Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan di rumah kaca, Kebun Percobaan Cikabayan, Darmaga. Penelitian dilaksanakan dari bulan Desember 2011 sampai bulan Juni 2012.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah cendawan endofit (H1, H5 dan H12) yang sudah dibiajkan di Laboratorium Klinik Tanaman, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, benih cabai TM88, polibag, tanah steril, dan bahan-bahan untuk Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Persiapan Tanaman Inang Sumber Inokulum Virus
Tanaman yang digunakan untuk perbanyakan sumber inokulum virus adalah Capsicum annum varietas TM88. Benih tanaman cabai disemai didalam nampan yang berisi media tanah steril, setelah 2 minggu bibit yang tumbuh dipindahkan ke polibag yang berisi media tanah steril. Selama masa pertumbuhan bibit dipelihara dengan baik di rumah kaca. Tanaman yang siap diinokulasi adalah tanaman yang berumur relatif muda yaitu telah memiliki daun muda yang telah membuka penuh. Inokulasi virus dilakukan secara mekanis.
Metode Inokulasi Virus Secara Mekanis
Sumber inokulum virus adalah ChiVMV isolat Cikabayan yang merupakan koleksi Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Daun cabai terinfeksi ChiVMV digerus dalam mortar steril, dan ditambahkan dengan larutan penyangga fosfat 0,01 M (pH 7) sebanyak 5 ml untuk setiap 1 g daun (1:5 b/v). Cairan perasan (Sap) yang diperoleh segera digunakan untuk inokulasi ke tanaman. Setiap tanaman diinokulasi pada 2 helai daun termuda yang telah membuka penuh (33 hari setelah semai). Sebelum inokulasi daun diberi karborundum pada bagian permukaan atas, kemudian sap dioleskan dengan telunjuk jari tangan pada permukaan daun yang dimulai dari daun bagian bawah didekat pertulangan daun ke bagian atas secara searah dengan tidak mengulangi pada daerah yang sama. Segera setelah pengolesan sap dilakukan pembilasan sisa-sisa yang masih melekat pada permukaan daun tanaman uji menggunakan air mengalir.
Inokulasi Cendawan Endofit
Koloni cendawan endofit yang telah ditumbuhkan pada media Potato Dextrose Agar (PDA) (Lampiran 1) dipindahkan kedalam erlenmeyer yang sudah berisi media Potato Dextrose Broth (PDB) (Lampiran 2) menggunakan jarum inokulasi sebanyak satu cork borer. Erlenmeyer yang berisi cendawan endofit digoyang pada shaker dengan kecepatan 100 rpm selama 14 hari. Koloni cendawan endofit yang tumbuh, selanjutnya dicuci dengan aquades dan dikeringkan dengan menggunakan vacuum pump. Koloni cendawan endofit yang
3 telah kering kemudian dihancurkan dengan blender selama 30 menit. Penentuan kerapatan miselia cendawan dilakukan dengan pengamatan mikroskopis cahaya dan menggunakan hemositometer (Lampiran 2).
Cendawan endofit yang telah diketahui kerapatan miselianya kemudian diencerkan dengan aquades, sehingga diperoleh kerapatan miselia 10⁵cfu/ml. Inokulum cendawan endofit tersebut disemprotkan pada daun tanaman uji yang berumur 1 minggu setelah tanam (MST). Tanaman yang sudah diberi perlakuan kemudian disungkup dengan sungkup plastik selama 24 jam. Setelah melewati waktu 24 jam sungkup kembali dibuka dan pemeliharaan tanaman uji dilakukan kembali di rumah kaca Kebun Percobaan Cikabayan, Darmaga, Institut Pertanian Bogor.
Inokulasi ChiVMV pada Tanaman Uji
Inokulasi ChiVMV pada tanaman cabai uji dilakukan pada bibit cabai yang telah diberi perlakuan cendawan endofit dipesemaian. Benih cabai diletakkan dalam tabung reaksi yang sudah berisi aquades, kemudian dipanaskan pada suhu 55°C selama 20 menit. Benih dikeluarkan dari dalam tabung reaksi, kemudian dibekam pada suspensi cendawan endofit selama 12 jam di dalam cawan petri. Benih selanjutnya disemai pada nampan yang sudah berisi media tanah steril dan dipelihara dengan baik sampai siap digunakan untuk inokulasi.
