Spesifitas substrat
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan adalah cacing tanah (L. rubellus) yang diperoleh dari budidaya lokal di Serpong, Tangerang. Bahan kimia penting yang digunakan adalah standar pereaksi Bradford; Folin Ciocalteau (Merck), Bovine Serum Albumine/BSA Fraction V (Merck); kolagen (Sigma), fibrin (Sigma), fibrinogen (Sigma), amonium sulfat teknis; kolom Hitrap Benzamidine FF (Amersham Biosciences); porcine dan bovine tripsin (EC 3.4.21.4) dari Sigma, dan pereaksi elektroforesis SDS-PAGE serta zimogram (Bio-Rad).
Alat-alat utama yang digunakan dalam penelitian adalah spektrofotometer UV/Vis double beam (Hitachi), High Speed Centrifuge CR21G (Hitachi), sentrifugasi mikro (Beckman), inkubator, pH meter, pengering vakum, deep-freezer, kantong dialisis cut-off 12 kD (Sigma), fraction collector dan perangkat elektroforesis Mini-PROTEAN III (Bio-Rad).
Metode Penelitian Pembuatan Tepung Cacing (Modifikasi Yanti 2003)
Satu kilogram cacing L. rubellus dibersihkan dan dicuci dengan air mengalir. Lalu cacing tersebut direndam dalam 2,5 L akuades pH 5,8 (dengan penambahan asam sitrat dan 1,5 g KH2PO4) selama 2,5 jam untuk menghilangkan kotorannya. Selanjutnya cacing dibekukan menggunakan freezer, suhu -17oC lalu diblender dan dibekukan kembali. Pengeringan cacing dilakukan dengan menggunakan pengering vakum, suhu 50oC dan tekanan 300 psi selama 48 jam. Cacing kering diblender dan disaring (± 900 mesh) sehingga diperoleh tepung cacing.
Pemurnian Enzim Serupa Tripsin Dari Cacing Tanah (Modifikasi Mihara 1991; Yanti 2003)
Tepung cacing L. rubellus (10% b/v) dilarutkan dalam 50 mM bufer fosfat pH 8,0 dan diaduk selama 24 jam. Kemudian larutan tersebut disentrifugasi pada kecepatan 12.000 g, suhu 4oC selama 30 menit. Ekstrak enzim (supernatan) dipresipitasi dengan amonium sulfat teknis, kejenuhan 65% (Subandrio 2004), lalu
33 dalam 50 mM bufer fosfat pH 8,0 lalu disentrifugasi pada kecepatan 2.000 g, 4oC selama 5 menit. Supernatan didialisis dalam 20 mM bufer fosfat pH 8,0 dengan menggunakan kantung dialisis (cut-off 12 kD).
Dialisat disaring dengan kertas saring 0,45 µm lalu dipekatkan dengan menggunakan teknik liofilisasi. Hasil pemekatan dimurnikan dengan menggunakan filtrasi gel (matriks Sephadex G-100).
Pemurnian Enzim Serupa Tripsin Menggunakan Matriks Sephadex G-100 Dialisat yang telah dipekatkan dimurnikan lebih lanjut menggunakan kolom Sephadex G100, dengan bufer elusi 50 mM bufer fosfat pH 8,0. Setiap fraksi diatur agar diperoleh 100 tetes (sekitar 3 ml).
Pemurnian Enzim Serupa Tripsin Menggunakan Kromatografi Afinitas
Sebelum dimurnikan dengan menggunakan kolom Hitrap Benzamidine FF sampel enzim dengan aktivitas tertinggi pada pemurnian dengan teknik filtrasi gel dipekatkan lalu disaring dengan kertas saring 0,45 µm. Hasil pemekatan ini diencerkan dengan bufer 50 mM Tris HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,4. Bufer pengikat dan pencuci yang digunakan adalah 0,05 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl pH 7,4. Bufer elusi adalah 0,05 M glisin pH 3,0. Setiap tabung pengumpul fraksi diisi dengan 0,4 ml bufer 1 M Tris-HCl pH 9,0 dan digunakan menampung 2 ml eluat.
