Spesifitas substrat
PENENTUAN SUHU OPTIMUM ENZIM PROTEASE SERIN DARI CACING TANAH
0 20 40 60 80 100 120 30 40 50 60 70 80 90 suhu (oC) A k ti v it as r e lat if (% )
Gambar 5 Suhu optimum aktivitas enzim kasar cacing tanah
Dalam reaksi enzimatis, suhu berperan dalam meningkatkan interaksi antara substrat dengan enzim sehingga dari Gambar 5 terlihat bahwa peningkatan suhu dari 37 oC hingga 60 oC menyebabkan aktivitas enzim meningkat. Tetapi enzim juga merupakan protein globular sehingga pada suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan enzim terdenaturasi dan menyebabkan terjadinya penurunan aktivitas bahkan dapat menyebabkan hilangnya akvitas enzim. Denaturasi enzim disebabkan oleh rusaknya interaksi-interaksi non kovalen (ikatan hidrogen, interaksi Van der Waals, interaksi hidrofobik dan interaksi elektrostatik) yang berperan dalam menjaga keutuhan struktur tiga dimensi dari enzim (Hames dan Hooper 2000). Pada Gambar 6 ditampilkan struktur tiga dimensi enzim fibrinolitik komponen A dari salah satu spesies cacing tanah yaitu E. fetida. Dari gambar tersebut diperlihatkan bahwa enzim fibrinolitik cacing tanah tersusun atas tiga rantai polipeptida, sedangkan sekuen asam amino dari enzim fibrinolitik tersebut disajikan pada Lampiran 9.
Hasil penelitian Yanti (2003) menunjukkan bahwa enzim protease L. rubellus
relatif stabil pada suhu 55oC hingga inkubasi selama satu jam, sedangkan pada suhu 60oC dengan waktu inkubasi 60 menit menyebabkan hilangnya aktivitas hingga 60%. Selain interaksi non kovalen, kestabilan enzim terhadap suhu juga dipengaruhi oleh pH, kekuatan ion medium dan molekul efektor (ion logam).
Gambar 6 Struktur tiga dimensi enzim fibrinolitik komponen A dari E. fetida (Tang
et al. 2002)
Penentuan pH optimum
Hasil pengujian aktivitas enzim pada berbagai pH (2 hingga 12) dengan menggunakan bufer glisin HCl, bufer asetat, bufer fosfat dan bufer glisin NaOH pada suhu optimumnya menunjukkan bahwa bufer fosfat pH 8,0 memberikan hasil terbaik bagi aktivitas enzim dari cacing tanah. Dari Gambar 7 terlihat bahwa aktivitas relatif enzim cacing tanah pada kisaran pH basa relatif stabil sehingga enzim ini dapat dikelompokkan ke dalam protease alkali. Penelitian Yanti (2003) juga menunjukkan bahwa pada kondisi suhu optimum, aktivitas maksimal protease L. rubellus diperoleh pada pH 8,0 (0,05 M bufer fosfat) dan enzim bekerja relatif aktif pada kisaran pH netral dan alkali. Hasil yang menyerupai juga diperoleh oleh Nakajima et al. (1993) yaitu pada kisaran pH 9 – 11 dan Mihara et al. (1991) pada kisaran pH 7,4 – 9,0.
41
Penentuan pH optimum pada berbagai pH dan jenis bufer
0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pH A k ti v it as r el at if (% ) bufer glisin HCl bufer asetat bufer fosfat bufer glisin NaOH
Gambar 7 Pengaruh pH dan larutan bufer terhadap enzim kasar cacing tanah Derajat keasaman dari lingkungan protein enzim akan mempengaruhi kondisi ionisasi gugus-gugus fungsionalnya yang berperan dalam keaktifan enzim. Gugus ionik berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Pemilihan pH bufer yang tidak tepat dapat menyebabkan terganggunya interaksi substrat dengan enzim. Sebagai contoh protease serin, misalnya tripsin mempunyai tiga gugus asam amino yang berperan penting dalam reaksi enzimatis yaitu Asp 102, Ser 195 dan His 57. Pada kondisi asam, Asp 102 dan His 57 akan terprotonasi sehingga Ser 195 tidak mampu untuk memutus ikatan peptida pada substrat. Perubahan pH yang ekstrim akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi karena terganggunya interaksi-interaksi non kovalen yang menjaga kestabilan struktur tiga dimensi enzim (Hames dan Hooper 2000).
