Spesifitas substrat
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Uji karakteristik enzim cacing tanah menunjukkan bahwa enzim termasuk ke dalam golongan protease serin alkali dengan suhu dan pH optimum 60oC dan 8,0, tahan terhadap deterjen, EDTA, urea dan 2-merkaptoetanol tetapi dihambat kuat oleh senyawa PMSF.
Dengan menggunakan kolom Hitrap Benzamidine FF, berhasil diisolasi enzim murni yang menunjukkan kemampuan untuk mendigesti substrat kasein, gelatin, fibrin dan fibrinogen. Dua fraksi yang diperoleh mempunyai aktivitas spesifik sebesar 1,92 U/mg dan 111,36 U/mg. Fraksi nomor delapan mempunyai lima pita proteolitik dengan perkiraan berat molekul 20, 22, 27, 40 dan 44 kD. Sedangkan fraksi nomor 24 mempunyai satu pita proteolitik dengan perkiraan berat molekul 20 kD. Isolat enzim murni juga mampu bekerja pada kisaran pH 2 hingga 12, yang menunjukkan keunikannya dibandingkan dengan enzim serupa dari organisme lain.
Saran
Berdasarkan keunikan sifat enzim yang mampu bekerja pada kisaran pH yang luas dan kemampuannya untuk mendigesti fibrin dan fibrinogen, disarankan untuk melakukan penelitian lebih lanjut tentang efektivitasnya dalam sistem pangan dan pengaruhnya setelah dikonsumsi.
57 DAFTAR PUSTAKA
Bergmeyer HU, M Grassl. 1983. Methods of Enzymatic Analysis, Vol 2. Weinheim: Verlag Chemie. Hal 1007-1009.
Bolag DM dan SJ Edestein. 1991. Protein Methods. Wiley-Liss. John Wiley and Sons, Inc, Publ. New York.
Boutrif E. 1991. Recent developments in protein quality evaluation. Htttp://www.fao.org//docrep/u5900t/u5900t07.htm#recent developments in protein quality evaluation. 5 Desember 2005.
Biro Pusat Statistik. 2001. Statistik Perdagangan Luar Negeri Indonesia. Impor 2001. Jakarta.
Biro Pusat Statistik. 2000. Statistik Perdagangan Luar Negeri Indonesia. Impor 2000. Jakarta.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein dye-binding. Anal Biochem 72:234-254.
Charter EA, SH Lee. 1996. Lumbricus product and method of making same. US Patent 5,576,026.
Cho IH, ES Choi, HG Lim, HH Lee. 2004. Purification and characterization of six fibrinolytic serine-proteases from earthworm Lumbricus rubellus. J Biochem Mol Biol 37:199-205.
Cho JH, CB Park, YG Yoon, SC Kim. 1998. Lumbricin I, a novel proline-rich antimicrobial peptide from the earthworm: purification, cDNA cloning and molecular characterization. Biochem Biophys Acta 1408(1):67-76.
Choi NS, SH Kim. 2001. The effect of sodium chloride on the serine-type fibrinolytic enzymes and the thermostability of extracellular protease from
Bacillus amyloliquefaciens DJ-4. J Biochem Mol Biol 34(2):134-138.
Choi NS, KS Yoon, JY Lee, KY Han, SH Kim. 2001. Comparison of three substrates (casein, fibrin and gelatin) in zymographic gel. J Biochem Mol Biol 34:531-536.
Choi E, S Kwon, Y Choi, S Rhee. 1996. Lumbrokinase -3(1) precursor Lumbricus rubellus. (Accession No Q25395)[TREMBL][1 Nov 1996].
Copeland R.A. 1994. Methods of Protein Analysis : A Practical Guide to Laboratory Protocols. London: Chapman & Hall. Hal 59-62.
Creighton T. 1997. Proteins: Structures and Molecular Properties 2nd Ed. WH Freeman and Co. New York.
Dametto M, AP David, SS Azzolini, ITN Campos, AM Tanaka, A Gomes, R Andreotti, AS Tanaka. 2000. Purification and characterization of a trypsin- like enzyme with fibrinolytic activity present in the abdoment of horn fly,
Haematobia irritans irritans (diptera : Muscidae). J Pro Chem 6:515-521. Dunn MJ. 1989. Electrophoretic analysis methods. Di dalam Harris ELV dan S
Angal. (eds). Protein Purification Methods. IRL Oxford University Press, New York.
