Isolat-isolat Xoo didapatkan dari tiga wilayah yang menunjukkan bahwa penyakit HDB merupakan penyakit utama yang menyerang daerah tersebut yakni, Sumatera Barat, Jawa Barat, dan Kalimantan Barat. Disamping itu ketiga wilayah tersebut menunjukkan perbedaan penyerangan HDB secara signifikan. Berdasarkan data Direktorat Perlindungan Pangan (2011) bahwa prevalensi serangan untuk Jawa Barat adalah endemik, Sumatera Barat tergolong sedang, dan Kalimantan Barat tergolong rendah. Jenis padi pada daerah tersebut terlihat pada Lampiran 2. Hasil isolasi dari ketiga daerah tersebut yang telah dimurnikan dengan menggunakan agar miring dengan media WA didapatkan 72 isolat diantaranya 20 isolat berasal dari Jawa Barat, 30 isolat berasal dari Sumatera Barat, dan 22 isolat berasal dari Kalimantan Barat. Isolat tersebut menunjukkan ciri-ciri Xoo secara fenotip (Gambar 4). Menurut Liu et al
(2006) bakteri Xoo memiliki bentuk fenotip pada media padat yakni berlendir, cembung, bulat, dan berwarna kuning karena adanya pigmen Xanthomonadin. Penggunaan media WA dimaksudkan karena media tersebut telah terbukti dapat menghasilkan kultur murni dan bersih jika dibandingkan dengan media Yeast dextrose calcium carbonate (YDC) (Noor et al. 2006). Sedangkan penggunaan kapas dalam peremajaan bakteri disebabkan karena bakteri tersebut termasuk dalam bakteri obligat aerob (Liu et al. 2006) yang memerlukan oksigen untuk tumbuh. Kapas memiliki pori-pori kecil untuk keluar masuknya udara dan membantu dalam proses sterilisasi yakni mengurangi uap air dalam pematangan media.
Gambar 4 Koloni Xoo dalam media cawan WA (1) cembung, (2) ujung bulat, (3) berwarna kuning.
1
2
Identifikasi Bakteri Xoo Menggunakan PCR Koloni
Isolat dari ketiga daerah tersebut diidentifikasi dengan menggunakan primer spesifik yang dikembangkan oleh Lee et al.
(2005) primer XO (F: ATGCCGATCACCA TGCCGAT; R: TGGCCTTGTCGTACGAG CTC), Lang et al. (2010) primer2976 (F: GCCGTTTTTCTTCCTCAGC; R: AGGAA AGGGTTTGTGGAAGC) dan Onasanya et al. (2010) primer Xoo (F: TGGTAGTCCA CGCCCTAAAC; R: CCTGAGCTACAGA CCCGAAG), melalui metode PCR koloni, yakni proses pemilihan DNA secara cepat yang telah teramplifikasi oleh primer spesifik, bahkan untuk mengetahui DNA teramplifikasi dapat berasal dari koloni yang berada dalam larutan dan langsung direaksikan dalam PCR
(Dafa’alla et al. 2000)
Profil temperatur PCR yang digunakan adalah temperatur 94 oC untuk denaturasi awal selama 3 menit bertujuan untuk memecah dinding sel bakteri, DNA denaturasi dan persiapan Taq polimerase karena bersifat
hot-start atau aktif setelah dipanaskan terlebih dahulu (Penstana et al. 2010), temperatur 94oC untuk denaturasi DNA menjadi utas tunggal selama 30 detik, temperatur 60oC untuk penempelan primer selama 30 detik, temperatur 68 oC untuk pemanjangan primer selama 30 detik. Pengulangan siklus dilakukan sebanyak 31 kali. Tahap akhir adalah pemastian utas tunggal telah teramplifikasi secara sempurna pada temperatur 68 oC selama 10 menit (Lang et al 2010).