Analisis Aktivitas Protease
Aktivitas enzim protease diukur dengan menggunakan modifikasi metode Bergmeyer (1983), dengan menggunakan substrat kasein Hammarsten (2% b/v). Prosedur analisis yang dilakukan disajikan dalam tabel berikut ini.
Tabel 6 Prosedur analisis aktivitas protease dengan metode Bergmeyer dan Grassl (1983)
Blanko ( l) Standar ( l) Sampel ( l) Bufer fosfat 0,05M pH 8,0 250 250 250
Kasein 2%(b/v) pH 8,0 250 250 250
Enzim protease - - 50
Tirosin standar (5 mmol/l) - 50 -
Akuades 50 - - TCA (0,1M) 500 500 500 Akuades - - 50 Enzim protease 50 50 - Filtrat 375 375 375 Na2CO3 1250 1250 1250 Folin Ciocalteau (1:2) 250 250 250
Aktivitas protease (U/ml)
Inkubasi pada suhu 60oC selama 10 menit
Inkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit, lalu disentrifus 6000 rpm selama 8 menit, suhu ruang
Inkubasi 20 menit pada suhu 37oC, absorbansi dibaca pada =578 nm
T i
F P
x
A
A
A
A
b la n k o d a r s b la n k o sa mp el tan Analisis Kadar ProteinKadar protein ditentukan dengan metode Bradford (1976). Sebanyak 100 µl larutan enzim ditambahkan kedalam tabung berisi 2,5 ml akuades dan 2,5 ml pereaksi kerja Bradford. Perlakuan pada blangko, larutan enzim diganti dengan akuades. Selanjutnya larutan tersebut divorteks dan didiamkan selama 5 menit pada suhu ruang. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 595 nm.
Standar protein yang digunakan adalah BSA Fraction V. Pada kurva standar protein, larutan enzim digantikan dengan BSA Fraction V dengan kisaran konsentrasi 0 – 1000 µg/ml. Konsentrasi protein larutan enzim ditentukan berdasarkan persamaan garis linear hubungan antara konsentrasi standar protein dengan absorbansi.
Analisis SDS-PAGE Dan Zimografi
Penentuan berat molekul enzim dilakukan dengan analisis SDS-PAGE (modifikasi metode Laemmli 1970), sedangkan aktivitas enzim dideteksi dengan zimografi (modifikasi metode Granelli-Piperno dan Reich 1978; Choi et al. 2001). Tahapan kerja yang dilakukan adalah preparasi gel pemisah dan penahan, preparasi
35 Preparasi gel pemisah dan gel penahan
Pembuatan gel pemisah akrilamida 10% dan gel penahan 4% untuk SDS- PAGE dan zimografi dilakukan dengan komposisi yang tercantum pada Lampiran 2 Preparasi sampel dan loading
Untuk SDS-PAGE, 20 µl sampel ditambahkan dengan 5 µl bufer sampel. Tiap sampel diloading ke dalam sumur gel dengan kisaran volume 10-20 ml, dengan penggunaan marker Low Molecular Weight/LMW (Pharmacia) sekitar 5 µl.
Kondisi running, pewarnaan dan pelunturan warna
Gel dilarikan pada tegangan 100 V selama 1,5 jam dalam bufer elektroforesis. Untuk SDS-PAGE, setelah elektroforesis gel langsung diwarnai dengan larutan pewarna Coomasie Brilliant Blue R-250 selama 15 menit. Pelunturan warna dilakukan dengan larutan peluntur sehingga didapatkan pita protein biru dengan latar gel bening. Teknik pewarnaan lain yang dilakukan adalah pewarnaan dengan perak nitrat. Setelah elektroforesis gel digoyang dalam larutan fiksasi selama satu jam, dilanjutkan dalam larutan etanol 50% (v/v) selama 20 menit. Kemudian dalam larutan etanol 30% (v/v) selama 20 menit ( dua kali). Setelah itu digoyang dalam larutan enhancer selama satu menit lalu dicuci dengan akuabidestilata selama 20 detik (tiga kali). Gel lalu digoyang dalam larutan perak nitrat selama 30 menit dan dibilas dengan akuabidestilata selama 20 detik (dua kali). Gel lalu direndam dalam larutan Na2CO3-formaldehid sehingga pita protein terlihat dan reaksi segera dihentikan dengan penambahan larutan fiksasi.
