Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di laboratorium dan rumah kaca Balai Uji Terap Teknik dan Metoda Karantina Pertanian (BUTTMKP) Bekasi. Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2014 sampai Maret 2015.
Bahan dan Peralatan Penelitian
Bahan yang digunakan antara lain sampel benih jagung manis yang beredar di pasaran, isolat P. stewartii subsp. stewartii (koleksi Laboratorium Bakteriologi Departement Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor), bakterisida (Agrept 20 WP), media Yeast Extract Dextrosa-Calcium Carbonat Agar (YDCA), Nutrient Broth (NB), NaCl, dan Pasir. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah microwave oven (2450 MHz), bio safety cabinet II,
water bath, oven inkubator, shaker inkubator, vortex, hot plate, alat gelas, bunsen,
dan autoclave.
Bagan Alir Penelitian
Persiapan Isolat P. stewartii subsp stewartii Persiapan Sampel BenihJagung Manis Perlakuan Microwave Perlakuan Air Panas Perlakuan Panas Kering Perlakuan Bakterisida Percobaan I
Penentuan Treatment Window Perlakuan Benih
Analisis Treatment Window
Memiliki
Treatment Window
Percobaan II
Perlakuan Fisik dan Kimiawi pada Benih Terinfeksi P. stewartii subsp. stewartii
Ya Tidak Stop DB Populasi Bakteri
Lanjutan bagan alir penelitian Perlakuan Air Panas Perlakuan Panas Kering Perlakuan Bakterisida Analisis Data Percobaan III
Kombinasi Perlakuan Fisik dan Kimiawi pada Benih Terinfeksi P. stewartii
subsp. stewartii
Persiapan Sampel Benih Jagung Manis Terinfeksi
P. stewartii subsp. stewartii
Perlakuan Bakterisida Dilanjutkan Panas Kering
Perlakuan Panas Kering Dilanjutkan Bakterisida
Analisis Data Persiapan Sampel Benih Jagung Manis Terinfeksi
P. stewartii subsp. stewartii
Potensi untuk Perlakuan Benih Ya Tidak Stop Teknologi untuk mengeliminasi P. stewartii subsp.
stewartii pada benih
jagung manis DB Vigor Populasi Bakteri DB Vigor Populasi Bakteri Percobaan II
Percobaan I
Penentuan Treatment Window Perlakuan Benih
Persiapan Sampel Benih Jagung Manis dan Isolat P. stewartii subsp. stewartii Sampel berupa benih jagung manis diambil dari kios pertanian. Benih jagung manis yang didapat dikumpulkan (400 benih) dan dikomposit serta dijadikan sampel uji (100 benih). Isolat bakteri P. stewartii subsp. stewartii yang digunakan merupakan koleksi dari Laboratorium Bakteriologi, Departement Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Isolat Bakteri diperbanyak di media Yeast Dextrosa Carbonat Agar (YDCA) dan Nutrient Broth
(NB).
Pengayaan bakteri P. stewartii subsp. stewartii dilakukan dengan mengambil satu koloni tunggal bakteri pada media YDCA umur 48 jam kemudian dimasukan ke dalam 500 ml media NB dan dihomogenkan. Suspensi bakteri pada media NB yang telah homogen diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 110 rpm selama 24 jam (Rahma 2013).
Pengaruh Perlakuan Fisik dan Kimiawi terhadap Vigor dan Daya Berkecambah Benih Jagung Manis
Perlakuan fisik yang dilakukan antara lain perlakuan microwave, air panas, dan panas kering. Perlakuan kimiawi dilakukan dengan menggunakan bakterisida berbahan aktif streptomisin sulfat (Agrept 20WP).
Perlakuan Microwave. Sampel uji benih jagung manis sebanyak 100 butir dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditempatkan dalam microwave oven 2450 MHz (Zhang et al. 2006 dan Friezen 2014). Benih jagung selanjutnya dipaparkan dengan panas microwave selama 0, 5, 10, 15, 20, 25, dan 30, 60, 70, dan 80 detik. Setelah itu, benih jagung diletakkan pada suhu ruang.