Edward CA, JR Lofty. 1977. Biology of Earthworms. Ed. Ke-2. London: Chapman & Hall. Hal 57-70.
Ersson B, L Ryden, JC Janson. 1998. Introduction to Protein Purification. Di dalam : Ryden, L., J.C. Janson., editor. Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications. Ed. Ke-2. New York: J. Wiley. Hal 4- 44.
Fan Q, C Wu, L Li, R Fan, C Wu, Q Hou, R He. 2001. Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzyme III-1 from Lumbricus rubellus. Biochem Biophys Acta 1526:286-292.
Freshney RI. 1992. Animal Cell Culture A Practical Approach Second Edition. IRL Press. Oxford. Hal 10-11.
Granelli-Piperno A, E Reich. 1978. A study of protease and protease inhibitor complexes in biological fluids. J Exp Med 148:223-234.
Hames BD, NM Hooper. 2000. Biochemistry: The Instant Notes. 2nd Ed. Hongkong : Springer-Verlag. Hal. 83-84.
Harris ELV, S Angal. 1989. Protein Purification Methods: A Practical Approach. IRL Press. Oxford. Hal 245-246.
Hegner RW, JG Engemann. 1968. Inverterate Zoology. New York: Macmillan. Homma M. 1971. Trypsin action on the growth of Sendai virus in tissue culture
cells, restoration of the infectivity for L cells by direct action of trypsin on L cell-borne Sendai virus. J Viro 8:619-629.
Hosokawa M, A Klegeris, PL McGeer. 2004. Human oligodendroglial cell express low levels of C1 inhibitor and membrane cofactor protein mRNAs. J Neuro 1:17.
59 enzyme extracted from Lumbricus rubellus, in a prosthetic vascular graft. J Cardiovas Surg 43:891-894.
Ishii Y, H Mihara. 1991. Process for the production of dried earthworm powder and antihyperlipemic, antidiabetic, antihypertensive and antihypotensive preparations containing dried earthworm powder as active ingredient. US Patent 5,024,844.
Ishii Y, H Mihara. 1992. Process for the production of dried earthworm powder and antihyperlipemic, antidiabetic, antihypertensive and antihypotensive preparations containing dried earthworm powder as active ingredient. US Patent 5,128,148.
Ishii Y, H Mihara, LM Ho, G Kimura. 1993. Therapeutic medicament for thrombosis. US Patent 5,186,944.
Jin L, H Jin, G Zhang, G Xu. 2000. Changes in coagulation and tissue plasminogen activator after the treatment of cerebral infarction with lumbrokinase. Clin Hemorheol Microcir 23:213-218.
Junyu C, S Deyi, G Qingzhu. 2002. Production process of edible earthworm powder and hydrolysate. China Patent 1349766.
Katzung BG. 2002. Farmakologi: Dasar dan Klinik. Ed. Ke-8. Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, penerjemah. Jakarta: Salemba Medika. Terjemahan dari : Basic and Clinical Pharmacology. Hlm 389-405. Kim YS, KM Pyo, BS Hahn, KY Yang, HS Yun-Choi. 1998. Dose dependency of
earthworm powder on antithrombotic and fibrinolytic effects. Arch Pharm Res 21:374-377.
Kim SH, NS Choi. 1999. Electrophoretic analysis of protease inhibitors in fibrin zymography. Anal Biochem 270:179-181.
Kim JS, JK Kang, HC Chang, M Lee, GS Kim, DK Lee, ST Kim, M Kim, S Park. 1993. The trombolytic effect of lumbrokinase is not as potent as urokinase in a rabbit cerebral embolism model. J Kor Med Sci 8:117-120.
Kleiner DE, WG Stetler-Stevenson. 1994. Quantitative zymography : detection of picogram quatities of gelatinases. Anal Biochem 218:325-329.
Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the heat of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.
Lassegues M, P Roch, P Valembois. 1989. Antibacterial activity of Eisenia fetida
andrei coelomic fluid: evidence, induction and animal protection. J Invertebr Pathol 53:1-6.
