Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara. Dimulai pada bulan April 2014 hingga Oktober 2014.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun muda tanaman
manggis yang berasal dari kabupaten Tapanuli Selatan, Simalungun, Deli
Serdang, Serdang Bedagai dan Langkat. Nitrogen cair (N2), 0.1 gr, buffer CTAB,
buffer TAE, buffer TE, Chloroform Isoamilakohol 24 :1 (KIAA), NaCl, NaOH, Sodium asetat (CH3COONa3H2O), Na-EDTA, HCl p.a. alkohol 100% dan 70 %, Isopropanol dingin, aquadest, β-mercaptoetanol , Agarose (promega V3121), primer oligonukleotida, master mix (promega M7122), DNA leader Amresco 1 kb (K181-500 µl), kertas tissue.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah GPS, gunting, timbangan
digital, hot plate (Biosan), mortar, centrifuge (Eppendorf 5415), vortex, frezer, tabung 2.0 ml dan 1.5 ml, mikropipet ukuran 1-50µl, 100-500 µl, 200-1000 µl
merek Biologix, pinset, sarung tangan, karet, tip pipet (warna putih, kuning,biru), autoclave, kamera, penangas air (water bath Biosan), oven, pH meter, pengaduk magnetik, alat-alat gelas (gelas ukur, gelas beker, Erlenmeyer, dll),
electrophoresis (Power PAC 3000, Biorad), PCR (Thermal Cycler) Applied Biosystems, Gel-Doc (UV Cambrige), Power supply dan alat tulis.
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel Daun
Daun manggis yang digunakan adalah daun dari populasi alam di daerah
kabupaten Tapanuli Selatan : Napa (TS1), Sipenggeng (TS2), Huraba 1 (TS2),
Pangarongan (TS4), Simasom (TS5). Kabupaten Simalungun : Sirama-1 (Sim1),
Sirama-2 (Sim2), Petani Timur (Sim3). Kabupaten Deli Serdang : Pancur Batu
(DS1), Tiang Layar (DS2), Rambung Baru (DS3), Bingkawan (DS4), Sembahe
(DS5). Kabupaten Serdang Bedagai : Celawan-1(Srg1), Celawan-2 (Srg2), Besar
Terjun (Srg3), Meteran (Srg4), Firdaus (Srg5). Kabupaten Langkat : Stabat Lama
(Lkt1), Stabat Banyumas (Lkt2), Pertumbukan (Lkt3), Stabat Baru (Lkt4), Stabat
Barat-1(Lkt5), Stabat Barat-2 (Lkt6), Stabat Kota (Lkt7), Hulu Berayun (Lkt8),
Namo Cengkeh (Lkt9), Tanjung Keliling (Lkt10), Namo Datok (Lkt11), Sukatani
(Lkt12) dipilih yang masih muda /lembut berwarna hijau muda. Lalu dicuci
bersih, dilap dengan memakai tissue dan kemudian dibawa ke Laboratorium
Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Isolasi dan Pemurnian DNA
Daun manggis ditimbang 0,1 - 0,2 gram. Daun dipotong halus dengan
gunting secara melintang. Isolasi DNA genomic dilakukan dengan metode CTAB,
Orozco-Castillo et al. (1994) yang dimodifikasi dengan penambahan β -merkaptoetanol dan nitrogen cair pada saat ekstraksi (Toruan dan Hutabarat,
1997). Daun digerus dalam mortar dan diberi nitrogen cair (N2) hingga daun
benar-benar lumat. Daun dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml, diberi buffer CTAB dan β-merkaptoetanol kemudian divortex hingga rata. Setelah itu tabung
dipanaskan pada waterbath selama 60 menit dengan suhu 65 º C. Masing – masing
tabung diberi tanda sesuai dengan kode sampel yang digunakan.Tabung
diinkubasi dan diberikan larutan Chloroform Isoamilalkohol (KIAA) 1 ml ke dalam tabung. Kemudian tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung
disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
Bila sentrifugasi berhasil maka supernatan akan terpisah berdasarkan berat
jenisnya. Kemudian larutan fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain lalu
diberikan larutan KIAA 1ml dan diberi perlakuan yang sama. Supernatan
dipindahkan ke tabung mikro 2 ml (jika warna supernatant masih coklat dapat
diberikan larutan KIAA kembali dan ditambahkan isopropanol dingin dan sodium
asetat (CH3COONa3H2O). Tabung dikocok dan diperhatikan apakah ada
benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang – benang-benang halus putih sudah tampak
jelas, tabung dapat disimpan pada suhu 4º C selama 1 malam. Keesokan harinya
cairan isopropanol dibuang dan benang – benang halus dalam tabung ditinggalkan
dan dikering-anginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan buffer TE,
ditambah etanol dingin 100% dan Sodium asetat (CH3COONa3H2O), lalu di spin
manual agar terbentuk suspense antara pellet dengan buffer TE (Orozco-Castillo
et al. 1994) lalu disimpan pada suhu 4ºC selama 2-3 jam. Tabung disentrifugasi kembali selama 20 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Lalu dicuci dengan etanol
70%. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikering-anginkan kemudian
ditambah 100 µl buffer TE dan pellet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok
DNA yang diperoleh dapat disimpan pada suhu ± 20ºC bila tidak digunakan
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standard dengan
memasukkan 5 µl DNA stok manggis ditambah 2 µl loading dye.
