dapat mengalami keadaan inaktif pada bagian di luar embrio, seperti pada testa dan endosperma. Infeksi pada kedua lokasi dalam benih tersebut dapat terjadi baik melalui infeksi embrio maupun tidak melalui embrio. Sebagai contoh, benih kacang polong yang terinfeksi Pea seed-borne mosaic potyvirus (PSbMV) dengan tingkat infeksi hingga 50%, mengandung virus-virus yang inaktif pada kulit benih, tetapi dapat terdeteksi menggunakan metode deteksi ELISA ataupun metode deteksi asam nukleat. Sedangkan kandungan virus yang dapat ditransimisikan melalui benih sebenarnya hanya 2 sampai 3% (Albrechtsen 2006).

Kisaran Inang, Gejala dan Daerah Sebar

Turnip mosaic virus mempunyai kisaran inang yang cukup luas. Sebanyak

318 jenis tanaman dalam 156 marga dari 43 famili merupakan inang dari jenis virus ini (Edwardson & Christie 1991, diacu dalam CABI 2007). Selain itu TuMV juga menyerang beberapa jenis gulma (Keinath 2005). Berdasarkan hasil penelitian Rusli et al. (2007) diketahui kisaran inang TuMV meliputi famili Brasicaceae (sawi putih, sawi hijau, kubis, lobak, caisin, brokoli dan pak coy), famili Solanaceae

(Nicotiana tabacum, N. benthamiana, dan N. glutinosa) serta famili

Chenopodiaceae (Chenopodium amaranticolor). Virus ini dapat ditularkan secara mekanik ke banyak jenis tanaman dan menghasilkan gejala mosaik sistemik yang bervariasi (Lin & Lian 1983). Berdasarkan CABI (2007) TuMV menginfeksi semua bagian tanaman kecuali akar. Tahap perkembangan tanaman yang diserang juga bervariasi mulai dari tahap pembungaan, pembuahan, perkecambahan dan perkembangan vegetatif.

Tanaman yang terinfeksi TuMV memperlihatkan gejala yang bervariasi tergantung pada jenis dan kultivar tanaman yang diserang (Lin & Lian 1993). Gejala awal pada bibit Brassica yang diinokulasi dengan TuMV adalah bercak klorotik, dan mottling pada daun diikuti dengan gejala vein clearing sistemik, mosaik dan/atau nekrosis, distorsi daun, serta seringkali kerdil (CABI 2007). Pada bibit selada virus ini dapat menyebabkan kerdil yang parah, hingga menyebabkan kematian (APS 1997). Pada Hibiscus esculentus gejala yang tampak adalah klorosis, pemucatan tulang daun diikuti dengan nekrosis, dan lambatnya pertumbuhan (Gera et al. 2001). Pada Nicotiana glutinosa dan N. rustica gejala yang terlihat adalah cincin klorotik dan mottle pada daun (Lin & Lian 1993).

Virus ini memiliki daerah sebar yang cukup luas di beberapa negara di dunia. Di Eropa, Asia dan Australia virus ini memiliki sebaran yang hampir merata di seluruh wilayah. Di Afrika virus in hanya terbatas di Kenya, Maroko, dan Afrika Selatan. Di Amerika bagian utara virus ini tersebar luas di Amerika Serikat dan Kanada, sedangkan di bagian benua Amerika lainnya TuMV hanya endemis di Argentina serta di Trinidad dan Tobago (CABI 2007).

Di Indonesia TuMV telah menyerang daerah pertanaman sayur-sayuran seperti lobak, caisin dan sawi di daerah Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur dan

Bali, dengan intensitas serangan yang bervariasi pada ketinggian lokasi yang berbeda (Rusli et al. 2007).

