Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan yang dimulai pada bulan April sampai dengan November 2014.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah materi genetik DNA dari Siagian (2014) pada tiga populasi alami tanaman aren hasil koleksi dari berbagai lokasi di Sulawesi Tenggara, dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Daftar koleksi aren yang digunakan untuk analisis RAPD Lokasi Aksesi Kode Aksesi No. Jumlah Aksesi Letak Geografis Konawe Selatan P 1-4 4 121°58’ - 123°16 BT 3.58° - 4.31° LS Kendari K 5-19 15 3º54’30” - 4º3’11” LS 122º23’ - 122º39’ Konawe BT S 20-27 8 121°73' – 123°15' 3°00' – 4°25' LS Total BT 27
Bahan kimia yang digunakan adalah CTAB 5%, NaCl, Tris, HCl, NaOH, isopropanol, EDTA, Asam Asetat Glasial, agarose, Ethidium Bromide (EtBr),
kloroform, isoamilalkohol, β-Mercaptoethanol, PVPP, etanol 70%, etanol absolut,
DNA Marker Ladder I Kb, Go Taq ® Green Master Mix, nitrogen cair, loading
dye, aquades, aquabidestila dan 10 primer (OPN 03, OPC 12, OPD 03, OPD 13, OPD 16, OPH 09, OPB 07, OPH 12, OPH 13 dan SB 19). Urutan basa dari masing-masing primer dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Urutan basa primer dari sepuluh primer yang digunakan
No Nama Primer Urutan Basa (5’ – 3’)
1 OPN 03 5' GGTACTCCCC 3' 2 OPC 12 5' TGTCATCCCC 3' 3 OPD 03 5' GTCGCCGTCA 3' 4 OPD 13 5' GGGGTGACGA 3' 5 OPD 16 5' AGGGCGTAAG 3' 6 OPH09 5' TGTAGCTGGG 3' 7 OPB 07 5' GGTGACGCAG 3' 8 OPH 12 5' ACGCGCATGT 3' 9 OPH 13 5' GACGCCACAC 3' 10 SB 19 5' CAGCACCCAC 3'
Peralatan yang digunakan antara lain adalah Global Positioning System
(GPS), gunting, mesin PCR, pipet mikro (1 – 10 μl, 2 – 200 μl, 100 – 1000 μl),
tips (1 ml, 200 µl, 10 µl), tube (2 ml, 1,5 ml, 100 µl), vortex, waterbath, pH meter elektrik, perangkat elektroforesis, timbangan analitik, oven, nanophotometer, UV
transluminator, lemari es, unit gel dokumentasi, sentrifus, erlenmeyer, botol
scout, masker, sarung tangan, alat tulis dan sebagainya.
Metode
Isolasi DNA Tanaman Aren
Isolasi DNA pada penelitian ini berdasarkan pada metode isolasi berbasis CTAB menurut prosedur Orozco-Castillo et al (1994) yang dimodifikasi dengan penambahan β-Mercaptoethanol dan PVPP (Toruan dan Hutabarat, 1997).
Isolasi DNA dilakukan terhadap daun tanaman aren yang telah diambil dari beberapa lokasi di Sulawesi Tenggara. Tahapan isolasi yang dilakukan adalah daun aren dibuang tulang daunnya lalu dicuci dan dikeringkan dengan tisu. Sebanyak 0.2 gram daun aren digerus menggunakan mortar sambil ditambahkan nitrogen cair dan PVPP. Setelah halus, sampel dimasukkan ke dalam tabung
tabung dikocok menggunakan vortex lalu tabung diinkubasi dalam waterbath
pada suhu 650
Tabung disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan pada tabung sentrifus lain, lalu 1 ml kloroform:isoamilalkohol (24:1) ditambahkan ke dalam tabung lalu tabung dikocok menggunakan vortex dan tabung disentrifus lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan lalu 1 ml isopropanol dingin ditambahkan ke dalam tabung. Supernatan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung lalu tabung disimpan dalam lemari es (4
C selama 30 menit. Setiap 10 menit sekali tabung dibolak balik dengan perlahan-lahan. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu ruang selama 4-5 menit lalu 1 ml kloroform:isoamilalkohol (24:1) ditambahkan ke dalam tabung.
0C) selama satu malam kemudian tabung disentrifus kembali dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 40
Kemudian etanol absolut dingin ditambahkan lalu dibolak-balik hingga homogen. Setelah itu, supernatan diinkubasi dalam freezer (-20
C selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang kemudian pelet dikeringanginkan. Pelet yang sudah kering dilarutkan dengan bufer TE sebanyak 100 µl kemudian tabung dispin manual hingga homogen.
0C) selama 30 menit kemudian supernatan disentrifus lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit. Supernatan dibuang sedangkan pelet dicuci menggunakan etanol 70% dan pelet dikeringanginkan. Pelet DNA yang sudah kering dilarutkan dengan 100 µl bufer TE. Simpan DNA dalam freezer (-200C).