Mihara H, H Sumi, T Yoneta, H Mizumoto, R Ikeda, M Seiki, M Maruyama. 1991. A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm Lumbricus rubellus. Japan J Physiol 41:461-472
Milochau A, M Lassegues, P Valembois. 1997. Purification, characterization and activities of two hemolytic and antibacterial proteins from coelomic fluid of the annelid Eisenia. Acta Biochim Biophys 1337:123-132.
Minnich J 1977. The Earthworm Book: How to Raise and Use Earthworms for Your Farm and Garden. London: Rodale Pr. Emmaus. Hal 23.
Mycek MJ, RA Harvey, PC Champe, BD Fisher. 2001. Farmakologi: Ulasan Bergambar.Ed. ke-2. Agoes A, penerjemah; Hartanto H, editor. Jakarta: Widya Medika. Terjemahan : Lippincott’s Reviews: Pharmacology. Hal. 203 - 205.
Nakajima N, H Mihara, H Sumi. 1993. Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus. Biosci Biotechnol Biochem 57:1726-1730
Nakajima N, K Ishihara, M Sugimoto, H Sumi, K Mikuni, H Hamada. 1996. Chemical modification of earthworm fibrinolytic enzyme with human serum albumin fragment and characterization of the protease as a therapeutic enzyme. Biosci Biotechnol Biochem 60:293-300.
Nakajima N, M Sugimoto, K Ishihara. 2000. Stable earthworm serine proteases: application of the protease function and usefulness of the earthworm autolysate. J Biosci Bioeng 90:174-179.
Nakajima N, K Ishihara, M Sugimoto, T Nakahara, H Tsuji. 2002. Further stabilization of earthworm serine protease by chemical modification and immobilization. J Biosci Biotechnol Biochem 66:2739-2742.
Ovianto E. 2004. Uji aktivitas tepung cacing tanah Lumbricus rubellus secara in vitro dan evaluasi pengaruhnya terhadap beberapa parameter aterosklerosis pada monyet ekor panjang Macaca fascicularis sehat. Skripsi. Teknologi Pangan dan Gizi. Fakultas Teknologi Pertanian. IPB.
Palmer T. 1991. Understanding Enzymes 3rd Ed. New York: Ellis Horwood. Hlm 301-306.
Palungkun R. 1999. Sukses Beternak Cacing Tanah Lumbricus rubellus. Jakarta: Penebar Swadaya. Hal 5-20.
Park YD, JW Kim, BG Min, JW Seo, JM Jeong. 1998. Rapid purification and biochemical characteristics of lumbrokinase III from earthworm for use as a fibrinolytic agent. Biotechnol Lett 20:169-172.
61 Pingoud A, C Urbanke, J Hogget, A Jeltsch. 2002. Biochemical Methods: A Concise
Guide for Students and Researchers. Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim. Rao MB, AM Tanksale, MS Ghatge, VV Deshpande. 1998. Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases. Microb Mol Biol Rev 62:1092-2172.
Ryu GH, DK Han, S Park, M Kim, YH Kim, B Min. 1995. Surface characteristics and properties of lumbrokinase-immobilized polyurethane. J Biomed Mater Res 29:403-409.
Ryu GH, S Park, M Kim, DK Han, YH Kim, B Min. 1994. Antithrombogenicity of lumbrokinase-immobized polyurethane. J Biomed Mater Res 28:1069-1077. Rukmana R. 1999. Budidaya Cacing Tanah. Yogyakarta: Kanisius. Hal 14-20. Sadikin M. 2001. Biokimia Darah. Jakarta: Widya Medika. Hlm 77-83.
Scopes RK. 1986. Protein Purification Principles and Practice. 2nd ed. Springer- Verlag. New York.
Seo JH, SP Lee. 2004. Production of fibrinolytic enzyme from soybean grits fermented by Bacillus firmus NA-1. J Med Food 7(4):442-449.
Sturzenbaum SR, P Kille, AJ Morgan. 1998. The identification, cloning and characterization earthworm metallothionein. FEBS Lett 431:437-442. Subandrio ERK. 2004. Uji Aktivitas Fibrinolitik Ekstrak Protein Cacing Tanah
(Lumbricus Rubellus) Secara In Vitro dan In Vivo Terhadap Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis). Skripsi. Fateta. IPB.
