Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Hama Departemen Ilmu Hama dan Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan. Dengan ketinggian tempat ± 25 m di atas permukaan laut. Dilaksanakan mulai bulan Oktober sampai selesai.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanah, air, jamur entomopatogen M. anisopliae dan C. militaris, tandan kosong kelapa sawit, larva
O. rhinoceros instar ke 3, PDA, jagung, alkohol, aquadest, jagung halus, larutan
Bouin, xilol, paraffin, Eosin, balsam kanada dan bahan pendukung lainnya.
Alat-alat yang digunakan adalah stoples plastik, kain kasa, kertas label, tisu, karet gelang, mikroskop, gelas ukur, petridis, timbangan, Haemocytometer, jarum ose, bunsen, cling wrap, aluminium foil, erlenmeyer, objek glass, autoclave, pisau, plastik kecil, alat tulis, dan alat-alat pendukung lainnya.
Metode Penelitian
Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) nonfaktorial, dengan perlakuan:
A₀ : Tanpa Perlakuan (Kontrol)
A₂ : Diaplikasikan jamur M. anisopliae pada 15 gr media jagung/ stoples A₃ : Diaplikasikan jamur M. Anisopliae pada 20 gr media jagung/ stoples A₄ : Diaplikasikan jamur C.militaris pada 10 gr media jagung / stoples A₅ : Diaplikasikan jamur C.militaris pada 15 gr media jagung/ stoples A₆ : Diaplikasikan jamur C.militaris pada 20 gr media jagung / stoples Keterangan: Setiap stoples terdapat 5 larva O. rhinoceros instar ke-3. Masing-masing perlakuan terdiri dari 4 ulangan, dengan rumus: (t-1) (r-1) ≥ 15 (7-1) (r-1) ≥ 15 6 (r-1) ≥ 15 6 r – 6 ≥ 15 6 r ≥ 21 r ≥ 3,5 r ≥ 4
Jumlah Perlakuan : 7 Perlakuan Jumlah ulangan : 4 Ulangan
Jumlah unit Percobaan : 28 Unit Percobaan
Model linier yang digunakan adalah sebagai berikut: Yij = µ + αi + βj + ∑ij
Yij = Respon atau nilai pengamatan pada perlakuan ke-i dan kelompok ke-j. µ = Nilai tengah umum
αi = Nilai pengamatan pengaruh perlakuan ke-i βj = Nilai pengamatan pengaruh kelompok ke-j
∑ij = Efek eror karena pengaruh perlakuan pada taraf ke-i dan peda ulangan ke-j
Apabila hasil analisa sidik ragam menunjukkan nilai berbeda nyata dilanjutkan dengan Uji Jarak Duncan.
Persiapan Penelitian
a. Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)
Media PDA digunakan untuk mengembangbiakkan jamur entomopatogen. Media ini dibuat dengan cara: kentang dikupas dan dicuci bersih lalu ditimbang 250 gr, dipotong dadu berukuran 1 – 2 cm, kemudian kentang dimasak dengan aquades 500 ml selama 30 menit, lalu disaring ekstraknya dengan kain muslin sampai volume 500 ml. Kemudian dextrose dimasukkan sebanyak 20 gr dan agar sebanyak 20 gr ke dalam beaker glass, ditambahkan aquades kedalamnya sebanyak 500 ml, aduk sampai merata. Masukkan ekstrak kentang yang telah disaring tadi (500 ml) kedalam laruran dextrose + agar, aduk hingga homogen dan dididihkan selama 30 menit. Setelah itu masukkan ke dalam Erlenmeyer masing – masing 200 ml. Selanjutnya Erlenmeyer ditutup dengan kapas steril dan aluminium foil lalu balut dengan cling wrap atau isolasi. Selanjutnya masukkan ke dalam autoclave untuk disterilkan selama 30 menit dengan suhu 1210C pada tekanan 1,5 atm.
b. Pembuatan Media Jagung
Media jagung digunakan untuk perbanyakan jamur entomopatogen setelah terlebih dahulu dibiakkan pada media PDA. Media jagung digunakan untuk
mempermudah aplikasi jamur entomopatogen (yaitu dengan menaburkan media jagung yang telah ditumbuhi jamur entomopatogen, dimana dosis media jagung yang digunakan sesuai dengan perlakuan masing-masing). Media jagung ini dibuat dengan cara: merendam jagung selama satu jam, kemudian membuang jagung yang mengapung. Setelah itu jagung ditimbang dan dimasukkan ke dalam plastik. Jagung yang telah terbungkus sesuai dosis perlakuan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterilkan selama 30 menit dengan suhu 1210C pada tekanan 1,5 atm.
c. Penyediaan Jamur Entomopatogen
Jamur yang digunakan dalam penelitian ini adalah M. anisopliae yang diisolasi dari larva O. rhinoceros yang terserang M. anisopliae. M. anisopliae terlebih dahulu dibiakkan dalam media PDA sebagai biakan murni. Setelah tumbuh kemudian M. anisopliae dibiakkan kembali pada media jagung dengan cara memasukkan sedikit jamur entomopatogen yang telah murni ke dalam jagung yang telah disterilkan.
