Alat dan Bahan
Alat yang digunakan meliputi gunting, pinset, tusuk sate, cawan Petri, cawan reaksi, neraca analitik, tabung reaksi, gelas ukur, gelas piala, inkubator, mesin autoklaf,
shacker, bunsen, labu Erlenmeyer, pipet tetes, pipet mikro, tabung Eppendorf, kapas, PCR- plate. Selain itu juga digunakan perangkat seperti laminar air flow cabinet,
elektroforesis, PCR (DNA engine tetrad2 MJ research), oven microwave (sanyo), kulkas, Chemidoc UV-illuminator Bio-Rad.
Bahan-bahan yang digunakan dalam isolasi bakteri Xoo adalah etanol 70% dan 95%, daun terserang HDB dari 3 wilayah (Jawa Barat, Kalimantan Barat, Sumatera Barat), air steril, dan media tumbuh Wakimoto (sukrosa, pepton, Ca(NO3)24H2O, Na2HPO47H2O, FeSO47H2O, bakto agar, dalam destilat H2O). Uji karakter patogenitas menggunakan padi varietas isogenik (IRBB-1, IRBB-2, IRBB-3, IRBB-4, IRBB-5, IRBB-7, IRBB-10, IRBB-11, IRBB-14, IRBB-21) serta varietas populer (IR24, IR64, S. Putih, K. Bali), dan menggunakan media tumbuh
Nutrient Broth (NB) (beef extract, pepton, NaCl). Bahan-bahan yang digunakan dalam identifikasi PCR yakni 3 pasang primer (Xoo2976, XO, Xoo), isolat Xoo, ddH2O, dNTP, GC rich, 10x bufer PCR, Taq polimerase, minyak mineral. Identifikasi elektroforesis fragmen DNA dengan menggunakan bahan gel agarosa, bufer Tris- asetat-EDTA (TAE), loading dye¸ penanda DNA 100 bp (vivantis), dan senyawa etidium bromida.
Metode
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan. Tahap awal adalah pengambilan sampel tanaman padi yang terserang penyakit HDB di daerah Jawa Barat, Kalimantan Barat, dan Sumatera Barat. Tahap selanjutnya adalah tahap isolasi dan pemurnian bakteri Xoo berdasarkan morfologi, serta tahap identifikasi bakteri Xoo menggunakan PCR dengan 3 pasang primer yakni Xoo2976F
(GCCGTTTTTCTTCCTCAGC) dan
Xoo2976R (AGGAAAGGGTTTGTGGAAG C) (Lang et al. 2010); XOF (ATGCC GATCACCATGCCGAT) dan XOR (TGGC CTTGTCGTACGAGCTC) (Lee et al. 2005); XooF1 (TGGTAGTCCACGCCCTAAAC) dan XooR1 (CCTGAGCTACAGACCCGA AG) (Onasanya et al. 2010). Tahap terakhir adalah uji karakter patogenitas terhadap isolat positif bakteri Xoo dengan varietas padi galur isogenik dan varietas populer (Noor et al.
2006).
Pengambilan Sampel HDB (IRRI 1996)
Sampel diambil dari beberapa lokasi berdasarkan tingkat prevalensi penyakit HDB yakni di Jawa Barat (endemik HDB), Sumatera Barat (tergolong sedang),
Kalimantan Barat (tergolong rendah). Prevalensi tersebut berdasarkan data Direktorat Perlindungan Pangan (2011). Daun padi yang mengalami gejala HDB yakni daun yang berwarna kuning keabu-abuan, dipotong, dimasukan ke dalam kantong kertas, dan disimpan dalam suhu ruang.
Isolasi dan Pemurnian Bakteri Xoo (IRRI 1996)
Pembuatan Media Wakimoto Agar (WA) Modifikasi IRRI (1996). Labu Erlenmeyer 1000 mL dicampurkan 20 g sukrosa, 5 g pepton, 0.5 g Ca(NO3)24H2O, 1.82 g Na2HPO47H2O, 0.05 g FeSO47H2O, 18 g bakto agar, dalam 1 L destilat H2O, diaduk, ditutup dengan Aluminium foil, dan diautoklaf selama 15 menit pada suhu 121 oC, selanjutnya media dituangkan pada cawan Petri untuk media cawan dan tabung reaksi yang tertutup kapas steril dan dilakukan secara diagonal untuk media miring, lalu didinginkan. Proses dilakukan dalam laminar air flow cabinet.
Isolasi Bakteri Xoo (IRRI 1996). Daun yang mengalami gejala HDB dicuci dengan air, dipotong kecil berkisar 1 x 1 cm, direndam dengan etanol 70% selama 3 menit. Selanjutnya dibilas dengan air steril sebanyak dua kali selama 2 menit. Setelah itu, daun digores dengan menggunakan tusuk sate, dan digoreskan kembali ke media cawan Wakimoto agar (WA) yang telah diberi label sesuai kode isolat (Lampiran 2). Cawan Petri disimpan selama 48 jam. Proses ini dilakukan dalam laminarair flow cabinet.
Pemurnian Bakteri Xoo (IRRI 1996). Media cawan yang telah tumbuh ditandai dengan koloni kuning keputihan. Satu ose koloni dari cawan digoreskan ke dalam media miring WA yang telah ditandai berdasarkan penomoran isolat Xoo yang didaftarkan sebelumnya, dan disimpan pada suhu ruang hingga uji selanjutnya. Proses ini dilakukan di dalam laminar air flow cabinet.
