Isolat bakteri biokontrol
Isolat bakteri yang diuji adalah: P. fluorescens RH4003, B. subtilis AB 89
dan B. cereus L32. Untuk pemeliharaan, semua bakteri ditumbuhkan pada medium King’s B Agar.
Pengaruh agens biokontrol terhadap aktivitas enzim peroksidase
Aktivitas peroksidase diukur berdasarkan metode pengukuran absorbansi langsung menggunakan spektrofotometer. Akar dan batang bawah sepanjang 2 cm dari satu tanaman ditimbang kemudian dihancurkan dengan mortar dalam buffer fosfat 0,01 M, pH 6,0 dengan perbandingan 1:4. Hasil hancuran disaring menggunakan kertas saring dan disentrifusi dengan kecepatan 5000 rpm selama
30 menit pada suhu 4oC. Supernatan yang diperoleh digunakan sebagai sediaan
enzim. Semua pekerjaan dilakukan pada suhu < 5oC.
Untuk pengamatan aktivitas enzim, sebanyak 0,2 ml sediaan enzim yang sudah diencerkan 1:3 dengan buffer fosfat 0,01 M, pH 6,0 dimasukkan ke dalam tabung reaksi berdiameter 1 cm yang berisi 5 ml larutan pirogalol 0,5 M dan 0,5
ml H2O2 1%. Campuran dihomogenkan selama 5 – 10 detik dan dihitung nilai
absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm dengan interval waktu setiap 30 detik selama 150 detik. Apabila nilai absorban terlalu tinggi dapat dilakukan pengenceran terhadap sediaan enzim dengan buffer fosfat. Sebelum dilakukan penghitungan dengan rumus, nilai absorban yang diperoleh terlebih dahulu
dikurangi dengan blanko. Rata-rata nilai absorban (Δ OD = b) dari satu
pengamatan dicari dengan menggunakan persamaan regresi (Y=a+bx). Unit aktivitas enzim (UAE) dihitung dengan rumus:
Δ OD x sediaan enzim (ml)
UAE = bobot basah contol (g)
Deteksi enzim kitinase yang dihasilkan oleh agens biokontrol
Aktivitas kitinolitik dari agens biokontrol dideteksi menggunakan media King’s B dan media minimal yang mengandung 0,2%koloidal kitin. Bakteri
41 agens biokontrol digoreskan pada media agar dan diinkubasikan pada suhu ruang selama empat hari. Zone bening yang terbentuk di sekeliling koloni bakteri menunjukkan adanya aktivitas kitinolitik.
Pembuatan koloidal kitin dilakukan dengan cara melembabkan 15 g kitin dari Crustaceae dengan aseton, kemudian dilarutkan dalam 120 ml HCL dingin dan diaduk-aduk dalam wadah berisi es selama 45 menit. Supernatan disaring menggunakan glass wool dan hasil penyaringan diendapkan. sisa endapan dilarutkan kembali dan disaring tiga kali hingga tidak ada lagi kitin yang mengendap. Suspensi yang mengandung kitin disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan hasil sentrifusi dibuang dan peletnya dicuci 3-4 kali dengan 4 l aquadest hingga mencapai pH 2. Koloidal kitin yang diperoleh disimpan dalam pendingin. Apabila akan digunakan, larutan koloidal kitin harus ditambah 1M NaOH hingga mencapai pH 6.
Deteksi enzim protease yang dihasilkan oleh agens biokontrol
Deteksi produksi enzim protease dilakukan dengan menumbuhkan bakteri biokontrol pada media King’s B agar yang mengandung skim milk 10% dalam
cawan petri. Biakan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Produksi
enzim protease ditunjukkan dengan adanya zone bening di sekeliling koloni bakteri akibat hidrolisa skim milk.
Produksi enzim protease untuk pengujian aktivitas protease dilakukan
dengan menambahkan 1 ml suspensi agens biokontrol (109-1010 cfu/ml) ke dalam
erlenmeyer yang berisi 100 ml media King’B cair yang mengandung skim milk 2%. Biakan diinkubasikan dalam suhu kamar dan digoyang dengan kecepatan 150 putaran per menit. Setelah diinkubasikan selama 14 dan 24 jam (media biakan terlihat bening), suspensi biakan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm
selama 15 menit pada suhu 4oC. Filtrat hasil sentrifugasi disimpan dalam suhu
4oC untuk selanjutnya diuji aktivitas enzimnya dan ukuran protein enzim yang
aktif.