Sifat Umum Caisin (Brassica rappa L cv. group caisin)

Caisin merupakan jenis tanaman sayur-sayuran yang termasuk dalam famili Brasicaceae dan merupakan grup kultivar dari jenis Brassica rapa. Dalam beberapa literatur, B. rapa seringkali disebut dengan B. campestris, namun baru-baru ini telah dibuktikan dan ditetapkan bahwa B. rapa adalah nama yang seharusnya digunakan (Dixon 2007; Siemonsma & Piluek 1994). Tanaman ini merupakan jenis tanaman yang umum dibudidayakan di negara-negara di Asia. Dimulai dari daerah Cina bagian tengah kemudian kultivasi caisin menyebar ke wilayah Cina lainnya hingga ke Asia Tenggara seperti Thailand, Malaysia, Vietnam, Indonesia dan negara-negara Indo-China lainnya, bahkan India Barat (Dixon 2007).

Caisin adalah tanaman herba annual dengan akar utama yang kuat dan berbentuk tabung, serta tangkai yang bercabang dan berdiri tegak dengan ketinggian 20 sampai 60 cm. Daun umumnya berwana hijau terang dan menjepit tangkai, dengan bulu-bulu halus, daun bagian bawah berlekuk, biasanya dengan cuping dan petiola pada bagian apikal. Bunga berukuran kecil dengan panjang maksimal 1 cm, sepal menyebar. Buah memiliki panjang 4 sampai 10 cm. biji berdiameter 1 sampai 1,5 mm, berwarna coklat tua dengan retikulum yang jelas (CABI 2007; Siemonsma & Piluek 1994).

Menurut Siemonsma dan Piluek (1994) benih caisin (Brassica rapa L. cv. Group caisin) dan sawi putih (Brassica rapa L. cv. Group chinese cabbage) berkecambah setelah 3 sampai 5 hari pada temperatur 20 sampai 25oC. Secara umum B. rapa adalah tanaman dengan pertumbuhan yang cepat, dapat dipanen 6 sampai 15 minggu setelah penebaran benih, tergantung pada varietas tanaman dan musim. Di daerah tropis tanaman ini hanya cocok untuk kultivasi pada ketinggian di atas 800 m.dpl. (CABI 2007).

Beberapa jenis penyakit penting yang menyerang marga Brassica diantaranya adalah busuk lunak (Erwinia carotovora), embun tepung (Peronospora parasitica), TuMV, akar gada (Plasmodiophora brassicae), bercak alternaria (Alternaria brassicae), dan busuk sclerotinia (Siemonsma & Piluek 1994). Setiap

individu tanaman Brassica mempunyai nilai ekonomi yang tinggi. Kerusakan akibat penyakit meskipun dengan persentase yang rendah akan mempengaruhi hasil dan pendapatan secara ekonomi. Sedikit saja mengalami cacat pada hasil maka akan menyebabkan produk tersebut tidak dapat diterima pasar dan menjadi tidak lagi memiliki nilai. Oleh karena itu teknik pengendalian yang tepat perlu diterapkan dalam melakukan pengendalian penyakit Brassica dan penggunaan benih yang sehat sangat mutlak diperlukan (Dixon 2007; Siemonsma & Piluek 1994).

Deteksi Virus Tanaman Menggunakan RT-PCR

Deteksi virus menggunakan teknik PCR sangat populer digunakan karena prosedurnya sangat sensitif, relatif tidak mahal dan tidak memerlukan kemampuan teknis yang tinggi. PCR dapat digunakan untuk memperbanyak potongan DNA target hanya dalam waktu beberapa jam, bahkan dengan cetakan DNA dalam jumlah yang sangat kecil (Albrechtsen 2006). Untuk memperbanyak DNA target yang diinginkan, dibutuhkan sepasang primer (oligonukleotida) baik spesifik untuk jenis maupun strain tertentu maupun umum untuk beberapa jenis patogen. Potongan DNA target, kemudian diperbanyak pada tiga skala temperatur yang berbeda untuk (i) mendenaturasi DNA target menjadi untai tunggal, (ii) melekatkan primer sesuai dengan pasangannya pada cetakan DNA target, dan (iii) melakukan ekstensi primer dengan bantuan enzim polimerase DNA (Narayanasamy 2008).

