HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil - Analisis RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Populasi Manggis

Hasil

Uji Kualitas DNA

Kualitas DNA dari hasil running elektroforesis 30 aksesi manggis populasi

Sumatera Utara yang digunakan dapat dilihat pada gambar berikut :

Gambar 3. Hasil elektroforesis 30 DNA sampel manggis populasi Sumatera Utara, 0.8 % agarose

Keterangan : (M) = Marker 1kb, (1) TS1, (2)TS2, (3)TS3, (4)TS5, (5)TS5, (6) Sim1, (7) Sim2, (8) Sim3, (9)DS1, (10)DS2, (11)DS3, (12)DS4, (13)DS5, (14)Srg1, (15)Srg2, (16)Srg3, (17)Srg4, (18)Srg5, (19)Lkt1, (20)Lkt2, (21)Lkt3, (22)Lkt4, (23)Lkt5, (24)Lkt6, (25)Lkt7, (26)Lkt8, (27)Lkt9, (28)Lkt10, (29)Lkt11, (30)Lkt12.

Kualitas DNA pada 0.8% gel agarose (Gambar 3) menunjukkan adanya

pola pita DNA yang terang dan jelas pada 30 sampel aksesi manggis populasi

Uji Kuantitas DNA

Tabel 2 . Hasil uji kuantitas dan konsentrasi DNA manggis populasi Sumatera Utara dengan spektrofotometer

No. Kabupaten Nama Aksesi Kode λ 260/λ 280 Konsentrasi

(ng/ul) 1 Tapsel Napa TS1 1.993 151 2 Tapsel Sipenggeng TS2 2.000 96.8 3 Tapsel Huraba 1 TS3 2.036 199 4 Tapsel Pangarongan TS4 2.020 199 5 Tapsel Simasom TS5 2.031 ₁₃₁

6 Simalungun Sirama 1 Sim1 2.060 120

7 Simalungun Sirama 2 Sim2 1.931 236

8 Simalungun Petani Timur Sim3 2.000 176

9 Deli Serdang Pancur Batu DS1 1.977 305

10 Deli Serdang Tiang Layar DS2 2.062 149

11 Deli Serdang Rambung Baru DS3 1.992 129

12 Deli Serdang Bingkawan DS4 1.982 222

13 Deli Serdang Sembahe DS5 1.970 64.9

14 Sergei Celawan 1 Srg1 2.071 ₁₀₁

15 Sergei Celawan 2 Srg2 1.927 105

16 Sergei Besar Terjun Srg3 1.968 245

17 Sergei Meteran Srg4 1.885 131

18 Sergei Firdaus Srg5 1.820 45.4

19 Langkat Stabat Lama Lkt1 1.958 116

20 Langkat Stabat Banyumas Lkt2 1.995 199

21 Langkat Pertumbukan Lkt3 1.973 108

22 Langkat Stabat Baru Lkt4 2.013 77.3

23 Langkat Stabat Barat -1 Lkt5 2.017 ₁₇₈

24 Langkat Stabat Barat -2 Lkt6 1.938 126

25 Langkat Stabat Kota Lkt7 1.971 206

26 Langkat Hulu Berayun Lkt8 2.030 101

27 Langkat Namo Cengkeh Lkt9 2.004 ₂₄₁

28 Langkat Tanjung Keliling Lkt10 2.069 180

29 Langkat Namo Datok Lkt11 2.058 334

30 Langkat Sukatani Lkt12 2.069 343

Hasil PCR Dengan Marka RAPD

1. Primer OPD-20

Gambar 4. Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPD-20

Hasil amplifikasi dengan primer OPD-20 pada 30 aksesi populasi manggis

Sumatera Utara diperoleh 241 pita DNA (Gambar 4). Pola pita terendah berada

pada 146 bp yang hanya dimiliki oleh DS1, DS4, Lkt1, Lkt5, Lkt7, Lkt8 dan Lkt9.

Pola pita tertinggi berada pada 1350 bp yang dimiliki oleh TS2

2. Primer OPN-03

Gambar 5. Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPN-03

Amplifikasi PCR dengan primer OPN-03 pada 30 DNA sampel

menghasilkan 88 pita (Gambar 5). Pola pita berkisar antara 1.100 -750 bp .