Suhartono MT. 2000. Protease. Orasi Ilmiah. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. IPB.
Suhartono MT. 1992. Protease. IPB PAU Bioteknologi.
Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor. IPB PAU Bioteknologi. Syam AF. 2002. Gangguan Penyakit di Bidang Ilmu Penyakit Dalam Akibat
Kekurangan Serat. Seminar Ilmiah Pro dan Kontra Manfaat Serat Bagi Kesehatan. 20 April 2002. Hotel Borobudur, Jakarta.
Tjay TH, K Rahardja. 2002. Obat-Obat Penting. Ed. Ke-5. Elex Media Komputindo. Jakarta. Hal. 572-582.
Wang F, C Wang, M Li, L Gui, J Zhang, W Chang. 2003. Purification, characterization and crystallization of a group of earthworm
fibrinolytic enzymes from Eisenia fetida. Biotechnol Lett 25:1105-1109.
Ward OP. 1983. Proteinases. Di dalam Fogarty WM. Microbial Enzyme and Biotechnology. Appl Biosci Publ. New York.
Yan QL, ZJ Sun, C Wang, SJ Lie, Yz Liu. 2004. Purification of a novel antibacterial short peptide in earthworm Eisenia foetida. Acta Biochim Biophys Sinica 36(4):297-302.
Yanti. 2003. Pemurnian dan Karakterisasi Protease Cacing Tanah Lumbricus rubellus Yang Bersifat Fibrinolitik. Tesis. Ilmu Pangan. Program Pascasarjana, IPB.
Yokoigawa K, K Tanizawa, K Soda. 1991. Chemical modification of urokinase with human serum albumin fragments. Agric Biol Chem 53:2887-2893.
63 Lampiran 1. Diagram alir pemurnian enzim serupa tripsin dari L. rubellus
Tepung cacing (10% b/v) diekstraksi dalam 0,05 M bufer fosfat pH 8,0 (24 jam, 0oC)
disentrifus 12000 g, 30 menit, 4oC
ekstrak enzim
presipitasi dengan amonium sulfat (65%)
disentrifus 12000 g, 30 menit, 4oC
pelet diresuspensi dalam 0,05 M bufer fosfat pH 8,0
disentrifus 2000 g, 10 menit, 4oC
dialisis (cut-off 12 kD)
disaring (0,45 µm) dan diliofilisasi
Kolom Gel Filtrasi dengan
Matriks Sephadex G100, eluen 50 mM bufer fosfat pH 8,0; 0,15 M NaCl
disaring (0,45 µm) dan diliofilisasi
Kolom Hitrap Benzamidine FF Eluen 0,05 M Tris HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,4
Lampiran 2. Komposisi gel pemisah dan gel penahan untuk SDS-PAGE Pereaksi Gel Pemisah 10% (µµl) Gel penahan 4% (µµl)
Larutan A 1670 670 Larutan B 1580 - Larutan C - 1250 Akuabides 1750 3000 Amonium persulfat 100 50 TEMED* 10 5 5000 5000 *TEMED = N, N, N’, N’ -tetramethylenediamine
Lampiran 3. Komposisi gel pemisah dan gel penahan untuk zimografi Gel Pemisah (10%) (µl)
Pereaksi
Fibrin Kasein Gel Penahan (4%) (µl)
Larutan A 1670 1670 670
Larutan B 1580 1580 -
Bovine fibrinogen 0,1% b/v 1000 - -
Bovine Thrombin 10 NIH/ml 100 - -
Kasein 1% - 1500 - Larutan C - - 1250 Akuabides 650 250 3000 Amonium persulfat 10% b/v 100 100 50 TEMED 10 10 5 Total 5000 5000 5000
65 Lampiran 4. Karakteristik kolom Hitrap Benzamidine FF
Dimensi kolom (i.d x h) 0,7 x 2,5 cm
Volume 1 ml
Ligan p-aminobenzamidin (pABA)
Spacer 14 atom
Konsentrasi ligan >= 12 mmol pABA/ml gel Kapasitas pengikatan >= 35 mg tripsin/ml gel Rata-rata ukuran partikel 90 mm
Struktur butiran Ikatan silang agarosa, 4% Tekanan balik maksimum 0,3 MPa, 3 bar
Laju alir (disarankan) 1 ml/menit Laju alir maksimum 4 ml/menit
Stabilitas kimia Semua larutan bufer yang umum digunakan Stabilitas pH jangka pendek jangka panjang 1 – 9 2 - 8
Suhu penyimpanan +4 hingga +8oC
Bufer penyimpanan 0,05 M bufer asetat, pH 4 (mengandung 20% etanol)
Lampiran 5. Prosedur pembuatan pereaksi kimia
Pereaksi untuk analisis aktivitas enzim dan kadar protein
•
••
Kasein Hammarsten 2% b/vSebanyak 1 g kasein ditimbang dan dilarutkan dalam 40 ml bufer fosfat 50 mM pH 8,0. Kekeruhan larutan dihilangkan dengan penambahan NaOH 1 M lalu diatur hingga pH 8,0 dengan penambahan HCl 1 M. Kemudian ditera dengan akuades hingga total volume 50 ml.