Pengujian aktivitas protease dilakukan dengan metode Bergmeyer dan
Grassl (1983). Sebanyak 0,05 ml sampel enzim dalam 2 mM CaCl2 dimasukkan
fosfat 0,25 ml; substrat kasein 20 mmol, pH 8,0 sebanyak 0,25 ml. Sebagai blanko digunakan aquadest 0,05 ml dan untuk standar ditambahkan tirosin 0,05
ml. Campuran dikocok menggunakan vortex dan diinkubasikan pada suhu 37oC
selama 10 menit. Masing-masing tabung kemudian ditambah dengan larutan 0,1 M TCA sebanyak 0,5 ml. Pada blanko dan standar ditambahkan enzim dalam 2
mM CaCl2 sebanyak 0,05 ml sedangkan pada tabung sampel ditambahkan 2 mM
CaCl2 0,05 ml. Campuran divortex dan diinkubasikan pada 37oC selama 10 menit,
kemudian disentrifusi pada 4000 rpm selama 10 menit. Filtrat hasil sentrifusi diambil sebanyak 0,75 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang baru,
kemudian ditambah dengan 0,4 M Na2CO3 sebanyak 2,5 ml dan pereaksi Folin
(1:2) sebanyak 0,5 ml. Campuran dikocok menggunakan vortex dan didiamkan
selama lebih kurang 20 menit pada suhu 37oC, kemudian dilakukan pembacaan
absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm. Aktivitas protease dihitung menggunakan rumus:
ODsampel – ODblanko faktor koreksi
U/ml = x
ODstandar – ODblanko waktu
Berat molekul enzim diukur menggunakan elektroforesis dan zimogram dengan standar berat molekul dari Amersham Pharmacia (Uppsala, Swedia). Standar protein yang digunakan adalah standar protein berat molekul rendah (LMW) terdiri dari Fosforilase b (otot kelinci) 94 kDa, albumin (serum bovin) 67 kDa, ovalbumin (putih telur) 43 kDa, karbonat anhidrase (eritrosit bovin) 30 kDa,
tripsin inhibitor (kedelai) 20,1 kDa, dan α-laktalbumin (susu bovin) 14,4 kDa.
Deteksi produksi sianida oleh agens biokontrol
Pembentukan senyawa sianida dideteksi menggunakan metode yang
dilaporkan oleh Wei et al. (1991). Bakteri agens biokontrol ditumbuhkan pada
medium tryptic soy agar (TSA) yang mengandung glisin 4,4 g/l. Potongan kertas
saring steril berukuran 1 x 1 cm dicelupkan ke dalam larutan cyanide detection
solution (CDS). Selanjutnya potongan kertas saring tersebut diletakkan dalam tutup cawan petri. Cawan yang sudah berisi biakan dan kertas saring kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 4 hari. Produksi sianida terlihat dengan
43 adanya perubahan warna kertas saring dari kuning menjadi orange kecoklatan. larutan CDS dibuat dengan cara melarutkan 2 g asam pikrat dan 8 g sodium karbonat dalam 200 ml aquadest steril.
Deteksi produksi siderofor oleh agens biokontrol
Pembentukan siderofor oleh agens biokontrol dideteksi dengan medium Chrome Azurol S agar (CAS agar) seperti yang disebutkan oleh Gross (1990). Untuk 1 l CAS agar diperlukan 60,5 mg CAS yang dilarutkan dalam 50 ml air dan
dicampur dengan 10 ml larutan zat besi (III) (1 mM FeCl3.6H2O dalam 10 mM
HCl). Sambil diaduk, larutan tersebut ditambahkan ke dalam HDTMA (72,9 g dalam 40 ml air). Untuk medium agar, sebanyak 100 ml larutan garam (3 g/l
KH2PO4; 5 g/l NaCl; 10 g/l NH4Cl; 20 mM MgSO4; 1 mM CaCl2) dicampur
dengan 15 g agar dan 30,24 Pipes (free acid) dalam 750 ml air. NaOH sebanyak 12 g (50% w/v) ditambahkan untuk meningkatkan pKa Pipes (pH6,8). Setelah
sterilisasi dan suhu mencapai 50 oC, 30 ml casamino acid terdeferasi ditambahkan.
Deferasi dilakukan dengan cara mengextraksi 10% (w/v) larutan casamino acid dengan 3% (w/w) 8-hydroxyquinoline dalam kloroform. Glukosa 20% sebagai sumber karbon sebanyak 10 ml ditambahkan dalam keadaan steril. Selanjutnya larutan CAS ditambahkan ke dalam medium agar secara perlahan-lahan agar tidak terbentuk gelembung udara dan dituang ke dalam cawan petri (30 ml per petri).
Kultur bakteri agens biokontrol yang berumur 1-2 hari diambil menggunakan jarum ose dan digoreskan pada cawan yang berisi medium CAS agar. Cawan selanjutnya diinkubasikan pada suhu ruang selama 24 - 37 jam. Pembentukan siderofor pada medium ditandai dengan adanya warna orange di sekeliling koloni bakteri.