500 bp 750 bp 1100 bp 1350 bp 1000 bp 500 bp 146 bp

3. Primer OPH-06

Gambar 6. Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPH-06

Hasil amplifikasi dengan primer OPH-06 pada 30 aksesi populasi manggis

Sumatera Utara diperoleh 127 pita DNA (Gambar 6). Pita DNA tertinggi

dihasilkan oleh TS2 pada 1.465 bp, dan terendah TS1 pada 260 bp. Pola pita

berkisar antara 1400 bp dan 970 bp

4. Primer OPC-07

Gambar 7. Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPC-07

Amplifikasi PCR dengan primer OPC-07 pada 30 DNA sampel

menghasilkan 54 pita (Gambar 7). Masing-masing aksesi menghasilkan pita

sebanyak 1-3 pola pita yang berkisar antara 2.023 bp – 1100 bp.

260 bp 500 bp 1000bp bp 1465bp bp 750 bp 500 bp 1100 bp 2023 bp

5. Primer OPC-12

Gambar 8. Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPC-12

Amplifikasi PCR dengan primer OPC-12 pada 30 DNA sampel

menghasilkan 34 pita (Gambar 8). Pola pita berkisar antara 1.150 bp – 616 bp.

6. Primer OPD-03

Gambar 9. Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPD-03

Amplifikasi PCR dengan primer OPD–03 pada 30 DNA sampel

menghasilkan 186 pita (Gambar 9). Masing-masing aksesi menghasilkan pita

sebanyak 3-9 pola pita yang berkisar antara 4.312 bp – 198 bp.

500 bp 1150 bp 616 bp 500 bp 198bp 4312 bp 1000 bp 1500 bp 2000 bp

7. Primer OPD-13

Gambar 10. Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPD-13

Amplifikasi PCR dengan primer OPD–13 pada 30 DNA sampel

menghasilkan 182 pita (Gambar 10). Masing-masing aksesi menghasilkan pita

sebanyak 1-9 pola pita yang berkisar antara 3.631 bp – 190 bp.

8. Primer OPD-16

Gambar 11 : Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPD-16

Amplifikasi PCR dengan primer OPD–16 pada 30 DNA sampel

menghasilkan 96 pita (Gambar 11). Masing-masing aksesi menghasilkan pita

sebanyak 1-5 pola pita yang berkisar antara 1.530 bp – 325 bp.

500 bp 1000 bp 190 bp 3631 bp 1500 bp 2000 bp 325 bp 1530 bp 500 bp 750 bp 1230 bp

9. Primer OPI-20

Gambar 12 : Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPI-20

Amplifikasi PCR dengan primer OPI-20 pada 30 DNA sampel

menghasilkan 126 pita (Gambar 12). Pola pita berkisar antara 1.396 bp – 338 bp.

10.Primer OPH-09

Gambar 13 : Hasil pola pita DNA sampel dengan primer OPH-09

Amplifikasi PCR dengan primer OPH-09 pada 30 DNA sampel

menghasilkan 96 pita (Gambar 13). Pola pita berkisar antara 2.610 bp – 135 bp.

500 bp 1000 bp 1396 bp 800 bp 338 bp 150 bp 500 bp 780 bp 2500 bp

Persentase amplifikasi setiap primer berada pada selang 50% sampai

100% diantara 30 aksesi manggis yang dianalisis dengan rata-rata 83.43% (Tabel

3). Dari Tabel. 3 dapat dilihat bahwa pita DNA dengan ukuran basa tertinggi

yaitu 4.312 bp pada primer OPD-03 dan terendah sebesar 135 bp pada primer

OPH-09. Persentase pita polimorfik terendah terdapat pada primer OPH-09

sebesar 50%, dan yang tertinggi terdapat pada primer OPC-07, OPD-03, OPD-13,

dan OPI-20 sebesar 100%. Persentase polimorfisme secara umum memiliki nilai

tinggi dengan rataan 83.43%. Total pola pita yang dihasilkan sebanyak 80 pola

pita dengan jumlah total pita polimorfis sebanyak 70 pola pita dengan 10 primer

RAPD. Primer OPD-13 menghasilkan pita polimorfis tertinggi sebanyak 16 pola

pita pada kisaran 190 - 3631 bp sedangkan primer OPH-09 menghasilkan pita

polimorfis terendah yaitu hanya 2 pola pita pada kisaran 135 – 2610 bp.