Identifikasi dengan menggunakan primer XO yang dikembangkan oleh Lee et al. (2005) merupakan primer berdasarkan urutan DNA KACC10331 pada NCBI dan merupakan gen penyandi protein sistem sekresi tipe III (T3SS) pada Xanthomonas oryzae. Primer yang umum untuk membedakan spesies Xanthomonas oryzae dan tidak spesifik untuk patogen varian. Primer XO berada pada pita DNA ukuran 534 bp. Elektroforegram (Gambar 5) menunjukkan bahwa seluruh isolat teridentifikasi positif Xoo kecuali isolat dengan kode Xoo11-023 tidak menunjukkan adanya pita DNA pada ukuran 534 bp, maka isolat Xoo11-023 tidak termasuk dalam spesies Xanthomonas oryzae.
Hasil identifikasi dengan menggunakan primer Xoo2976 yang dikembangkan oleh Lang et al. 2010, memunculkan pita DNA pada ukuran 300 bp. Menurut Lang et al
(2010), pita DNA akan muncul pada ukuran
Gambar 5 Elektroforegram PCR koloni dengan menggunakan primer XO. (P) Penanda, (20 – 28) Nomor Isolat Xoo.
337 bp dengan target primer pada gen yang menyandikan domain protein katalitik. Samahalnya dengan primer sebelumnya semua isolat menunjukkan positif bakteri Xoo kecuali isolat Xoo11-023 yang tidak menunjukkan pita DNA pada ukuran 337 bp (Gambar 6).
Primer Xoo2976 didapatkan dari pendekatan urutan basa nitrogen 16s rRNA. Urutan basa nitrogen 16s rRNA merupakan urutan RNA yang bersifat ubiquitous (ada dimana-mana) dengan fungsi identik pada seluruh organisme prokaryot. Urutan ini pun memiliki beberapa daerah dengan urutan basa yang relatif konservatif dan variatif, karena sifat ini yang menyebabkan 16s rRNA sebagai acuan identifikasi (Pangastuti 2006). Akan tetapi, 98.6% 16s rRNA menunjukan kesamaan pada genus Xanthomonas, sehingga untuk membedakan patogen secara spesifik dilakukan pemotongan pada urutan 16s – 23s rRNA yakni urutan antara 16s rRNA dan 23s rRNA berupa ruang internal rRNA (Lang et al
2010).
Hasil identifikasi dengan menggunakan primer Xoo yang terlihat pada Gambar 7,
Gambar 6 Elektroforegram PCR koloni dengan menggunakan primer Xoo2976. (P) Penanda, (19 – 27) Nomor isolat Xoo.
P
Gambar 7 Elektroforegram PCR koloni dengan menggunakan primer Xoo. (P) Penanda, (19 – 28) Nomor isolat Xoo.
menunjukkan pita DNA berada pada ukuran antara 800 – 900 bp dan 900 – 1000 bp, hal ini sesuai dengan penelitian Onasanya et al.
(2010) bahwa primer Xoo berada pada ukuran yang bervariasi. Penentuan untuk menunjukkan isolat tersebut positif akan terlihat munculnya pita DNA pada sumur elektroforesis. Semua isolat menunjukkan hasil yang positif, ditunjukkan dengan adanya pita DNA pada seluruh isolat kecuali pada isolat Xoo11-023. Isolat ini tidak memperlihatkan adanya pita DNA pada sumur elektroforesis. Primer Xoo didesain berdasarkan urutan DNA genom dari referensi NCBI dengan kode urutan NC_007705.1 (Onasanya et al 2010).
Isolat Xoo11-023 yang berasal dari Sumatera Barat, pada ketiga primer tidak memunculkan pita DNA atau tidak berada dalam ukuran yang tepat. Menurut Onasanya
et al. (2010), bahwa hasil elektroforesis yang memunculkan adanya pita DNA menunjukkan isolat tersebut positif bakteri Xoo dan sebaliknya. Pada daun yang terinfeksi isolat Xoo11-023 memiliki daun kuning keabu- abuan dari ujung hingga pangkal daun, sedangkan pada media WA pun menunjukkan bentuk yang licin atau berlendir, cembung, dan berwarna kuning. Walaupun dalam penyerangan dan gejala sama, diduga isolat tersebut merupakan Xanthomonoas oryzae pv.
oryzicola (Xoc) yang merupakan kerabat terdekat dari bakteri Xoo (Bogdanove et al.
2011).