Identifikasi Bakteri Xoo Menggunakan PCR (Lang et al. 2006)
Terdapat beberapa tahapan dalam identifikasi Xoo menggunakan PCR yakni persiapan primer, DNA target, PCR mix, dan verifikasi elektroforesis. Persiapan primer pengujian menggunakan konsentrasi 5 µM
forward dan reverse. Selanjutnya persiapan DNA target, dilakukan dalam laminar air flow
cabinet dengan mengambil 2 ose isolat Xoo yang dimasukkan ke 100 µL air steril dalam mikro tube. Lalu disimpan dalam suhu ruang. Persiapan PCR mix yakni mencampurkan ddH2O 14.4 µL, 10x bufer PCR 2 µL, 10 mM dNTP 0.4 µL, 5 µM primer 1 µL, GC rich
1µL, Taq polimerase (5 unit/µL) (Invitrogen), 1µL DNA target. Volume total yakni 20 µL dan ditambahkan 60 µL mineral oil agar tidak mengalami penguapan. Selanjutnya dimasukkan ke dalam PCR plate untuk diamplifikasi dengan suhu yang telah di optimasi berdasarkan Lang et al. (2010) yaitu denaturasi 94 oC selama 30 detik, penempelan 60 oC selama 30 detik, pemanjangan 68 oC selama 2 menit hingga 31 siklus. Lalu sampel disimpan pada suhu 4 oC.
Dilakukan verifikasi dengan menggunakan elektroforesis. Gel yang digunakan adalah gel agarosa 2%. Bak elektroforesis yang digunakan dimasukkan bufer TAE secukupnya, gel dimasukkan ke dalam bak lalu diinjeksikan DNA target sebanyak 10 µL yang sebelumnya ditambahkan loading dye 3 µL, serta 3 µL untuk penanda DNA 100 bp (vivantis), dialirkan arus listrik selama 1 jam 30 menit. Kemudian dilakukan staining dengan direndam selama 5 menit menggunakan etidium bromida, digoyangkan, dibilas dengan air selama 1 menit. Lalu divisualisasikan dengan menggunakan Chemidoc Bio-Rad. Karakter Patogenik (Noor et al. 2006).
Persiapan Media Tanam (Yunus 1998). Sejumlah 30 bak tanah yang telah digenangi air selama 2 minggu, diberi pupuk SP36 0.18 g/bak, urea 0.255 g/bak, dan KCl 0.045 g/bak.
Persiapan Padi Varietas Galur Isogenik dan Populer (Yunus 1998). Benih padi galur isogenik berasal dari IRRI dan populer (Nipponbare, Ciherang, Code, IR64, Sirandah putih, Cisadane, Kencana Bali, dan IR24) Penggunaan padi tersebut untuk mengetahui tingkat tahan dan peka. Keterangan varietas populer tersebut dapat dilihat pada Tabel 3. Selanjutnya diletakkan dalam cawan Petri yang berisikan tisu basah, lalu disimpan selama 2 minggu dalam suhu ruang. Setelah itu, dipindahkan ke dalam media tanam yang telah disediakan sebelumnya, ditanam secara bersamaan dan sejajar. Masing-masing bak akan ditanami 18 varietas yang sama dengan 5 benih untuk tiap varietas padi percobaan pada rumah kawat.
Tabel 3 Daftar varietas padi dalam karakter patogenitas pada rumah kawat. No Varietas Keterangan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Nipponbare Ciherang Code IR64 S. Putih Cisadane K. Bali IRBB1 IRBB2 IRBB3 IRBB4 IRBB5 IRBB7 IRBB20 IRBB11 IRBB14 IRBB21 IR24
Padi umur pendek Varietas populer Terkandung Xa4-Xa7 Varietas populer Populer Sumatera Cek rentan Cek rentan Terkandung Xa1 Terkandung Xa2 Terkandung Xa3 Terkandung Xa4 Terkandung xa5 Terkandung Xa7 Terkandung Xa20 Terkandung Xa11 Terkandung Xa14 Terkandung Xa21 Tidak terdapat gen Xa
Uji Karakter Patogenitas Noor et al. (2006). Setelah padi berumur 4 minggu selanjutnya diinokulasikan isolat yang telah positif Xoo pada media NB yakni 10 isolat terbaik dari masing-masing daerah. Diinokulasi dengan cara pengguntingan (clip-
method) ujung daun dengan menggunakan gunting steril, lalu daun dicelupkan ke dalam koloni bakteri Xoo. Setiap 1 minggu kemudian secara berturut-turut selama 2 minggu dilakukan pengamatan dengan parameter pengamatan panjang daun dan panjang serangan untuk mendapatkan intensitas penyakit (IP). Intensitas penyakit dihitung dengan rumus:
IP =panjang serangan (cm)
panjang daun (cm) x 100%
dan dilakukan pembobotan. Indikator pembobotan berdasarkan skala 0 – 100 % disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Indikator pembobotan intensitas penyakit padi karakter patogenitas Pembobotan IP (%) Keterangan 0 1 – 5.9 6 – 12.9 13 – 25.9 26 – 50.9 51 – 75.9 76 – 100 Sangat tahan (ST) Tahan (T) Agak tahan (AT) Sedang (S) Agak peka (AP) Peka (P)
Sangat peka (SP) Sumber: IRRI (1996); IP: Intensitas penyakit