Tempat dan Waktu
Penelitian kultur in vitro dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, sedangkan pengujian stomata dilakukan di Laboratorium Mikro Teknik, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan mulai bulan Januari sampai dengan Desember 2010.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah pucukin vitro(shoot tip) dari planlet krisan varietas Chandra Kirana (Gambar 4a) dan Puspita Asri (Gambar 4b), yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Hias, Cipanas.
Gambar 4. Kultur In vitro yang Digunakan Sebagai Sumber Eksplan. (a) Krisan var. Chandra Kirana dan (b) Krisan var. Puspita Asri.
Media perbanyakan yang digunakan yaitu MS0, sedangkan media kultur setelah perlakuan EMS adalah media MS dengan penambahan 1 ppm BAP. Bahan kimia lain yang dipakai yaitu etil metana sulfonat (EMS), komposisi media MS, BAP, aquades, spiritus, agar-agar, dan sukrosa.
Alat-alat yang digunakan meliputi Laminar Airflow Cabinet (LAC),
autoclave, stearer, shaker, neraca analitik, botol kultur, gelas piala, gelas ukur, cawan petri, pipet volumetrik, pinset, skalpel, pH meter, tissue, plastik, karet gelang, handsprayer, bunsen, korek api, rak kultur yang dilengkapi lampu fluorescence, alat tulis, kamera digital, dan mikroskop.
Metode Penelitian
Percobaan untuk peningkatan keragaman krisan ini dilakukan dengan menggunakan rancangan faktorial dua faktor yaitu varietas krisan dan lama perendaman EMS (etil metana sulfonat) yang disusun secara acak lengkap (RAL). Faktor pertama adalah varietas yang terdiri dari dua varietas yaitu Chandra Kirana dan Puspita Asri, sedangkan faktor kedua adalah lama perendaman EMS 0.77 % sebanyak empat taraf yaitu kontrol (0 menit), 90 menit, 105 menit, dan 120 menit. Kontrol dilakukan dengan perendaman eksplan dalam akuades steril.
Setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 10 botol, sehingga keseluruhannya terdiri dari 80 botol satuan percobaan. Setiap satu botol satuan percobaan terdiri dari dua eksplan krisan, sehingga eksplan yang digunakan sejumlah 160 eksplan tunasin vitro.
Model rancangan yang digunakan adalah: Yijk= µ + αi+ βj+ (αβ)ij+ Єijk
Keterangan:
Yijk = nilai pengamatan dari satuan percobaan perlakuan varietas ke-i, karena lama pertendaman EMS ke-j dan ulangan ke-k
µ = nilai rataan umum
αi = pengaruh perlakuan varietas ke-i
βj = pengaruh perlakuan lama perendaman EMS ke-j
(αβ)j =pengaruh interaksi perlakuan varietas ke-i dan perlakuan lama perendaman EMS ke-j
Єijk = galat percobaan
i = 1, 2
j = 1, 2, 3, 4
k = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
Data yang diperoleh diuji secara statistik dengan uji F. Apabila berbeda nyata dilakukan uji lanjut dengan DMRT pada taraf nyata 5 %.
Analisis Keragaman Fenotipe dilakukan dengan perhitungan % KKF (Koefisien Keragaman Fenotipe). Rumus dan kriteria keragaman tersebut yaitu sebagai berikut :
% KKF = Standar deviasi populasi perlakuan x 100 % Rataan populasi perlakuan
Kategori keragaman berdasarkan % KKF yaitu : 0.00 < % KKF≤ 24.91 sempit 24.91 < % KKF≤ 49.71 agak sempit 49.71 < % KKF≤ 74.71 agak luas 74.71 < % KKF≤ 99.65 luas ≥ 99.65 sangat luas (Murdaningsihet al.,1999) Pelaksanaan Penelitian
Sterilisasi Alat, Media dan Lingkungan kerja
alat tanam dan botol kultur dicuci bersih kemudian dikeringkan. Alat-alat tanam danpetri dishdibungkus rapi terlebih dahulu dengan kertas. Media dan aquades juga disterilkan dalam autoklaf. Aquades dimasukkan dalam wadah kecil (erlenmeyer atau botol kultur) dengan isi maksimum 100 ml agar lebih efektif bila digunakan.