Karakter Patogenitas
Tanaman padi yang diuji ditanam selama 4 minggu dan diinokulasi melalui clipmethod
yaitu pemotongan ujung daun padi yang akan diamati sehingga bakteri Xoo dapat
menginfeksi inang. Pemotongan ujung daun dimaksudkan karena bentuk infeksi bakteri Xoo yang bermula dari ujung daun yaitu jaringan hidatoda dengan membuat luka pada daun (Ou 1985). Selanjutnya ujung daun akan terlihat menguning hingga akhirnya seluruh daun melalui ruas daun semakin menguning keputih-putihan dan mati (Liu et al 2006).
Isolat-isolat asal Jawa Barat menunjukkan bahwa padi varietas Code dan IRBB5 adalah varietas yang tergolong tahan sedangkan Nipponbare, IRBB7, dan IRBB21 tergolong agak tahan berdasarkan hasil pembobotan. Code memiliki intensitas penyakit rerata 1.62 % dan IRBB5 sebesar 3.55% (Gambar 8). Isolat-isolat asal Sumatera Barat menunjukkan bahwa varietas Code dan IRBB5 tergolong tahan terhadap HDB dengan intesitas penyakit rerata 2.10% dan 2.97%, sedangkan varietas Nipponbare, Cisadane, dan IRBB21 merupakan varietas padi agak tahan berdasarkan hasil pembobotan (Gambar 9). Serangan isolat-isolat asal Kalimantan Barat menunjukkan bahwa varietas Code dan IRBB5 pun tergolong tahan dengan jumlah rerata intensitas penyakit sebesar 2.17% dan 4.45%, sedangkan varietas yang agak tahan hanya varietas IRBB21 (Gambar 10).
Varietas Code dan IRBB5 tahan pada tiga wilayah tersebut. Padi varietas Code merupakan padi hasil persilangan (crossback) dari IR64 sebagai tetua berulang dan IRBB7 sebagai tetua donor. Varietas IR64 memiliki gen ketahan terhadap HDB yakni gen dominan Xa4, sedangkan IRBB7 mengandung gen dominan Xa7, sehingga Code menghasilkan dua gen ketahan HDB yakni
Xa4 dan Xa7 (BB Biogen 2007). Gen Xa4 berada di kromosom 11 yang berdekatan dengan gen Xa26 yang resisten terhadap strain HDB asal Filipina yakni strain 1,4,5,7,8, dan 10 sehingga secara luas dibudidaya sebelum terpatahkan pada tahun 1970an (Wang et al.
2001). Gen Xa7 terletak pada kromosom 6 yang resisten terhadap strain HDB asal Filipina tipe 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, dan 10 (Lee and Khush 2000 dalam Liu et al. 2006). Ketahanan kedua gen tersebut sangat tinggi maka kombinasi kedua gen memberikan efek yang saling melengkapi (aditif) untuk menurunkan serangan patogen secara kualitatif. Varietas IRBB5 merupakan varietas monogenik hasil persilangan dari IR24 dan padi kelompok aus boro asal Bangladesh sebagai tetua donor gen xa5 (Oryzae sativa
L). Gen xa5 merupakan gen resesif yang berada di kromosom 5 dan merupakan
18.61 25.18 2.17 28.83 43.14 18.57 36.95 48.80 47.64 41.28 41.41 4.45 18.09 46.68 46.67 49.71 10.93 42.04 0 10 20 30 40 50 60 Inte ns it a s peny a k it ( %)
Varietas padi percobaan 6.70 17.08 2.10 22.31 26.92 12.38 29.94 33.80 33.60 25.78 29.28 2.98 20.49 33.53 32.89 36.61 6.26 28.19 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Inte ns it a s peny a k it ( %)
Varietas padi percobaan 11.04 21.43 1.62 29.78 35.60 23.73 35.65 38.93 38.44 31.63 39.70 3.55 8.48 43.01 40.17 42.20 9.98 40.58 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Int e nsit a s pe ny a k it ( %)
Varietas padi percobaan
Gambar 8 Histogram rerata intensitas penyakit isolat-isolat HDB asal Jawa Barat. Tahan (T), agak tahan (AT), sedang (S), agak peka (AP).
