Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Laboratorium Biosistematika Serangga dan Rumah Kaca Cikabayan , Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor mulai bulan September 2005 sampai dengan bulan April 2006.
Metode Penelitian
Studi penularan PMWaV melalui serangga vektor Persiapan sumber inokulum
Tanaman nanas yang menunjukkan gejala layu diambil dari Desa Bunihayu, Kecamatan Jalancagak, Kabupaten Subang. Tanaman tersebut ditanam dalam pot plastik berdiameter 50 cm dan dipelihara di Rumah Kaca Cikabayan, Departemen Proteksi Tanaman, IPB Bogor. Tanaman ini digunakan sebagai sumber inokulum pada percobaan selanjutnya. Verifikasi infeksi PMWaV pada tanaman sumber inokulum dilakukan dengan Tissue Blott Immunoassay (TBIA).
Identifikasi serangga vektor
Sebelum dilakukan perbanyakan, serangga vektor (kutu putih) terlebih dahulu diidentifikasi untuk memastikan bahwa vektor yang digunakan dalam penelitian adalah Dysmicoccus spp. Identifikasi dilakukan dengan mengamati kutu putih yang telah diawetkan pada preparat mikroskop dengan menggunakan kunci identifikasi Williams & Watson (1988). Pembuatan preparat mikroskop dilakukan sebagai berikut: kutu putih dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi ± 2 ml alkohol 95% dan dipanaskan dalam penangas air selama 5 menit. Selanjutnya alkohol dipindahkan bersama kutu putih tersebut ke dalam cawan sirakus, kemudian toraks bagian dorsal ditusuk dengan jarum untuk membuat lubang di bagian dorsal serangga. Kutu dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi larutan KOH 10% dan direbus sampai terlihat transparan, lalu dituang ke dalam cawan sirakus dan isi tubuh serangga dikeluarkan. Setelah bersih, kutu dicuci dengan
akuades sebanyak dua kali, kemudian direndam dalam larutan acid alcohol 50% selama 10 menit. Kemudian ditambahkan larutan asam fukhsin ke dalam larutan
acid alcohol 50% tersebut. Setelah beberapa menit, preparat diinkubasi dalam
glacial acetic acid semalam. Langkah selanjutnya, kutu putih didehidrasi dengan merendamnya dalam alkohol 80% selama 5 menit, alkohol 100% selama 10 menit, larutan carbol xylene selama dua menit, dan terakhir dalam alkohol 100% selama 10 menit. Selanjutnya preparat direndam dalam minyak cengkeh selama 10 menit, ditetesi dengan balsam kanada dan siap diamati di bawah mikroskop cahaya. Penentuan genus kutu putih mengikuti kunci identifikasi dari Williams & Watson (1988).
Perbanyakan serangga vektor
Setelah benar bahwa kutu putih tersebut adalah D. brevipes, maka dilakukan perbanyakan kutu putih dengan menggunakan labu parang hijau
(kabocha). Kutu putih betina dewasa yang siap meletakkan telur dipindahkan ke
kabocha yang diletakkan dalam kotak kardus dan disimpan pada ruangan bersuhu 25-30oC. Nimfa-nimfa yang diletakkan oleh imago betina kutu putih tersebut dipelihara pada kabocha sedangkan imagonya dibunuh. Serangga generasi kedua digunakan sebagai agen penularan virus pada penelitian ini.
Persiapan tanaman nanas uji
Tanaman nanas uji yang digunakan adalah nanas varietas Smooth Cayenne
hasil kultur jaringan yang diperoleh dari Pusat Kajian Buah -buahan Tropik a, IPB, Bogor. Tanaman nanas uji ditanam dalam kantong plastik berukuran 35 cm x 35 cm yang telah berisi tanah dan pupuk kandang steril (1:1). Tanaman uji dipelihara di Rumah Kaca Cikabayan.