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0. 8
% (b/v). Agarose ditimbang sebanyak 0.28 g, kemudian dilarutkan ke dalam 35
ml - 1 x buffer TAE . Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan
diberi tanda. Tabung tersebut dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetic
hingga larutan menjadi bening dan dibiarkan mendidih selam 25 menit. Lalu
ditambahkan Ethibium bromide (etbr) sebanyak 1 µl. Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60º C), larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir
pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit. Gel yang telah
memadat dimasukkan ke dalam alat elektroforesis dan diberi larutan TAE 1 x ± 30
ml (hingga terendam). Sampel DNA yang telah disiapkan dan telah diberi label
dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Setelah semua sumur gel berisi selanjutnya
dilakukan elektroforesis. Running elektoforesis dilakukan pada kondisi 100 volt
selama 90 menit. Visualisasi DNA yang dilakukan dengan Gel Doc.
Kualitas DNA dinyatakan baik apabila hasil elektroforesis menunjukkan
pola pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh
dan mempunyai konsentrasi tinggi.
Uji Kuantitas DNA
Pengujian kuantitas DNA dilakukan dengan metode spektofotometri pada panjang gelombang (λ) 230, 260, 280 nm, dengan menggunakan stok DNA hasil
isolasi dan pemurnian. Sebanyak 3 ul stok DNA diteteskan pada spektrofotometri
dan dapat diperoleh kemurnian dan konsentrasi DNA sampel
Amplifikasi/ Genotyping
Amplifikasi mengikuti prosedur analisis RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), sesuai prosedur William et al. (1990). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer polimorfik . Primer RAPD yang digunakan berasal
dari Sigma Aldrich.
Sebelum running PCR dilakukan pembuatan master mix yang terdiri dari
Go Green Taq untuk 31 tube x 12.5 µl dan ddh2O sebanyak 31 tube x 9.5 µl.
Kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube berisi primer disentrifugasi
selama 5 detik setelah itu ditambahkan ddH2O sesuai molar (misalnya OPC-07 =
1238 µl). Primer dimasukkan 2 µl per tube PCR dan DNA sampel masing-masing
1 µl. Setelah itu tabung PCR yang berisi stok DNA dan campuran master mix
dimasukkan ke dalam blok sampel di mesin PCR dengan annealing 36 ºC. Reaksi
amplifikasi gen dilakukan di mesin PCR dari produk Applied Biosystems yang didesain waktu, suhu, jumlah siklus, termal 45 kali (3 jam 51 menit) yang telah
digunakan pada tanaman kelapa sawit (Setiyo, 2001). Suhu denaturasi awal 94ºC
selama 2 menit, sebanyak 1 siklus. Denaturasi 94ºC selama 1 menit sebanyak 45
siklus. Suhu aneling 36ºC selama 1 menit sebanyak 45 siklus. Ekstension pada
suhu 72ºC selama 1 menit sebanyak 45 siklus, serta ekstension akhir 72ºC selama
10 menit sebanyak 1 sikus dan kondisi akhir PCR pada 4ºC.
Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu 4º
Elektroforesis hasil PCR
Sebelum dilakukan elektroforesis, disiapkan gel agarose konsentrasi 1 %
(b/v) dan ditambahkan larutan TAE. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetic hingga
larutan menjadi bening. Kemudian didinginkan dengan dialirkan dengan air
mengalir. Sebanyak 1µl Ethidium bromide ditambahkan kemudian larutan dipanaskan dan didinginkan dengan cara yang sama. Dan ditunggu hingga suhu ±
60º C. Dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang
(well-forming combs) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras. Sisir pembuat lubang dilepas secara perlahan dan gel agarose siap
digunakan untuk elektroforesis.
Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan di dalam tank
elektroforesis dan larutan buffer TAE 1 x dituang ke dalam tank tersebut ± 670 ml
(hingga terendam) hingga 1 mm di atas permukaan gel atau sampai batas yang
telah ditentukan. Sampel DNA yang telah diamplifikasi yang berada dalam
tube-tune PCR diambil sebanyak 8 ul lalu dimasukkan ke dalam sumur pada gel.
Marker / Ladder 1 Kb diberi loading dye (pewarnaan) sebanyak 2 µl dan dan marker sebanyak 5 µl kemudian dicampur dengan mikropipet dan setelah rata
masing – masing dimasukkan ke dalam sumur berisi gel.
Setelah semua sampel DNA dimasukkan ke dalam sumur (well), tank elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses
elektroforesis siap dijalankan. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 100 volt selama 90 menit. Setelah running elektroforesis selesai, arus listrik dimatikan dan tank gel eletroforesis diambil dengan menggunakan sarung tangan.
Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator
dengan cara meletakkan gel pada UV transluminator dan jika pita/band DNA kelihatan dengan jelas maka dapat didokumentasikan.
Analisis Data
Penentuan Skoring Marka RAPD
Untuk menentukan keragaman genetik, produk PCR – RAPD dilakukan
scoring berdasarkan muncul tidaknya pita DNA. Pita yang muncul pada gel
diasumsikan sebagai pita RAPD. Keragaman pita RAPD ditentukan dari
perbedaan migrasi pita pada masing – masing individu sampel. Berdasarkan ada
atau tidaknya pita, profil pita diterjemahkan ke dalam data biner. Pita yang
muncul diberi kode 1 (ada) dan 0 (tidak ada).
Penentuan Pasangan Asam Basa
Ukuran fragmen basa (pasangan basa) adalah base pair/ bp. Ukuran produk
PCR ditentukan dengan log jarak menggunakan program regresi linier. Fragmen
DNA standard (DNA landder) digunakan sebagai absis (x) dan log jarak migrasi sebagai ordinat (y). Dari persamaan ini ditentukan ukuran pasangan basa dari
fragmen produk PCR berdasarkan log jarak dari fragmen tersebut.
Matriks ketidaksamaan (dissimilarity) tiap kombinasi pasangan dihitung
berdasarkan Dissimilarity Index Simple Matching pada bootstraps 1000 sesuai rumus :
dengan dij ketidaksamaan antara i dan j, L jumlah lokus, π merupakan tingkat ploidi dan ml merupakan jumlah alel yang umum antara i dan j untuk
lokus l. Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi
pasangan individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari
keragaman yaitu : (1) Principal Coordinates Analysis (PCoA) yaitu suatu jenis analisis factorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin
utama dan (2) Neighbour – Joining Tree (NJtree) untuk memperoleh gambaran variasi molekuler. Perhitungan dan analisis deskriptif ini menggunakan software
DARwin 5.05 (Perrier dan Jacquemound-Collet 2009).
Nilai Polimorfisme Informasi Conten (PIC) dilakukan menurut Roldan-Ruiz et al. (2000).
PIC = 2fi (1-fi)
Dengan fi adalah frekuensi dari pita yang teramplikasi (pita yang muncul) dan (1-fi) adalah frekuensi dari pita yang tidak teramplikasi (pita yang tidak muncul). Nilai PIC maksimum pada dominant marker (RAPD) = 0.5