Sebelum aplikasi terlebih dahulu dihitung kerapatan konidia per gram media jagung dengan menggunakan alat haemocytometer. Penghitungan konidia dilakukan dengan cara: mengambil sedikit jamur yang telah tumbuh pada media jagung (± 1 gram jamur + 9 ml air steril), kemudian dishaker selama setengah jam. Setelah itu cairan tersebut dimasukkan kedalam ruang-ruang haemocytometer dan kemudian ditutup dengan kaca penutup. Setelah itu konidia telah dapat dihitung di bawah mikroskop dengan menggunakan rumus
kotak haemocytometer yang dihitung, d = faktor pengencer, n = jumlah kotak bujur sangkar yang diamati, 0.25 = konstanta. Setelah kerapatan konidia mencapai 107 per gram media jagung, maka jamur entomopatogen telah dapat diaplikasikan untuk mengendalikan larva O. rhinoceros. Konsentrasi konidia dalam biakan M.
anisopliae yang baik adalah mengandung 500 juta ( 5 x 108 ) konidia atau lebih dalam setiap gram jagung (Mahmud, 1989).
Sedangkan jamur C.militaris yang digunakan diperoleh dari PPKS Lonsum. Dimana jamur tersebut telah tersedia dalam bentuk biakan murni, yang kemudian akan dibiakkan lagi guna perbanyakan. Setelah itu diperlakuan sama dengan jamur M.anisopliae, seperti dibiakkan lagi pada media jagung dan dihitung kerapatan konidianya sebelum aplikasi.
d. Persiapan Media Perlakuan
Wadah media perlakuan yang digunakan berupa stoples, dimana tinggi stoples tersebut adalah 12.5 cm, diameter 13.5 cm dan volume stoples 1788.32 cm3(π r 2
x t). Stoples kemudian diisi dengan makanan larva O. rhinoceros yang berupa tandan kosong kelapa sawit yang diambil dari lapangan. Dimana sebelumnya media makanan (tandan kosong kelapa sawit) tersebut telah disterilkan dengan cara di rebus selama satu jam. Setelah itu media makanan (tandan kosong kelapa sawit yang telah steril) dimasukkan kedalam stoples, dengan tinggi media makanan dalam stoples adalah 5 cm dan volume media makanan adalah 715.33 cm3 (π r 2
x t). Media tersebut disediakan sebanyak 28 stoples. Bersama dengan stoples disediakan juga kain kasa dan karet gelang yang digunakan untuk menutup bagian atas stoples.
e. Penyediaan Larva Serangga Uji
Larva O. rhinoceros diambil dari lapangan sebanyak 140 larva instar ke-3 yang sehat. Kemudian larva dimasukkan ke dalam stoples, dimana tiap stoples berisi 5 larva. Sebagai makanannya dimasukkan juga tandan kosong kelapa sawit yang telah disterilkan sebelumnya, dimasukkan ke stoples 1 hari sebelum larva dimasukkan ke dalam stoples. Setelah itu stoples ditutup dengan kain kasa.
Pengaplikasian
Pengaplikasian jamur M. anisopliae dan C.militaris dilakukan dengan cara menaburkan jamur yang telah tumbuh pada media jagung kemudian dicampurkan dengan media makan larva O.rhinoceros, dimana dosis yang digunakan sesuai dengan perlakuan masing-masing. Aplikasi jamur entomopatogen ini dilakukan hanya satu kali saja pada media makan larva O. rhinoceros yaitu satu hari sebelum larva dimasukkan ke dalam media yang telah disediakan. Pengeplikasian jamur pada media makan dikarenakan cara jamur entomopatogen memasuki tubuh serangga inang lalu menginfeksinya melalui dua cara, yaitu yang pertama ketika serangga inang menelan individual patogen selama proses makan (passive entry), dan yang kedua ketika patogen melakukan penetrasi langsung ke kutikula serangga (active entry) (Priyanti, 2009).