Perlakuan Air Panas. Sampel uji benih jagung manis sebanyak 100 butir dimasukkan ke dalam kain strimin. Benih selanjutnya direndam pada air (suhu 38 sampai 41 °C) selama 5 sampai 10 menit, kemudian ditempatkan dalam water bath pada suhu 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, dan 70 °C selama 30 menit. Benih kemudian diangkat dan direndam pada air suhu 27 sampai 30 °C, dan air dingin selama 10 menit selanjutnya dikeringkan. Sebagai kontrol benih direndam pada suhu ruang (tidak dilakukan pemanasan).
Perlakuan Panas Kering. Sampel uji benih jagung manis sebanyak 100 butir dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditempatkan dalam oven dengan suhu 40, 45, 50, 60, dan 70 °C selama 24 jam selanjutnya didiamkan pada suhu ruang selama 60 menit. Sebagai kontrol benih tidak dilakukan pemanasan (pada suhu ruang).
Perlakuan Bakterisida. Sampel uji benih jagung manis sebanyak 100 butir dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi larutan bakterisida bahan aktif streptomisin sulfat konsentrasi 0 (kontrol), 25, 50, 100, 150, 200, 400, 600, dan 800 ppm selama 20 menit. Benih jagung yang sudah direndam selanjutnya ditiriskan dan dikeringanginkan.
Pengaruh Perlakuan Fisik dan Kimiawi terhadap Populasi P. stewartii subsp. stewartii (in vitro)
Perlakuan Microwave. Suspensi bakteri P. stewartii subsp. stewartii (OD = 0.4, 600 nm) dimasukkan ke dalam tabung ependorf sebanyak 1 ml, kemudian ditempatkan dalam microwave oven 2450 MHz (Zhang et al. 2006; Friezen 2014). Suspensi bakteri selanjutnya dipaparkan dengan panas microwave selama 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 60, 70, dan 80 detik kemudian diletakan pada suhu ruang. Suspensi bakteri dibuat seri pengenceran dengan larutan NaCl 0.8% sebagai pelarutnya. Sebanyak 100 µl suspensi bakteri disebar pada media YDCA dengan menggunakan glass beads steril kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan menghitung koloni bakteri yang tumbuh pada media untuk mengetahui kepadatan populasinya.
Perlakuan Air Panas. Suspensi bakteri P. stewartii subsp. stewartii (OD = 0.4, 600 nm) dimasukkan ke dalam tabung ependorf sebanyak 1 ml. Suspensi bakteri direndam pada air (suhu 38 sampai 41 °C) selama 5 sampai 10 menit, kemudian ditempatkan dalam water bath pada suhu 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, dan 70 °C selama 30 menit. Suspensi bakteri selanjutnya diangkat dan direndam pada air suhu 27 sampai 30 °C, dan air dingin selama 10 menit. Sebagai kontrol suspensi bakteri tidak dilakukan pemanasan (pada suhu ruang). Suspensi bakteri dibuat seri pengenceran dengan larutan NaCl 0.8% sebagai pelarutnya. Sebanyak 100 µl suspensi bakteri disebar pada media YDCA dengan menggunakan glass
beads steril kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Pengamatan
dilakukan dengan menghitung koloni bakteri yang tumbuh pada media untuk mengetahui kepadatan populasinya.
Perlakuan Panas Kering. Suspensi bakteri P. stewartii subsp. stewartii
(OD = 0.4, 600 nm) dimasukkan ke dalam tabung ependorf sebanyak 1 ml, ditempatkan dalam oven dengan suhu 40, 45, 50, 60, dan 70 °C selama 24 jam setelah itu didiamkan pada suhu ruang selama 60 menit. Sebagai kontrol suspensi bakteri tidak dilakukan pemanasan (pada suhu ruang). Suspensi bakteri dibuat seri pengenceran dengan larutan NaCl 0.8% sebagai pelarutnya. Sebanyak 100 µ l suspensi bakteri disebar pada media YDCA dengan menggunakan glass beads
steril kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan menghitung koloni bakteri yang tumbuh pada media untuk mengetahui kepadatan populasinya.
Perlakuan Bakterisida. Suspensi bakteri P. stewartii subsp. stewartii (OD = 0.4, λ = 600 nm) sebanyak 100 µl dimasukkan kedalam 5 ml media nutrient
broth kemudian ditambahkan 100 µ l larutan bakterisida konsentrasi 25, 50, 100,
150, 200, 400, 600, dan 800 ppm. Sebagai kontrol media nutrient broth hanya diberi suspensi bakteri saja. Larutan selanjutnya diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 24 jam dengan kecepatan 110 rpm. Pengamatan dilakukan dengan menghitung nilai OD dengan spektrometer untuk mengetahui kepadatan populasinya.