Semua alat dan bahan disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada tekanan 0.12 Mpa dan suhu 121oC dengan waktu sterilisasi untuk botol kultur dan alat tanam selama 30 menit, dan untuk media 15 menit. Persiapan sebelum penanaman yaitu bagian dalam laminar air flow cabinet (LAC) sebelum digunakan disinari terlebih dahulu dengan sinar UV selama 1 jam. Setelah itu permukaan bagian dalam disemprot dengan alkohol 70 % dan dibersihkan dengan tisu. Hal ini dilakukan sebelum dan setelah penanaman.
Semua alat dan bahan yang akan digunakan disemprot dengan alkohol 70 % terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam laminar, begitu juga tangan yang memegang alat. Pada saat penanaman, alat tanam yang telah diautoklaf direndam dalam alkohol 96 % dan dibakar di atas api bunsen beberapa saat untuk menjaga alat tetap steril. Botol kultur yang telah ditanam juga disemprot setiap hari dengan alkohol 70 % dan raknya dibersihkan agar steril.
Pembuatan Media
Media yang digunakan untuk perbanyakan dan pertumbuhan adalah media MS0. Media MS dibuat dengan mencampur larutan stok (A, B, C, D, E, F, Myo-inositol dan vitamin) yang ditambah 30g/l gula, dan 7 g/l agar-agar seperti pada Lampiran 1. Kemudian ditambahkan KOH/NaOH atau HCl pada media sehingga diperoleh pH 5.9, setelah itu dididihkan. Setelah mendidih, 25 ml larutan dituang ke dalam botol kultur yang telah disterilisasi, kemudian ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet gelang. Botol-botol yang telah diisi media tersebut disterilisasi dalam autoklaf dengan tekanan 75.1 psi dan suhu 121oC selama 20 menit.
Perbanyakan Planlet pada Media MS0
Perbanyakan sumber eksplan krisan dilakukan sebelum perlakuan agar jumlah eksplan menjadi cukup. Perbanyakan menggunakan metode kultur mata tunas yang dilakukan di dalam LAC. Induk planlet yang telah ada dipotong-potong setiap satu mata tunas. Potongan eksplan direndam di dalam air yang telah diberi 2-3 tetes antiseptik. Selanjutnya eksplan ditanam di media MS0 dengan posisi tegak. Perbanyakan dilakukan dengan menanam lima eksplan dalam setiap botol kultur.
Perendaman EMS dan Penanaman Ekplan
Perendaman dan penanaman eksplan dilakukan di dalam LAC yang telah diberi perlakuan ultra violet (UV) selama satu jam dan disterilkan dengan alkohol 70 %. Eksplan direndam dan dikocok secara manual pada larutan EMS 0.77 % selama 90 menit, 105 menit, dan 120 menit (Gambar 5). Perlakuan kontrol dilakukan dengan perendaman eksplan di dalam air steril selama 120 menit. Perlakuan perendaman dilakukan di dalam laminar Eksplan yang digunakan adalah kultur tunas pucuk dari planlet krisan dengan panjang 0.5-1.0 cm. Eksplan yang telah direndam kemudian dicuci dengan air steril sebanyak tiga kali selama 15 menit.
Selanjutnya eksplan ditanam di dalam media MS + BAP 1 ppm. Setiap botol kultur ditanam dua eksplan. Setelah eksplan ditanam, botol ditutup dengan plastik dan diikat rapat dengan karet gelang. Botol kultur kemudian dipindahkan ke ruang kultur dengan kondisi ruang optimum (suhu 16oC).
Gambar 5. Perendaman Eksplan Krisan Var. Chandra Kirana (kiri) dan Var.Puspita Asri (kanan) dalam Larutan EMS 0.77 %.