Peubah Pengamatan
a. Persentase Mortalitas Larva
Pengamatan mortalitas larva dilakukan setiap hari setelah aplikasi. Pengamatan tersebut dilakukan dengan menghitung jumlah larva yang mati dan kemudian dihitung mortalitas larva. Persentase mortalitas larva dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
P = x100% b a a + Keterangan:
P = Persentase mortalitas larva a = Jumlah larva yang mati
b = Jumlah larva yang masih hidup
b. Persentase Waktu Munculnya Koloni Jamur Uji Pada Larva O. rhinoceros Yang Terinfeksi
Pengamatan terhadap waktu munculnya koloni jamur entomopatogen pada larva yang terinfeksi dilakukan setiap hari setelah aplikasi. Pengamatan tersebut dilakukan dengan cara melihat dan menghitung larva yang disekitar tubuhnya ditumbuhi oleh koloni jamur entomopatogen. Dimana warna koloni akan berbeda sesuai dengan warna spora jamur yang menginfeksi. Persentase waktu kemunculan koloni jamur entomopatogen pada tubuh larva yang trinfeksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
P = x100%
d c
c
Keterangan:
P = Persentase larva yang telah ditumbuhi koloni jamur entomopatogen c = Jumlah larva yang telah ditumbuhi koloni jamur entomopatogen d = Jumlah larva yang tidak ditumbuhi koloni jamur entomopatogen
c. Gejala Serangan Larva O. rhinoceros Yang Terinfeksi Jamur Entomopatogen
Pengamatan dilakukan setiap hari setelah jamur M. anisopliae dan
C. militaris dipalikasikan ke larva O. rhinoceros. Diamati gejala yang timbul pada
larva yang terinfeksi oleh jamur entomopatogen. Larva yang terinfeksi akan mengalami mumifikasi dan akan muncul koloni jamur disekitar tubuhnya, dimana warna koloni jamur sesuai dengan warna koloni jamur yang menginfeksinya.
d. Foto Mikrograf Jaringan Larva O. rhinoceros Yang Terinfeksi Jamur Entomopatogen
Foto mikrograf jaringan larva yang terinfeksi jamur entomopatogen dapat dilakukan pada larva yang telah mati dan telah menunjukkan gejala dari serangan jamur. Adapun metodologi yang dilakukan adalah sebagai berikut:
- Fiksasi
Diambil larva yang telah terinfeksi dan direndam dalam larutan Bouin selama 24 jam.
- Pencucian dan Dehidrasi
Fiksatif dibuang, dan spesimen kembali direndam dalam alkohol 70, 80, 95 dan 100% selama masing-masing 30 menit.
Alkohol dibuang dan larutan diganti berturut-turut dengan campuran alkohol / xilol dengan perbandingan 3:1, 1:1, dan 1:3 selama masing-masing 30 menit. Kemudian direndam dalam larutan xilol selama 24 jam.
Spesimen tersebut kemudian direndam kembali pada larutan xilol / parafin dengan perbandingan berturut-turut 3:1, 1:1, dan 1:3 selama masing-masing 1 jam dengan temperatur 570C.
- Infiltrasi
Campuran xilol / parafin dibuang, dan diganti dengan parafin murni selama satu jam.
- Penyelubungan
Parafin dibuang, diganti dengan parafin yang baru. Setelah ± 1 jam dibuat blok, yaitu dengan menempel spesimen pada blok kayu.
- Pengirisan
Dibuat irisan-irisan spesimen dengan rotary microtome dengan ketebalan tertentu.
- Perekatan
Irisan spesimen dilekatkan pada objek glass, kemudian diletakkan di atas hot plate dengan temperatur 450C sampai parafin mencair. Setelah itu didingin anginkan dan dibersihkan dengan larutan xilol.
- Pewarnaan
Pewarnaan spesimen dilakukan dengan menggunakan zat warna Eosin 4-5 ml. Berturut-turut objek glass dimasukkan kedalam larutan xilol I dan xilol II masing-masing selama 3 menit. Kemudian dimasukkan ke dalam larutan alkohol /
xilol berturut-turut dengan perbandingan 1:3, 1:1, dan 3:1 selama masing-masing 3 menit.
Spesimen kemudian dimasukkan berturut-turut kedalam larutan alkohol absolut I dan alkohol absolut II selama masing-masing 3 menit. Kemudian spesimen direndam lagi menggunakan alkohol 95, 80, 60, 40, dan 20%, berturut-turut selama 3 menit. Kemudian direndam dalam aquades selama 3 menit.
Spesimen kembali direndam dalam Eosin selama 2 jam. Setelah itu dicuci dengan merendamnya ke dalam aquades selama 3 menit. Kemudian spesimen kembali direndam berturut-turut ke dalam alkohol 20, 40, 60, 80, dan 95% selama masing-masing 3 menit. Setelah itu direndam ke dalam alkohol absolut I dan alkohol absolut II selama 3 menit.
Spesimen direndam dalam alkohol / xilol dengan perbandingan berturut-turut 3:1, 1:1, dan 1:3 selama masing-masing 3 menit. Setelah itu spesimen direndam dalam larutan xilol I dan xilol II masing-masing 3 menit.
- Penutupan
Irisan spesimen yang telah diwarnai ditutup dengan gelas penutup kemudian diberi balsam kanada terlebih dahulu. Setelah itu dibersihkan dengan xilol.
- Pengamatan
Spesimen telah dapat diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 10 x 40. Dan telah dapat difoto jaringannya.