Pengamatan
Benih Jagung Manis. Benih yang sudah diberi perlakuan ditanam pada nampan plastik berukuran 20 cm x 30 cm yang telah dilapisi kertas saring yang telah dibasahi dengan air steril. Pengamatan dilakukan terhadap vigor dan daya berkecambah benih berdasarkan Sadjad et al. (1999) dan ISTA (2014).
1) Daya Berkecambah (DB)
Ditentukan dengan menghitung persentase berkecambah normal (KN) hitungan pertama yaitu 5 hari setelah tanam (HST) dan hitungan kedua (7 HST).
DB = KN hitungan I + KN hitungan II
benih yang ditanam x 100%
2) Vigor (V)
Dihitung dari persentase berkecambah normal pada pengamatan 4 HST.
IV = KN 4 HST
benih yang ditanam x 100%
P. stewartii subsp. stewartii. Suspensi bakteri yang telah diberi perlakuan fisik (microwave, air panas, dan panas kering) dibuat pengenceran berseri dengan larutan NaCl 0.8% sebagai pelarutnya. Sebanyak 100 µl suspensi bakteri disebar pada media YDCA dengan menggunakan glass beads steril kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan menghitung koloni bakteri yang tumbuh pada media untuk mengetahui kepadatan populasinya. Kepadatan populasi bakteri dihitung dengan rumus :
Pb = Jk
P x V
Keterangan:
Pb : Populasi bakteri (cfu/ml)
Jk : Jumlah koloni pada pengenceran ke-n
P : Pengenceran ke-n
V : Volume suspensi bakteri hasil pengenceran yang disebar (ml)
Kepadatan populasi P. stewartii subsp. stewartii setelah diberi perlakuan kimiawi dengan menggunakan bakterisida berbahan aktif streptomisin sulfat dilakukan dengan menghitung nilai optical density suspensi tersebut dengan spektrometer pada panjang gelombang 600 nm.
Analisis Data
Masing-masing perlakuan pada percobaan I terdiri atas 4 ulangan. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan Microsoft Excel 2007 dan dibuat grafik hubungan antara dosis perlakuan (waktu pada perlakuan microwave, suhu pada perlakuan air panas dan panas kering, serta konsentrasi pada perlakuan bakterisida) dengan viabilitas benih jagung manis (daya berkecambah) dan populasi bakteri P. stewartii subsp. stewartii (Forsberg 2004). Perlakuan yang memiliki treatment window dapat dilanjutkan untuk perlakuan pada benih yang terinfeksi P. stewartii subsp. stewartii.
Percobaan II
Perlakuan Fisik dan Kimiawi pada Benih Terinfeksi P. stewartii subsp. stewartii
Persiapan Sampel Benih Terinfeksi
Benih terinfeksi diperoleh dari inokulasi buatan dengan cara merendam benih jagung manis di dalam suspensi bakteri P. stewartii subsp. stewartii (Zainal
et al. 2010). Benih disterilisasi permukaan dengan larutan NaOCl 1% selama 2
menit, kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 2 kali. Benih yang telah disterilisasi permukaan direndam dalam suspensi bakteri P. stewartii subsp.
stewartii pada media Nutrient Broth usia 24 jam (OD 0.4, λ = 600 nm) selama 30
menit. Benih yang telah di rendam ditiriskan dan dikeringanginkan selama 24 jam. Perlakuan pada Benih Terinfeksi
Perlakuan Air Panas. Sampel uji benih jagung manis terinfeksi P.
stewartii subsp. stewartii sebanyak 100 butir dimasukkan ke dalam kain strimin.
Benih selanjutnya direndam pada air (suhu 38 sampai 41 °C) selama 5 sampai 10 menit, kemudian ditempatkan dalam penangas air pada suhu 50, 53, dan 55 °C selama 30 menit. Benih kemudian diangkat dan direndam pada air suhu 27 sampai 30 °C, dan air dingin selama 10 menit, selanjutnya dikeringkan. Sebagai kontrol benih direndam pada suhu ruang (tidak dilakukan pemanasan).
Perlakuan Panas Kering. Sampel uji benih jagung manis terinfeksi P.
stewartii subsp. stewartii sebanyak 100 butir dimasukkan ke dalam cawan petri.