•
••
Tirosin 5 mMTirosin sejumlah 0,0453 g dilarutkan dalam 40 ml akuades dan ditambahkan NaOH 1 M hingga larut, pH diatur hingga pH 8,0 dengan penambahan HCl 1 M. Kemudian ditera dengan akuades hingga volume total 50 ml.
•
••
TCA 0,1 MLarutan stok TCA 1 M dibuat dengan melarutkan 16,339 g TCA dalam 100 ml akuades. Larutan kerja TCA 0,1 M dibuat dengan mengencerkan 10 ml larutan stok TCA 1 M dengan akuades hingga total volume 100 ml.
•
••
Na2CO3 0,4 MSebanyak 4,2397 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100 ml akuades.
•
••
Pereaksi Folin-Ciocalteau (1:2)Pereaksi Folin-Ciocalteau sebanyak 10 ml diencerkan dengan akuades hingga total volume 30 ml.
•
••
Pereaksi BradfordLarutan stok Bradford dibuat dengan melarutkan 0,1 g Coomasie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% v/v dan 100 ml asam fosfat 85% v/v, lalu ditera dengan akuades hingga volume 200 ml. Larutan kerja Bradford dibuat dengan mengencerkan 5 ml larutan stok Bradford dengan akuades hingga total volume 100 ml.
Pereaksi untuk analisis SDS-PAGE dan zimografi
•
••
Larutan A (30% b/v akrilamida; 0,8% b/v bis-akrilamida)67
•
••
Larutan B (bufer gel pemisah, Tris-HCl 2 M pH 8,8)Sebanyak 75 ml larutan Tris-HCl pH 8,8 dan 4 ml larutan SDS 10% b/v ditera dengan akuades hingga total volume 100 ml.
•
••
Larutan C (bufer gel penahan Tris-HCl 1 M pH 6,8)Larutan Tris-HCl pH 6,8 sebanyak 50 ml dan 4 ml larutan SDS 10% b/v ditera dengan akuades hingga total volume 100 ml.
•
••
Amonium persulfat 10% b/vAmonium persulfat sebanyak 0,1 g dilarutkan dalam satu ml akuades.
•
••
Bufer elektroforesisSebanyak 1,803 g Tris; 8,648 g glisin dan 0,6 g SDS dilarutkan dalam 600 ml akuades lalu ditera dengan HCl 1 M hingga pH 8,3.
•
••
Bufer sampelBufer sampel untuk SDS-PAGE tersusun atas 0,3 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8; 2,5 ml gliserol 50% v/v; 1,0 ml SDS 10% b/v; 0,25 ml 2-merkaptoetanol; 0,5 ml bromfenol blue 1% b/v; dan 0,45 ml akuabides dengan total volume 5,0 ml. Sedangkan bufer sampel untuk zimografi tersusun atas 0,5 g SDS; 1 ml gliserol 50% v/v; 1 ml bromfenol blue; 0,625 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8 dan 2,375 akuabides dengan total volume 5,0 ml.
•
••
Larutan fiksasiSebanyak 25 ml metanol dan 12 ml asam asetat dilarutkan akuabidestilata sehingga volume 100 ml.
•
••
Larutan enhancerSebanyak 0,1 g Na2S2O3.5 H2O dilarutkan dalam 500 ml akuabidestilata.