Studi penularan PMWaV melalui serangga vektor
Kutu putih dewasa generasi kedua dibiarkan makan akuisisi pada tanaman nanas sumber virus, selama 48 jam, kemudian dipindahkan dan dibiarkan makan inokulasi pada tanaman nanas uji selama 7 hari. Jumlah kutu putih yang digunakan adalah 10 ekor per tanaman uji. Pada hari ke-7 setelah inokulasi, kutu
putih dibunuh dan tanaman nanas uji diinfestasi dengan 10 ekor kutu putih per tanaman sesuai perlakuan, sehingga dalam percobaan ini terdapat empat perlakuan yaitu:
1. Tanaman nanas yang diinokulasi PMWaV dan diinfestasi kutu putih 2. Tanaman nanas yang diinokulasi PMWaV namun tidak diin festasi
dengan kutu putih
3. Tanaman nanas yang hanya diin festasi dengan kutu putih tanpa diinokulasi PMWaV
4. Tanaman nanas uji yang tidak diinokulasi PMWaV dan tidak diin festasi kutu putih.
Setiap perlakuan dilakukan pada 10 individu tanaman nanas sebagai ulangan. Tanaman nanas uji yang telah diberi perlakuan dipelihara dalam rumah kawat kedap serangga untuk diamati gejala yang muncul sampai tiga bulan setelah inokulasi. Verifikasi infeksi PMWaV pada tanaman uji dilakukan dengan menggunakan TBIA.
Tissue Blott Immunoassay
TBIA dilakukan mengikuti Hu et al. (1996). Pangkal daun yang masih berwarna putih dipotong melintang dengan menggunakan pisau, kemudian ditekan kuat pada membran selulosa [0.45 µm Nitro ME nitrocelulose membrane (Micron Separation, Inc., Westboro, MA)] yang dialasi dengan kertas tisu dan gabus selama 3-5 detik sampai menimbulkan bekas pada membran. Cetakan berkas jaringan pembuluh daun akan tetap pada membran setelah dibloting. Membran kemudian disimpan kering pada suhu ruang sampai akan dianalisis. Membran yang telah diblot ditempatkan dalam wadah plastik dan diblok dengan 2% (b/v) susu bubuk (skim milk non fat) dalam PBS (Na2HPO4 1,15 g; KCl 0,2 g; KH2PO4 0,2 g; NaCl 8,0 g; NaN3 0,2 g, dilarutkan dalam akuades 1000 ml, pH 7,4) dan digoyang dengan kecepatan 50 rpm pada suhu ruang selama 3 x 10 menit. Membran dipindahkan dalam wadah plastik baru yang telah berisi larutan antibodi monoklonal spesifik PMWaV -1 atau PMWaV-2 (Agdia, USA) dalam PBS (1:1) dan diinkubasi selama 4 jam dalam suhu ruang sambil digoyang. Membran dicuci 3 x dalam PBST (PBS + 0,05% Tween-20) masing -masing selama 5 menit.
Selanjutnya membran diinkubasi dalam konjugat (Goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase) (Agdia, USA) yang dilarutkan dalam PBS dengan perbandingan 1:1000 selama 2 jam. Setelah dicuci dengan PBST, membran diinkubasi larutan substrat BCIP/NBT (Sigma B-5655), satu tablet substrat dilarutkan dalam 10 ml AP buffer (10 ml Tris HCl 1 M; 1 ml MgCl2 0,5 M dilarutkan dalam akuades 1000 ml dengan pH 9,5), selama 15 menit hingga 1 jam. Bila sudah terjadi perubahan warna, membran dicuci dengan akuades untuk menghentikan reaksi, kemudian dikeringanginkan.
Studi penularan PMWaV di lapangan
Pengamaatn dilakukan di pertanaman nanas di Desa Bunihayu, Kecamatan Jalancagak, Kabupaten Subang dan di Desa Huta Parhonasan, Kecamatan Girsang Sipangan Bolon, Kabupaten Simalungun. Kebun nanas yang diamati adalah kebun yang mempunyai kejadian penyakit layu lebih dari 30%. Pada kebun yang dipilih diamati sejumlah tanaman yang bergejala layu dan yang tidak bergejala. Pada setiap tanaman contoh, baik yang bergejala maupun yang tidak bergejala, diamati kolonisasi kutu putih. Infeksi isolat PMWaV pada tanaman contoh diverifikasi melalui TBIA.
Pengamatan sebaran geografi penyakit layu nanas
Pengamatan sebaran penyakit layu nanas oleh kutu putih dilakukan melalui survei ke pertanamaan nanas di beberapa propinsi sentral produksi nanas Indonesia yakni Jawa Barat (Subang dan Bogor), Jawa Timur (Blitar) dan Sumatera Utara (Simalungun). Pada setiap daerah sentra produksi nanas tersebut diamati beberapa kebun nanas milik petani setempat. Pada setiap kebun terpilih diamati tingkat kejadian penyakit dan tipe gejala layu pada tanaman nanas. Data ini diharapkan dapat memetakan penyebaran penyakit layu oleh kutu putih di beberapa daerah pertanaman nanas di Indonesia.