Inokulasi ChiVMV pada bibit cabai TM88 dilakukan dua kali yaitu inokulasi pertama pada kotiledon ketika bibit cabai berumur 33 hari setelah semai atau ketika bibit cabai sudah memiliki 2 helai daun yang telah membuka penuh, dan inokulasi kedua dilakukan satu minggu setelah inokulasi pertama. Metode inokulasi dilakukan seperti metode inokulasi virus secara mekanis yang telah diuraikan sebelumnya. Inokulasi dilakukan 1 minggu setelah penyemprotan cendawan endofit atau 2 MST setelah pindah tanam.
Deteksi ChiVMV Menggunakan Metode ELISA
Deteksi ChiVMV terhadap sampel tanaman uji yang diambil dari rumah kaca menggunakan Double Antibody SandwichELISA (DAS ELISA) menurut petunjuk dari DSMZ (Clark dan Adams 1977). Antibodi ChiVMV diencerkan dalam coating buffer dengan konsentrasi 1:1000 dan dicampur secara merata. Antibodi dan coating buffer selanjutnya dimasukkan kedalam platmikrotiter sebanyak 100 µ l/sumuran. Platmikrotiter kemudian dimasukkan kedalam kotak plastik dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 sampai 4 jam. Setelah proses inkubasi selesai, platmikrotiter dicuci menggunakan larutan phosphate buffer saline tween (PBST) sebanyak 3 sampai 4 kali. Sumuran platmikrotiter selanjutnya diisi dengan 100 µ l/sumuran sap tanaman terinfeksi virus, kemudian diinkubasi pada suhu 4°C semalaman. Platmikrotiter dicuci lagi dengan PBST sebanyak 5 sampai 7 kali. Immunoglobulin antibody G alkaline phosphatase (IgGAP) yang diencerkan dengan buffer conjugate dengan konsentrasi 1:1000 dimasukan kedalam platmikrotiter sebanyak 100µ l/sumuran kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 4 jam. Platmikrotiter dicuci dengan PBST sebanyak 5 sampai 7 kali. Platmikrotiter yang sudah dicuci kemudian ditambahkan larutan Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) yang sudah dimasukan tablet PNP (1 tablet/5 ml) sebanyak 100 µ l/sumuran dan diinkubasi selama 15 sampai 60 menit pada suhu ruang. Hasil ELISA diamati menggunakan spektrofotometer (ELISA reader) 5
3 pada panjang gelombang 405 nm, setiap 15 menit sekali hingga mencapai menit ke-60.
Rancangan Percobaan dan Peubah Pengamatan
Percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap karena unit percobaan yang digunakan relatif homogen. Percobaan terdiri dari 4 perlakuan yaitu pemberian cendawan endofit isolat H1, H5, H12, dan tanpa cendawan endofit (kontrol) dengan 3 ulangan untuk setiap perlakuan. Unit percobaan yang akan digunakan yaitu 4 perlakuan dan 3 ulangan dan masing-masing ulangan terdiri dari 25 tanaman uji, dengan jumlah total 300 tanaman. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1 dan dilanjutkan dengan uji Duncan taraf 5%.
Pengamatan dilakukan terhadap tinggi tanaman, volume akar, dan kejadian penyakit. Pengamatan tinggi tanaman uji dilakukan setiap seminggu sekali sebanyak 6 kali pengamatan. Pengukuran tinggi dilakukan dari permukaan tanah hingga pucuk tertinggi daun paling muda dengan menggunakan penggaris dan meteran baju. Pengukuran volume akar yaitu dengan mencabut tanaman uji, kemudian dipotong dengan menggunakan gunting. Akar yang sudah dipotong kemudian dimasukkan kedalam gelas ukur yang telah diisi air, selanjutnya kenaikan air yang terjadi dihitung volumenya. Pengukuran volume akar dilakukan pada hari terakhir pengamatan keseluruhan.
Kejadian penyakit ChiVMV pada setiap tanaman sampel dihitung dengan menggunakan rumus :
x100%
Keterangan: KP, kejadian penyakit; A, jumlah sampel positif yang terinfeksi ChiVMV; B, jumlah sampel yang diuji.
3