Analisis Stomata dan Jumlah Kloroplas pada Sel Penjaga
Persiapan dilakukan di dalam laminar dengan menggunting dan mengeluarkan daun dari botol kultur. Masing-masing perlakuan diambil 10 daun sebagai sampelnya dan dimasukkan ke dalam kantung plastik kecil tiap perlakuan. Tahap berikutnya dilakukan di Laboratorium Mikro Teknik Departemen Agronomi dan Hortikultura, Institut Pertanian Bogor. Daun yang telah tersedia diletakkan di kaca preparat dan direkatkan solatip pada bagian bawah daun. Kemudian solatip dibuka sebagian agar bagian atas daun terlihat. Selanjutnya dilakukan pengerokan lapisan atas daun dengan bantuan pinset atau silet sampai hanya tersisa lapisan tipis bagian bawah daun. Tahap terakhir yaitu meletakkan kaca preparat di atas meja mikroskop dan dilakukan pengaturan pembesaran hingga stomata dan kloroplas terlihat jelas.
Pengamatan Penelitian
Pengamatan dilakukan mulai 1-12 minggu setelah tanam (MST) pada media kultur, pada peubah sebagai berikut:
1. Peubah Kuantitatif
a) Persentase kontaminasi
Pengamatan dilakukan setiap minggu dengan melihat keadaan tanaman maupun media yang terkontaminasi oleh cendawan atau bakteri.
b) Waktu munculnya tunas pertama
Pengamatan dilakukan setiap minggu, mulai hari pertama sejak eksplan ditanam. Peubah ini diamati untuk melihat pada berapa MST tunas pertama muncul.
c) Persentase eksplan bertunas
Pengamatan dilakukan setiap minggu dengan melihat eksplan yang bertunas dari eksplan yang hidup.
d) Jumlah tunas per eksplan
Pengamatan ini dilakukan setiap minggu dengan menghitung jumlah tunas yang muncul.
e) Persentase eksplan berkalus
Pengamatan dilakukan setiap minggu dengan melihat adanya kalus pada eksplan.
f) Tinggi tanaman
Pengamatan dilakukan setiap minggu, pengukuran dilakukan mulai dari atas media hingga tunas yang tertinggi. Pada proses pengukuran, tanaman tidak dikeluarkan dari botol kultur, sehingga digunakan penggaris yang ditempel pada botol kultur.
g) Jumlah daun total per eksplan
Pengamatan dilakukan setiap minggu pada daun yang telah membuka penuh.
h) Jumlah akar total
Pengamatan dilakukan setiap minggu, mulai 1-12 MST. Pengamatan dilakukan mulai dari akar yang muncul pertama kali.
i) Persentase eksplan berakar
Pengamatan dilakukan pada jumlah planlet yang berakar. Penghitungan dilakukan di akhir pengamatan tanaman dalam botol.
j) Jumlah stomata dan kloroplas
Jumlah stomata per bidang pandang dan jumlah kloroplas pada sel penjaga diamati dengan perbesaran 400 kali pada mikroskop pada 12 MST.
2. Peubah Kualitatif
Pengamatan umumnya dilakukan setiap dua minggu sekali sejak 1-12 MST saat eksplan di dalam botol.
a) Perubahan warna dan bentuk daun
b) Perubahan warna batang c) Perubahan warna kalus
Bagan alur pelaksanaan penelitian disajikan pada Gambar 6.
Gambar 6. Alur Pelaksanaan Penelitian
Stok Planlet Krisan var. Chandra Kirana dan var.Puspita asri
Persiapan Botol Kultur Pengolahan Data Pengolahan Data Penulisan Laporan Akhir Pengamatan Pengamatan
Persiapan Larutan stok, EMS dan Media MS
Perbanyakan Planlet pada Media MS0
Perlakuan Perendaman dengan EMS dan Penanaman pada Media MS + BAP 1 ppm
Inkubasi di Ruang Kultur