Gambar 9 Histogram rerata intensitas penyakit isolat-isolat HDB asal Sumatera Barat. Tahan (T), agak tahan (AT), sedang (S), agak peka (AP).
Gambar 10 Histogram rerata intensitas penyakit isolat-isolat HDB asal Kalimantan Barat. Tahan (T), agak tahan (AT), sedang (S), agak peka (AP).
penyandi subunit protein sekresi gamma TFIIA, serta resisten terhadap strain HDB asal Filipina tipe 1, 2, 3, 5, 7, 8, 9, dan 10 (Iyer dan Mc Couch 2004). Gen xa5 merupakan salah satu gen yang sangat efektif tahan terhadap strain di Indonesia sehingga gen tersebut potensial digunakan dalam penanggulangan penyakit hawar daun di Indonesia (Yunus 1998).Gen xa5 dalam interaksi dengan bakteri Xoo akan menghasilkan protein termodifikasi dari penyandian subunit transkripsi pada pre- initiation complex (PIC), sehingga dapat menurunkan avirulensi xa5 (avr xa5) (Liu et al. 2006).
Isolat yang berasal dari Sumatera Barat memiliki tingkat virulensi paling tinggi dengan indikator tahan varietas Code dan IRBB5. Berdasarkan uji patogenitas didapatkan bahwa isolat dengan no. kode Xoo11-042 memiliki intensitas rerata terhadap Code 3.29% dan bahkan IRBB5 tergolong agak tahan dengan intensitas rerata 6.90% (Gambar 11). Kuatnya virulensi Xoo11-042 diduga disebabkan karena adanya gen penyandi avirulensi Xa7, yang merupakan gen penting dalam penyerangan bakteri Xoo. Kehilangan gen tersebut dapat melemahkan virulensi Xoo (Bai et al. 2000).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Sejumlah 72 isolat Xanthomonas oryzae
pv oryzae yang berhasil diisolasi dari 3 lokasi, yakni 20 isolat asal Jawa Barat, 30 isolat asal Sumatera Barat, dan 22 isolat asal Kalimantan Barat. Hasil identifikasi dengan
PCR koloni menunjukkan seluruh isolat positif Xoo kecuali isolat Xoo11-023 asal Sumatera Barat yang tidak teridentifikasi sebagai bakteri Xoo. Analisis karakterisasi patogenik menggunakan varietas padi galur isogenik menunjukkan bahwa varietas Code yang mengandung Xa4-Xa7 dan IRBB5 mengandung Xa5 untuk isolat Jawa Barat, Sumatera Barat, dan Kalimantan Barat adalah tahan untuk isolat Xoo ketiga wilayah tersebut. Isolat yang memiliki tingkat virulensi paling tinggi adalah isolat Xoo11- 042 asal Sumatera Barat yang menurunkan ketahan IRBB5 hingga tergolong agak tahan berdasarkan pembobotan.
Saran
Perlu dilakukan selektifitas dan sensitifitas metode. Dilakukan penelitian lebih lanjut terkait kelompok isolat-isolat dalam pengujian sehingga lebih mudah mengetahui profil kelompokmdan tingkat evolusi pada bakteri Xoo, serta dilakukan pengujian gen ketahanan terhadap varietas populer agar dapat dikombinasikan dengan gen ketahanan lainnya melalui metode back cross atau transgenik.
DAFTAR PUSTAKA
Adhikari et al.. 1995. Genetic diversity of
Xanthomonas oryzae pv oryzae in Asia.
Appl. Environ. Microbiol. 61: 966-971.
Agustiansyah. 2011. Perlakuan benih untuk perbaikan pertumbuhan tanaman, hasil, dan mutu benih padi serta pengendalian
. 8.61 26.03 3.29 32.89 35.37 20.39 28.85 51.38 37.40 29.81 32.24 6.90 32.21 35.04 37.41 41.16 7.65 34.13 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 Inte ns it a s peny a k it ( %)
Varietas padi percobaan
Gambar 11 Histogram rerata intensitas penyakit isolat Xoo11-042 asal Sumatera Barat. Tahan (T), agak tahan (AT), sedang (S), agak peka (AP), peka (P)