Karena enzim polimerase hanya dapat bekerja pada DNA, maka untuk deteksi virus dengan materi genetik RNA digunakan teknik modifikasi PCR yang disebut reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Pada metode ini, sebelum amplifikasi DNA, terlebih dahulu harus dilakukan sintesis cDNA melalui proses transkripsi balik (Reverse transcription) menggunakan enzim

reverse trancriptase (Webster et al 2004).

Teknik RT-PCR mempunyai sensitivitas yang lebh tinggi dalam mendeteksi virus tanaman dibandingkan dengan teknik serologi. Hasil deteksi terhadap empat jenis virus tanaman apel menunjukkan bahwa RT-PCR mendeteksi 8,6% lebih banyak sampel yang positif dibandingkan menggunakan ELISA (Calayani et al.

2006). Sensitivitas RT-PCR untuk mendeteksi virus tanaman juga terlihat dari hasil penelitian Sipahioglu (2005) yang melakukan deteksi Prunus necrotic ringspot

virus pada jaringan daun dengan hasil yang cukup baik pada pengenceran hingga

1/2560. Meskipun demikian proses penangkapan antigen virus oleh antibodi seperti yang dilakukan pada ELISA dapat digunakan untuk proses penyiapan cetakan RNA virus pada deteksi menggunakan RT-PCR. Modifikasi ini disebut dengan

Immunocapture RT-PCR (IC-RT-PCR). Pada metode ini partikel ditangkap oleh

antibodi yang sesuai dengan virus target pada dinding tabung PCR. Setelah itu dilakukan proses pelepasan RNA virus dari selubung protein virus, lalu dilakukan diamplifikasi menggunakan RT-PCR. (Webster et al. 2004).

Disamping kelebihan-kelebihan di atas teknik RT-PCR masih memiliki kelemahan, seperti keberadaaan inhibitor pada RNA yang telah diekstraksi dari jaringan tanaman. Menurut Arnal et al. (1999) dua parameter harus diperhatikan ketika memilih metode ekstraksi yaitu tertangkapnya materi virus dan eliminasi atau inaktivasi senyawa inhibitor. Secara lebih spesifik senyawa inhibitor PCR diantaranya adalah bahan-bahan fenolik, protein maupun polisakarida. Tipe, lokasi dan konsentrasi dari inhibitor-inhibitor ini dapat bervariasi tergantung pada umur tanaman dan kultivar. Sebagai contoh polisakarida dapat meningkat pada daun muda dari beberapa kultivar kacang-kacangan (Dietzgen 2002).

Beberapa senyawa organik dapat digunakan untuk memisahkan RNA dari protein, dan dengan mengeksploitasi perbedaan dalam hidrofobisitas antara RNA dan protein, keduanya dapat dipisahkan dengan membuat dua fase yang berbeda. Reagen yang umum digunakan untuk tujuan ini adalah fenol. Setelah pemisahan menjadi dua fase, RNA akan tetap berada di fase atas, sementara lapisan protein akan berada dalam fase fenol atau pada bagian interfase (Macfarlane & Dahle 1998). Fenol merupakan senyawa yang telah lama dikenal sebagai pemisah protein dan perusak integritas sel secara cepat. Fenol yang digunakan bersama dengan kloroform akan dapat secara simultan menghilangkan protein dan lipid dari larutan yang mengandung asam nukleat (Merante et al. 1996). Fenol memang merupakan bahan yang banyak digunakan dalam proses ekstraksi RNA, tetapi reagen ini sangat berbahaya dan dapat memberikan luka serius pada kulit . Oleh karena itu penggunaannya dilakukan sangat hati-hati ((Macfarlane & Dahle 1998).