Nilai Information Polimorfisme Content (PIC) tinggi pada 30 aksesi manggis dengan rata – rata 0.447. Nilai PIC terendah pada primer OPD-20 dan

OPN-03 sebesar 0.39. Primer OPD-13 yang amplifikasi pita polimorfis tertinggi

sebanyak 16 pita, memiliki nilai PIC sebesar 0.47. Pada dominat marker nilai

maksimum PIC adalah sebesar 0.5. Nilai PIC secara umum tinggi sebesar 0.447

menunjukkan bahwa 10 primer polimorfis yang digunakan sesuai untuk aksesi

Tabel 3. Persentase pita polimorfis pada 10 primer RAPD

No Jenis Sequens Primer Suhu Total Jumlah Pola Range pita % PIC Primer (5' -3') Anneling Pita Pita DNA (bp) Polimorfis

RAPD (˚C) Polimorfis 1 OPD-20 ACCCGGTCAC 36 11 7 1350 - 146 63.60 0.39 2 OPN-03 GGTACTCCCC 36 4 3 1100 - 750 75.00 0.39 3 OPH-06 ACGCATCGCA 36 7 6 1465 - 260 85.00 0.48 4 OPC-07 GTCCCGACGA 36 5 5 2023 - 549 100.00 0.46 5 OPC-12 TGTCATCCCC 36 4 3 1150 - 616 75.00 0.40 6 OPD-03 GTCGCCGTCA 36 13 13 4312 - 198 100.00 0.49 7 OPD-13 GGGGTGACGA 36 16 16 3631 - 190 100.00 0.47 8 OPD-16 AGGGCGTAAG 36 7 6 1530 - 325 85.70 0.49 9 OPI-20 AAAGTGCGGG 36 9 9 1396 - 338 100.00 0.49 10 OPH-09 TGTAGCTGGG 36 4 2 2610 - 135 50.00 0.41 Total 80 70 834.30 4.47 83.43 0.447 Rataan

Gambar 14. Faktorial analisis (Principal Coordinate Analysis) aksis 1 (horizontal) dan aksis 2 (vertical) dengan 10 marka RAPD

Factorial analysis: Axes 1 / 2

TS1 TS2 TS3 TS4 TS5 Sim1 Sim2Sim3 DS1 DS2 DS3 DS4 DS5 Srg1 Srg2 Srg3 Srg4 Srg5 Lkt1 Lkt2 Lkt3 Lkt4 Lkt5 Lkt6 Lkt7 ^Lkt8 Lkt9 Lkt10 Lkt11 Lkt12

Gambar 14. menunjukkan perbedaan PCoA (faktorial analisis) diantara 5

kelompok tercermin dari perbedaan pada hasil aksis 1 dan 2 yang mampu

menjelaskan 38.11% dari keseluruhan keragaman molekuler

Gambar 15. Profil Radial Neighbour-Joining dari 30 aksesi manggis populasi Sumatera Utara yang dianalisis berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching 0 0.1 TS1 TS2 TS3 TS4 TS5 Sim1 Sim2 _Sim3 DS1 DS2 DS3^DS4 DS5 Srg1 Srg2 Srg3 Srg4 Srg5 Lkt1 Lkt2 Lkt3 Lkt4 Lkt5 Lkt6 _Lkt7 Lkt8 Lkt9 Lkt10 Lkt11 Lkt12 4 24 48 28 16 7 33 10 16⁴48 16 53 4 51 63 56 54 15 49 ₆₂ 22 ³⁸ 8 6 1 5 Kelompok Utama Ke-3 Kelompok Utama Ke-1 Kelompok Utama Ke-2 Sub Kelompok 1A Sub Kelompok 2A Sub Kelompok 2B Sub Kelompok 1B

Gambar 16. Pohon Filogenetik dari 30 aksesi manggis populasi Sumatera Utara yang dianalisis berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching

Gambar 15 dan 16 menunjukkan profil pohon filogenetik berdasarkan

analisis pengelompokkan WPGMA (Weighted Pair-Group Method with Arithmetic) dengan metode Matrix Dissimilarity Simple Matching untuk 30 aksesi manggis populasi Sumatera Utara dengan 10 marka RAPD. Hasil perhitungan

untuk koefisien ketidaksamaan genetik menunjukkan bahwa 30 aksesi manggis

terbagi dalam tiga kelompok utama. Kelompok utama ke-1 terdiri dari 13 aksesi

yaitu DS4, DS3, TS5, DS5, Sim3, Srg1, TS2, Sim1, TS1, DS2, Sim2, DS1, Lkt1.