Pengaruh Ion Logam
Enzim-enzim yang termasuk ke dalam golongan protease logam memerlukan ion logam sebagai efektor untuk mendukung aktivitas katalitiknya. Hasil pengujian adanya ion logam dengan konsentrasi 5 dan 1 mM terhadap enzim kasar cacing tanah tidak menunjukkan adanya pengaruh terhadap aktivitas katalitik enzim (Gambar 8).
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim kasar cacing tanah 0 20 40 60 80 100 120 140 Kontrol Na Co Cu Ba K Li Mn Mg Ca Zn Fe Ion logam A k ti v it as r el at if (% ) 5 mM 1 mM
Gambar 8 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim kasar Pengaruh Inhibitor, deterjen dan urea
Pengujian enzim kasar cacing tanah terhadap adanya EDTA, suatu senyawa pengkelat logam menunjukkan bahwa senyawa ini tidak berpengaruh terhadap aktivitas enzim sehingga dapat disimpulkan bahwa enzim protease cacing tanah tidak termasuk ke dalam golongan protease logam (Tabel 6). Protease logam memiliki atom logam pada sisi aktifnya sehingga bila atom logam ini dikelat oleh EDTA akan menyebabkan turunnya aktivitas enzim (Suhartono 1992).
Senyawa PMSF merupakan inhibitor spesifik bagi protease serin. Golongan protease serin memiliki sisi katalitik yang terdiri dari serin, aspartat dan histidin. PMSF akan bereaksi dengan gugus OH dari asam amino serin dan menyebabkan reaksi penghambatan yang tidak dapat balik (Palmer 1991). Beberapa inhibitor spesifik lain untuk protease serin adalah SBTI, LBTI, DFP dan TLCK. Pada Tabel 6 terlihat bahwa aktivitas residu enzim cacing tanah setelah direaksikan dengan 5 mM PMSF adalah 22% dan 66% (konsentrasi PMSF 1 mM). Hal ini menunjukkan bahwa enzim cacing tanah tergolong kedalam protease serin.
43
F
S O
O
CH2
Gambar 9 Struktur dua dimensi PMSF
Hasil ini didukung oleh beberapa publikasi yang juga menyatakan bahwa ekstrak enzim cacing tanah (L. rubellus) dihambat secara spesifik oleh inhibitor spesifik protease serin (Cho et al. 2004, Park et al. 1998, Nakajima et al. 1993, Mihara et al. 1991). Hasil serupa diperoleh Wang et al. (2003) pada cacing tanah E. foetida.
Tabel 7 Pengaruh inhibitor, deterjen dan urea
Bahan Konsentrasi Aktivitas relatif (%) kontrol 100 Tween 20 5% 109 1% 97 Triton X100 5% 111 1% 105 SDS 5% 102 1% 99 Urea 5 % 119 1 % 96 2-merkaptoetanol 1% 139 0,5% 133 EDTA 5 mM 83 1 mM 109 DMSO 50% 104 PMSF 5 mM 22 1 mM 66
Deterjen mempengaruhi kelarutan enzim dalam larutan bufer yang digunakan. Pada penelitian ini diuji pengaruh deterjen anionik (5% dan 1% SDS) serta deterjen non ionik (5% dan 1% Tween 20 serta Triton X-100). Dari aktivitas residu yang diukur ternyata ketiga jenis deterjen pada konsentrasi 5% dan 1% tidak berpengaruh terhadap aktivitas enzim cacing tanah. Pada konsentrasi tinggi deterjen dapat
menyebabkan denaturasi protein dan bila dihilangkan mungkin dapat menyebabkan renaturasi protein enzim (Bolag dan Edestein 1991, Choi et al. 2001).