Keberadaan SDS dan garam dalam konsentrasi yang sangat rendah dapat membantu meningkatkan efisiensi pemisahan RNA dan protein pada fase yang

berbeda. Selain itu penambahan EDTA juga dilakukan untuk menghambat pembentukkan kumpulan protein serta mengikat Mg2+ sehingga dapat menghambat kerja enzim nuklease yang membutuhkan Mg (Merante et al. 1996).

Sejalan dengan perkembangan teknologi, saat ini juga telah banyak bermunculan kit-kit ekstraksi komersial yang menggunakan teknologi yang lebih maju seperti membran silika, dan glass bead. Metode-metode tersebut menawarkan kemudahan dan hasil dengan kemurnian yang lebih baik, namun kegunaannya pada umumnya terbatas hanya pada jaringan-jaringan tertentu saja (Albrechtsen 2006). Li et al. (2008) melaporkan bahwa ekstraksi RNA menggunakan RNeasy plant mini kit dengan teknik membran silika ternyata tidak dapat digunakan untuk melakuan ekstraksi RNA dari jaringan tanaman tertentu.

Hasil positif pada suatu deteksi dan keberadaan total RNA melalui visualisasi pada gel agarosa umumnya digunakan sebagai indikator untuk melihat keberhasilan suatu proses ekstraksi RNA. Meskipun demikian terdapat cara lain yang dapat digunakan unuk mendeteksi keberhasilan suatu ekstraksi RNA dari jaringan tanaman, yaitu dengan menggunakan kontrol internal. Menurut Gambino dan Gribaudo (2006) kontrol internal RNA sangat penting untuk mendeteksi adanya kesalahan hasil negatif karena degradasi RNA selama proses ekstraksi atau keberadaan inhibitor pada proses transkripsi balik dan PCR. Pada penelitiannya untuk mendeteksi dua jenis virus pada tanaman anggrek, Lee dan Chang (2006) menggunakan multiplex RT-PCR dengan primer nad5f dan nad5r dari mRNA tanaman sebagai kontrol internal. Hasilnya menunjukkan bahwa kontrol internal tersebut dapat digunakan untuk menghindari terjadinya kesalahan negatif akibat kegagalan ekstraksi RNA total dari jaringan tanaman.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Oktober 2008 sampai Januari 2009 di Laboratorium Biomolekuler, Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian.

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah benih caisin (Brassica

rappa L cv. group caisin) yang diambil dari tanaman terinfeksi TuMV di lapang.

Selain itu untuk melihat keberhasilan ketiga metode ekstraksi untuk mengekstraksi RNA total dari benih dengan jenis tanaman yang berbeda. maka digunakan benih

millet (Panicum miliaceum), dengan prosedur ekstraksi RNA total yang sama

dengan ekstraksi pada benih caisin.

Metode Penelitian

Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi RNA total dari benih caisin. Sampel benih uji dibedakan berdasarkan tahap perkembangannya yaitu benih dan kecambah dengan tiga macam umur perkecambahan yang berbeda, yaitu: 3, 5, dan 7 hari. Hal ini dilakukan karena virus yang berada di dalam benih umumnya memiliki kadar yang lebih rendah dibandingkan dengan setelah dikecambahkan (Albrechtsen 2006). Oleh karena itu perlakuan ini digunakan untuk melihat tingkat keberhasilan deteksi pada tahap perkembangan benih yang berbeda, dengan jumlah sampel yang sama.

Penyiapan Bahan

Benih. Sampel yang berupa benih sebanyak 1200 butir langsung digerus menggunakan nitrogen cair di dalam satu mortar. Selanjutnya sampel dipisahkan menjadi tiga bagian masing-masing terdiri atas enam ulangan. Sampel yang digunakan adalah 0,1 g untuk setiap ulangan.

Dalam dokumen Evaluasi tiga metode preparasi rna total untuk deteksi TuMV pada benih Brassica sp. dengan reverse transcription polymerase chain reaction (Halaman 68-106)