Benih tersebut kemudian ditempatkan dalam oven dengan suhu 40, 45, 50, dan 60 °C selama 24 jam, setelah itu didiamkan pada suhu ruang selama 60 menit. Sebagai kontrol benih tidak dilakukan pemanasan (pada suhu ruang).
Perlakuan Bakterisida. Sampel uji benih jagung manis terinfeksi P.
stewartii subsp. stewartii sebanyak 100 butir dimasukkan ke dalam erlenmeyer
yang berisi larutan bakterisida bahan aktif streptomisin sulfat konsentrasi 0 (kontrol), 25, 50, 100, 150, dan 200 ppm selama 20 menit. Benih jagung yang sudah direndam kemudian ditiriskan dan dikeringanginkan.
Pengamatan
Benih Jagung Manis. Benih yang sudah diberi perlakuan ditanam pada nampan plastik berukuran 20 cm x 30 cm yang telah diberi pasir steril. Pengamatan dilakukan terhadap vigor dan daya berkecambah benih, seperti pada tahap sebelumnya.
P. stewartii subsp. stewartii. Populasi bakteri P. stewartii subsp. stewartii
yang terdapat dalam benih (in vivo) dihitung berdasarkan jumlah koloni yang dibentuk pada media YDCA untuk setiap g benih (cfu/g). Benih jagung manis yang telah diberi perlakuan diekstraksi dengan 10 larutan NaCl 0.8%. Sebanyak 100 µ l suspensi disebar pada media YDCA dengan menggunakan glass beads
steril kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Pengamatan dilakukan dengan menghitung koloni bakteri yang tumbuh pada media untuk mengetahui kepadatan populasinya. Kepadatan populasi bakteri per g benih dihitung dengan rumus :
Pb = Jk x Vpl P x V x Bb Keterangan:
Pb : Populasi bakteri (cfu/g benih)
Jk : Jumlah koloni pada pengenceran ke-n
Vpl : Volume pelarut / larutan NaCl 0.8% yang digunakan untuk mengekstraksi benih terinfeksi (ml)
Bb : Berat benih terinfeksi yang diekstraksi (g) P : Pengenceran ke-n
V : Volume suspensi bakteri hasil pengenceran yang disebar (ml) Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan Minitab versi 16. Rancangan percobaan pada pengujian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan masing-masing perlakuan sebanyak 4 ulangan. Data dianalisis dengan analisis ragam (ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji Tukey taraf 1%.
Percobaan III
Kombinasi Perlakuan Fisik dan Kimawi pada Benih Terinfeksi P. stewartii subsp. stewartii
Kombinasi perlakuan bakterisida dengan panas kering dilakukan dengan merendam benih pada larutan bakterisida konsentrasi 25, 50, dan 100 ppm selama 20 menit sebelum dan setelah perlakuan panas kering suhu 45, 50, dan 55 °C selama 24 jam.
Pengamatan
Benih Jagung Manis. Benih yang sudah diberi perlakuan ditanam pada nampan plastik berukuran 20 cm x 30 cm yang telah diberi pasir steril. Pengamatan dilakukan terhadap vigor dan daya berkecambah benih, seperti pada tahap sebelumnya.
P. stewartii subsp. stewartii. Populasi bakteri P. stewartii subsp. stewartii
yang terdapat dalam benih (in vivo) dihitung berdasarkan jumlah koloni yang dibentuk pada media YDCA untuk setiap g benih (cfu/g). Benih jagung manis yang telah diberi perlakuan diekstraksi dengan 10 larutan NaCl 0.8%. Sebanyak 100 µ l suspensi disebar pada media YDCA dengan menggunakan glass beads
steril, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Pengamatan dilakukan dengan menghitung koloni bakteri yang tumbuh pada media untuk mengetahui kepadatan populasinya.
Analisis Data
Data dianalisis menggunakan Minitab versi 16. Rancangan percobaan pada pengujian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial. Faktor pertama adalah aplikasi bakterisida bahan aktif streptomisin sulfat, faktor kedua adalah konsentrasi bakterisida bahan aktif streptomisin sulfat, dan faktor ketiga adalah suhu perlakuan panas kering dengan masing-masing perlakuan sebanyak 4 ulangan. Data dianalisis dengan analisis ragam (ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji Tukey taraf 1%.