•
••
Larutan perak nitratSebanyak 0,4 g AgNO3 dan 70 µl formaldehid dilarutkan dalam 200 ml akuabidestilata.
•
••
Larutan Na2CO3-formaldehidSebanyak 15 g Na2CO3 dan 120 µl formaldehid dilarutkan dalam 250 ml akuabidestilata.
•
••
Larutan pewarnaSebanyak 0,5 g Coomasie Brilliant Blue R-250 dilarutkan dalam campuran 225 ml metanol, 50 ml asam asetat glasial dan 225 ml akuades dengan total volume 500 ml.
•
••
Larutan pelunturLarutan peluntur tersusun atas 50 ml metanol, 50 ml asam asetat glasial dan 400 ml akuades dengan total volume 500 ml.
•
••
Triton X-100 2,5% v/vLarutan Triton X-100 sebanyak 2,5 ml dilarutkan dengan akuades hingga total volume 100 ml.
•
••
Tween 20 2,5% v/vSebanyak 2,5 ml Tween 20 diencerkan dengan akuades hingga total volume 100 ml.
•
••
Fibrinogen 0,1% b/vBovine fibrinogen sejumlah 0,01 g dilarutkan dalam 10 ml bufer Tris-HCl 50 mM pH 8,0.
•
••
Fibrinogen 0,5% b/vSebanyak 0,25 g bovine fibrinogen dilarutkan dalam 50 ml bufer Tris-HCl 50 mM pH 8,0.
•
••
Trombin 50 NIHSebanyak 25 ml bovine thrombin 2000 NIH diencerkan dengan 975 µl bufer Tris-HCl 50 mM pH 8,0.
•
••
2 M Tris-HCl (pH 8,8), 100 mlTimbang 24,2 g Tris, ditambahkan 50 ml air destilata. HCl pekat ditambahkan hingga pH 8,8 (± 4 ml). Volume ditepatkan hingga 100 ml.
•
••
1 M Tris-HCl (pH 6,8), 100 mlTimbang 12,1 g Tris, ditambahkan 50 ml air destilata. HCl pekat ditambahkan hingga pH 6,8 (± 8 ml). Volume ditepatkan hingga 100 ml.
69 Lampiran 6 Teknik pengembangan dan pengemasan matriks Sephadex G100
•
••
Waktu pengembangan 72 jam suhu 20oC atau 5 jam pada suhu 90oC.•
••
Pengembangan matriks Sephadex G100 (Amersham) adalah 15-20 ml/g•
••
Tinggi kolom 40 cm dengan diameter 1 cm maka volume kolom adalah = (22/7)(0,5)2(40) = 32 ml. Sehingga matriks yang harus ditimbang adalah 32/15 = 2,14 g. Untuk mengantisipasi hilangnya matriks setelah pencucian, dalam perhitungan ditambahkan sebanyak ±10% dari perhitungan awal.•
••
Matriks Sephadex G100 dikembangkan dalam air bebas ion dan setelah mengembang sempurna, dicuci dengan penggantian air perendam sehingga tidak ada partikel-partikel kecil yang dapat menyebabkan penyumbatan kolom.•
••
Matriks dihilangkan udaranya dengan pompa vakum Pengemasan matriks Sephadex G100•
••
Tutup bawah kolom dipasang dan selang pengeluaran ditutup, kemudian kolom diisi dengan air hingga sedikit merendam batas bawah kolom.•
••
Matriks yang telah divakum dan diaduk perlahan sehingga berupa suspensi kental dimasukkan ke dalam kolom dengan cara melalukannya melalui batang pengaduk yang ditempelkan pada dinding kolom.•
••
Pengemasan sebaiknya dilakukan dalam satu kali penuangan matriks.•
••
Setelah semua matriks masuk ke dalam kolom, selang dibuka dan matriks dibiarkan memadat. Selama itu matriks harus dijaga agar tidak kering dengan penambahan bufer yang akan digunakan dalam separasi.•
••
Setelah matriks memadat, kolom dicuci dengan bufer yang digunakan sebanyak 2-3 kali volume kolom.•
Lampiran 7 Kurva standar Bradford y = 0.0003x + 0.0159 R2 = 0.9935 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 [protein]( g/ml) a b so rb a n si
71 Lampiran 8 Kurva standar zimogram 10%