Protein denaturan (urea) dan 2-merkaptoetanol (senyawa pereduksi) juga tidak mempengaruhi aktivitas enzim cacing tanah. Senyawa 2-merkaptoetanol merupakan senyawa pereduksi ikatan disulfida pada protein. Ikatan disulfida merupakan ikatan kovalen yang terbentuk dari dua residu sistein yang berperan penting dalam menjaga konformasi tiga dimensi protein. Hasil yang diperoleh berbeda dengan penelitian Yanti (2003) yang menyatakan bahwa ekstrak kasar enzim dihambat aktivitasnya, dan bahkan setelah dimurnikan akan dihambat total aktivitas proteolitiknya oleh 2-merkaptoetanol.
Gambar 10 Ikatan disulfida pada komponen A enzim fibrinolitik E. fetida
Tidak dihambatnya aktivitas enzim cacing tanah diduga disebabkan oleh adanya berbagai protein non enzim dalam ekstrak cacing tanah sehingga senyawa 2- merkaptoetanol yang merusak ikatan disulfida enzim berkurang kereaktivannya karena sudah merusak protein non enzim terlebih dulu atau mungkin disebabkan oleh letak dari ikatan disulfida yang sedemikian rupa sehingga sulit untuk berinteraksi dengan molekul 2-merkaptoetanol. Sebagai ilustrasi pada Gambar 10 ditampilkan struktur tiga dimensi komponen A enzim fibrinolitik dari E. fetida, pada gambar ini ditampilkan sistein (bentuk bola dan tongkat) yang membentuk ikatan disulfida
45 Sedangkan urea merupakan senyawa yang digunakan terhadap protein yang kelarutannya terbatas atau cenderung mengendap. Urea akan terurai dan membentuk ion-ion sianat yang bereaksi dengan gugus amino protein membentuk turunan- turunan karbamil yang stabil melalui ikatan ionik (Dunn 1989).
Spesifitas substrat
Enzim protease cacing tanah mampu mendigesti berbagai macam substrat seperti kasein, gelatin, albumin, keratin, fibrin, fibrinogen, keratin, elastin dan hemoglobin (Yanti 2003, Nakajima 1993). Kasein merupakan fosfoprotein yang terdiri atas unit struktur α-kasein (122 kD), β-kasein (24,1 kD) dan χ- kasein. Kasein merupakan protein utama pada susu, yaitu sekitar 80% dari total protein susu.
Gelatin merupakan hasil hidrolisis parsial dari kolagen dalam air mendidih. Polipeptida ini kaya akan residu prolin dan hidroksiprolin serta bersifat larut dalam air. Sedangkan kolagen bersifat tidak larut dan termasuk ke dalam protein serat.
Fibrin merupakan protein tidak larut yang berasal dari degradasi fibrinogen oleh trombin selama proses pembekuan darah. Degradasi fibrin dalam trombus dikatalisis oleh enzim plasmin atau fibrinolisin sehingga diperoleh peptida-peptida berukuran lebih kecil dan larut (Sadikin 2001).
Albumin merupakan protein larut air dan termasuk ke dalam protein globular. Albumin kaya akan asam amino hidrofobik, akan tetapi keberadaannya terletak sedemikian rupa sehingga berada pada bagian dalam. Sedangkan gugus hidrofilik berada di bagian luar sehingga protein ini larut air.
Hasil pengujian secara kuantitatif (metode Bergmeyer) menunjukkan aktivitas relatif yang rendah pada substrat fibrin, kolagen dan gelatin (Gambar 11). Fibrin dan kolagen termasuk ke dalam protein serat yang tidak larut, hal ini diduga menjadi penyebab rendahnya aktivitas enzimatis yang terukur. Sedangkan gelatin mudah larut tetapi komposisi asam aminonya yang banyak tersusun dari prolin dan hidroksi prolin mungkin menyebabkan rendahnya aktivitas enzimatis yang terukur, yaitu karena metode pengukuran yang dilakukan menggunakan tirosin sebagai standar.
SPESIFITAS SUBSTRAT DARI PROTEASE CACING