Uji Kualitas DNA
Gel agaros 0.8% dibuat dari 0.28 gram agaros dan 35 ml larutan bufer TAE 1x. kemudian dipanaskan hingga larut dengan menggunakan hot plate dan didinginkan pada suhu kamar hingga hangat. Selanjutnya, ditambahkan 0.5 µl EtBr dan dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis yang telah dipasang sisir (cetakan sumur) hingga gel memadat. Gel yang sudah padat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis, kemudian tuang TAE 1x ke dalam bak elektroforesis. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur dengan loading dye dengan perbandingan 5:1 (DNA: loading dye). Setelah tercampur maka diinjeksi ke dalam sumur gel agaros menggunakan pipet mikro. Setelah semua sampel selesai diinjeksi maka alat elektroforesis dihubungkan pada power supply yang dialiri tegangan listrik 80 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan lampu UV
transilluminator dan didokumentasikan menggunakan gel documentation.
Uji Kuantitas DNA
Pengujian dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometri. Larutan stok DNA diambil sebanyak 2 µl, kemudian alat dijalankan. Absorbansi (A) diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Tingkat kemurnian DNA ditentukan dengan nilai perbandingn A260/A280. Menurut Wilson dan Walker (2010), sampel DNA murni akan menghasilkan rasio A260/A280 berkisar 1.8-2.0. Nilai kemurnian yang lebih dari 2.0 menunjukkan bahwa sampel mengandung kontaminan RNA, sedangkan nilai kemurnian yang kurang dari 18 menunjukkan bahwa sampel mengandung kontaminan protein.
RAPD DNA Pohon Aren
Pembuatan master mix PCR dilakukan dalam tabung mikro dengan komposisi untuk satu kali reaksi dengan total volume 25 µl antara lain Go Taq
PCR 12.5 µl, nuclease free water 9.5 µl, primer 1 µl dan DNA sampel 2 µl dengan konsentrasi DNA sebesar 10 µg/ml. Proses amplifikasi dilakukan menggunakan mesin PCR. Program running PCR sebanyak 45 siklus dengan reaksi: predenaturasi 940C selama 2 menit, denaturasi 940C selama 1 menit,
annealing 360C selama 1 menit, extension 720C selama 2 menit, post extension
720C selama 10 menit, dan kondisi akhir PCR 40C (Setiyo, 2001).
Elektroforesis Hasil Amplifikasi
Elektroforesis hasil amplifikasi dilakukan menggunakan gel agaros 1%. Gel dibuat dengan melarutkan 1.3 gram agaros pada 130 ml bufer TAE 1x, kemudian dipanaskan hingga larut dengan menggunakan hot plate dan didinginkan pada suhu kamar hingga hangat. Selanjutnya, ditambahkan 1.5 µl EtBr dan dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis yang telah dipasang sisir (cetakan sumur) hingga gel memadat. Gel yang sudah padat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis, kemudian tuang bufer TAE 1x ke dalam bak elektroforesis. Marker yang digunakan adalah 1 kb DNA ladder sebanyak 5 µl dicampur dengan
loading dye sebanyak 2 µl. Sampel hasil PCR sebanyak 8 µl dan marker yang
telah dicampur dengan loading dye diinjeksi ke dalam sumur gel agaros menggunakan pipet mikro. Setelah semua sampel selesai diinjeksi maka alat elektroforesis dihubungkan pada power supply yang dialiri tegangan listrik 100 volt selama 65 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan lampu UV
Analisis Data
Pola pita yang muncul pada gel diterjemahkan ke dalam data biner dengan skoring manual. Setiap pita mewakili satu karakter dan diberi nilai berdasarkan ada tidaknya pita. Angka satu “1” untuk pita yang terbentuk dan angka nol “0” untuk pita yang tidak terbentuk.
Polymorphic Information Content (PIC) untuk beberapa marker dihitung
dengan menggunakan rumus:
PICi = 2fi (1-fi
Dimana:
)
PICi
f
= Polymorphic Information Content (PIC) pada marker
i
(1-f
= frekuensi dari pita primer yang muncul
i
Nilai PIC untuk dominan marker seperti RAPD memiliki nilai maksimum yaitu 0.5 untuk f
) = frekuensi dari pita yang tidak muncul
i
Untuk melihat persentase pita polimorfik menggunakan rumus berikut ini: = 0.5 (Ma et al, 2013).
% Pita Polimor�ik=∑ lokusyangpolimor�ik ∑ ������������� x 100
Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari keragaman : (1) Principal Coordinates Analysis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan (ii) Neighbour-Joining Tree (NJtree) berdasarkan Saitou dan Nei (1978) untuk memperoleh gambaran dari kekerabatan diantara individu-individu. Perhitungan dan analisis deskriptif ini menggunakan software DARwin 5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2009).