Untuk zimografi, setelah elektroforesis gel direnaturasi dalam larutan Triton X-100 2,5% v/v sambil digoyang selama satu jam. Kemudian gel didigesti dalam 50 mM bufer fosfat pH 8, suhu 60oC selama 20 menit. Gel diwarnai dengan larutan pewarna Coomasie Brilliant Blue R-250 selama 15 menit. Pelunturan warna gel dilakukan dengan larutan peluntur berulangkali sehingga didapatkan pita enzim proteolitik putih dengan latar gel biru.
Penentuan Suhu Optimum (Yanti 2003)
Suhu optimum dari enzim protease cacing tanah ditentukan dengan menguji aktivitas enzim pada berbagai suhu (37-80oC) dalam 0,05 M bufer fosfat pH 7,0.
Penentuan pH Optimum dan Kestabilan pH(Yanti 2003)
Penentuan pH optimum untuk aktivitas enzim serupa tripsin dari L. rubellus
dilakukan pada beberapa sistem bufer yaitu bufer glisin-HCl (pH 2,0-3,5), bufer asetat 0,05 M (pH 3,5-5,5), bufer fosfat 0,05 M (pH 5,5-8,5), dan bufer glisin-NaOH 0,05 M (pH 8,5 hingga 12,0). Aktivitas enzim pada pH optimum ditentukan dengan mengukur aktivitasnya pada suhu optimum menggunakan metode Bergmeyer (1983). Penentuan stabilitas pH enzim dilakukan dengan cara menginkubasikan 50 µl enzim dengan 200 µl larutan bufer 0,05 M glisin HCl pH 2,0; 0,05 M bufer fosfat pH 7,0 dan 0,05 M bufer glisin NaOH pH 12,0 selama satu jam. Kestabilan pH ditentukan secara kualitatif dengan cara zimogram.
Pengaruh Deterjen, Inhibitor dan Urea (Yanti 2003)
Pengaruh inhibitor (EDTA 5 dan 1 mM serta PMSF dengan konsentrasi 1 dan 5 mM), deterjen (SDS 5% dan 1% b/v; Triton X-100 5% dan 1% b/v; Tween 20 5% dan 1% b/v) serta urea (5% dan 1% b/v) terhadap aktivitas enzim dilakukan dengan cara menginkubasikan 100 µl enzim dan 100 µl larutan senyawa selama satu jam pada suhu ruang, lalu dianalisis aktivitasnya.
Pengaruh Ion Logam (Yanti 2003)
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim serupa tripsin dari cacing tanah dilakukan dengan cara menginkubasikan 100 µl enzim dengan 100 µl larutan ion logam sehingga diperoleh konsentrasi akhir ion logam sebesar 1 dan 5 mM selama satu jam pada suhu ruang. Aktivitas enzim diukur secara kuantitatif dengan metode Bergmeyer (1983). Logam yang digunakan adalah KCl, NaCl, LiCl, CaCl2, CuCl2, CoCl2, MgCl2, MnCl2, ZnCl2 dan FeCl3.
37 Spesifitas substrat (Yanti 2003)
Uji aktivitas protease pada suhu dan pH optimum dilakukan pada berbagai substrat protein dengan konsentrasi 2% b/v. Substrat yang digunakan adalah kasein, fibrin, fibrinogen, BSA dan kolagen. Substrat tersebut dilarutkan dalam 50 mM bufer fosfat pH 8,0.