Kelompok utama ke- 2 terdiri dari 15 aksesi yaitu Srg2, TS3, TS4, Srg5, Srg4,

Srg3, Lkt6, Lkt11, Lkt2, Lkt3, Lkt9, lkt7, Lkt12, Lkt10, Lkt4 dan kelompok

utama ke -3 terdiri dari 2 aksesi yaitu Lkt8 dan Lkt5.

0 0.1 TS1 TS2 TS3 TS4 TS5 Sim1 Sim2 Sim3 DS1 DS2 DS3 DS4 DS5 Srg1 Srg2 Srg3 Srg4 Srg5 Lkt1 Lkt2 Lkt3 Lkt4 Lkt5 Lkt6 Lkt7 Lkt8 Lkt9 Lkt10 Lkt11 Lkt12 4 24 48 28 16 7 33 10 16 48 4 16 53 4 51 63 56 54 15 49 62 22 38 8 6 1 5

I

II

III

Kelompok utama ke-1 terdiri dari 2 sub kelompok yaitu sub kelompok 1A

yang terdiri dari DS4, DS3, TS5, DS5, Sim3, Srg1, TS2, Sim1, TS1, DS2, Sim2,

DS1 (12 aksesi) dan sub kelompok 1B yang terdiri dari Lkt1(1 aksesi).

Kelompok utama ke-2 juga terbagi menjadi 2 sub kelompok yaitu sub

kelompok 2A yang terdiri dari Srg2, TS3, TS4, Srg5, Srg4, Srg3, Lkt6 (7 aksesi)

dan sub kelompok 2B terdiri dari Lkt11, Lkt2, Lkt3, Lkt9, lkt7, Lkt12, Lkt10,

Lkt4 (8 aksesi).

Pembahasan

Isolasi DNA dengan menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel

efektif dilakukan, dinding sel juga dapat dihancurkan dengan cara menggerus dan

diberi larutan CTAB dan dihangatkan. Semua isi sel ditampung dalam larutan

penyangga yang berisi Tris HCl dengan penambahan asam asetat (CH3COOH).

Pada proses presipitasi atau pengumpulan pellet dilakukan pada suhu dingin untuk

mencegah sisa-sisa kontaminan phenolik bereaksi. Presipitasi dengan

menggunakan isopropanol dan etanol digunakan untuk penggumpulan pellet DNA

serta penambahan sejenis garam yaitu Sodium asetat (CH₃COONa3H₂O) untuk

membantu proses presipitasi tersebut guna mendapatkan hasil isolasi DNA yang

murni.

DNA yang berkualitas tinggi dengan konsentrasi yang tepat dibutuhkan

untuk mendapatkan hasil amplifikasi yang baik dari reaksi PCR. Stok DNA yang

diperoleh dari hasil isolasi daun segar tanaman manggis (Tabel.2) rata-rata 1.994

dengan selang 1.820 – 2.071 menunjukkan tingkat kemurnian yang sesuai dengan

Sambrook dkk. (1989) yaitu 1.80 – 2.00. Apabila tingkat kemurnian di luar batas

karbohidrat, protein dan RNA. Kuantitas DNA yang dihasilkan mempunyai

kisaran 45.4 – 343 ng/ul. Jumlah ini relatif cukup banyak dan dapat digunakan

untuk reaksi PCR sampai ratusan kali.

Pita yang muncul memiliki ukuran basa dan intensitas yang bervariasi.

Perbedaan intensitas pita DNA dipengaruhi oleh sebaran situs penempelan primer

pada genom, kemurnian DNA dan konsentrasi DNA dalam reaksi. Banyaknya pita

yang dihasilkan pada setiap primer tergantung pada sebaran situs yang homolog

pada genom (Williams et al, 1990). Fragmen yang tidak muncul disebabkan tidak terjadinya amplifikasi yang kemungkinan disebabkan primer yang digunakan

tidak sesuai dengan cetakan DNA. Beberapa bukti percobaan menunjukkan bahwa

perbedaan satu pasang basa saja sudah cukup menyebabkan ketidaksesuaian

cetakan primer yang mencegah amplifikasi (Williams et al, 1990).

Nilai PIC pada 10 primer yang digunakan antara 0.39 – 0.49. Nilai

rata-rata PIC pada 30 aksesi manggis sebesar 0.447. Nilai ini cukup tinggi yang

menunjukkan sifat diskriminatif pada primer tersebut. