BAB III METODE PENELITIAN
3.2 Bahan-bahan
Sampel yang digunakan adalah herba seledri daun (Apium graveolens L. var. secalinum alef) dan sediaan jamu herba seledri yang beredar di pasaran (Gambar dapat dilihat pada Lampiran 20, halaman 66 dan Lampiran 21, halaman 67).
3.2.2 Pereaksi
Semua bahan yang digunakan dalam penelitian ini berkualitas pro analis keluaran E. Merck yaitu tembaga (II) sulfat, asam sulfat 96%-97%, natrium hidroksida, kalium natrium tartrat, perak nitrat, ammonium hidroksida, natrium fosfat, ammonium molibdat kecuali aquadest (CV. Rudang Jaya) dan vitamin C (CSPC Weisheng Pharmaceutical CO., Ltd.)
3.3Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spektrofotometer UV-Visible (Shimadzu Mini 1240), alat-alat gelas, blender (Kris), neraca analitik (Boeco), spatula, termometer, penangas air dan stopwatch.
3.4Pembuatan Pereaksi
3.4.1 Pereaksi Ag Ammoniakal
Larutkan 3 g AgNO3 dengan 30 ml aquadest (larutan A) dan 3 g NaOH
dengan 30 ml aquadest (larutan B). Kemudian campurkan larutan A dan larutan B dengan perbandingan volume yang sama ke dalam tabung reaksi yang bersih, dan tambahkan larutan ammonia yang telah diencerkan setetes demi setetes hingga perak oksida larut (Vogel, 1974).
3.4.2 Pereaksi Fehling
Larutan A. Larutkan 34,64 g kristal CuSO4 dengan aquadest yang
mengandung beberapa tetes asam sulfat, dan encerkan larutan hingga 500 ml (Vogel, 1974).
Larutan B. Larutkan 60 g NaOH murni dan 173 g garam Rochelle (kalium natrium tartrat) dengan aquadest, jika perlu disaring, dan diencerkan hingga 500 ml (Vogel, 1974).
3.4.3 Pereaksi Fosfomolibdenum
Sebanyak 494,3 mg ammonium molibdat dan 459,0 mg natrium fosfat dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, dilarutkan dengan aquadest, ditambahkan 3,26 ml asam sulfat pekat, dicukupkan dengan aquadest hingga garis tanda (Prieto, et al., 1999).
3.5Prosedur Penelitian 3.5.1 Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan adalah herba seledri daun (Apium graveolens L. var. secalinum alef) yang diambil secara purposif dari Pasar Tradisional Sei
Sikambing, Medan, Sumatera Utara dan sediaan jamu herba seledri (Apium graveolens L.) dari pusat perbelanjaan Hypermart, Sun Plaza, Medan, Sumatera Utara.
3.5.2 Identifikasi Sampel
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Medanese, Bidang Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.5.3 Prosedur Maserasi Herba Seledri
Seledri dibersihkan, dipotong-potong dan dihaluskan menggunakan blender. Seledri yang telah dihaluskan, dimasukkan ke dalam wadah kaca berwarna gelap, kemudian dimaserasi dengan 1 liter aquadest. Ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, dengan disimpan di dalam lemari gelap, sambil diaduk 6 jam sekali, diambil bagian yang jernih.
3.5.4 Identifikasi Sifat Antioksidan Berdasarkan Daya Reduksi 3.5.4.1Reaksi Ag Ammoniakal
Tambahkan beberapa tetes dari larutan sampel ke dalam 2-3 ml larutan Ag ammoniakal (yang mengandung ion [Ag(NH3)2]+ di dalam tabung reaksi
yang bersih (Vogel, 1974). 3.5.4.2Reaksi Fehling
Dimasukkan 4 ml larutan Fehling yang baru dibuat (dengan mencampurkan larutan Fehling A (larutan CuSO4) dan larutan B (larutan
alkalin tartrat) dalam jumlah yang sama) ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 2-3 tetes larutan sampel dan didihkan larutan (Vogel, 1974).
3.5.5 Pengukuran Kapasitas Antioksidan
3.5.5.1Pembuatan Larutan Induk Baku Vitamin C
Ditimbang vitamin C sebanyak 100 mg kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dan dilarutkan dengan aquadest sampai garis tanda. Diperoleh konsentrasi vitamin C pada Larutan Induk Baku (LIB) I adalah 1000 µg/ml.
3.5.5.2Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Dari LIB I (1000 µg/ml) dipipet 7 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan diencerkan dengan aquadest sampai garis tanda (konsentrasi 140 µg/ml). Kemudian dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 5 ml larutan pereaksi fosfomolibdenum. Diperoleh konsentrasi vitamin C pada larutan ini adalah 12,7273 µg/ml. Kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 90ºC dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 400-800 nm.
3.5.5.3Penentuan Waktu Kerja
Dari LIB I (1000 µg/ml) dipipet 7 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan diencerkan dengan aquadest sampai garis tanda (konsentrasi 140 µg/ml). Kemudian dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 5 ml larutan pereaksi. Diperoleh konsentrasi vitamin C pada larutan ini adalah 12,7273 µg/ml. Kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 90ºC dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada
penentuan panjang gelombang maksimum mulai menit ke-21 setelah sampel diinkubasi hingga menit ke-50 dengan interval waktu 1 menit.
3.5.5.4Pengukuran Kurva Kalibrasi Vitamin C
Dari LIB I dipipet 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml dan 8 ml, masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, diencerkan dengan aquadest hingga garis tanda sehingga konsentrasi vitamin C yang diperoleh adalah 80 µg/ml, 100 µg/ml, 120 µg/ml, 140 µg/ml dan 160 µg/ml. Kemudian dipipet masing- masing 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi. Konsentrasi vitamin C yang diperoleh adalah 7,2727 µg/ml, 9,0909 µg/ml, 10,9091 µg/ml, 12,7273 µg/ml dan 14,5454 µg/ml. Contoh perhitungan konsentrasi larutan standar dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 43. Kemudian diinkubasi pada suhu 90ºC selama 60 menit dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada penentuan panjang gelombang maksimum dalam waktu kerja yang diperoleh.
3.5.5.5Uji Kapasitas Antioksidan dari Hasil Maserasi Herba Seledri
Dipipet 20 ml hasil maserasi herba seledri, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, dicukupkan dengan aquadest hingga garis tanda. Dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi, diinkubasi pada suhu 90ºC selama 60 menit dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada penentuan panjang gelombang maksimum dalam waktu kerja yang diperoleh.
3.5.5.6Uji Kapasitas Antioksidan dari Sediaan Jamu Herba Seledri yang Beredar di Pasaran
Sebanyak 20 kapsul herba seledri ditimbang isinya dan digerus. Kemudian ditimbang serbuk setara 550 mg ekstrak herba seledri dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, dicukupkan dengan aquadest hingga garis tanda. Dipipet 6 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, dicukupkan dengan aquadest hingga garis tanda. Kemudian dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi, diinkubasi pada suhu 90ºC selama 60 menit dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada penentuan panjang gelombang maksimum dalam waktu kerja yang diperoleh.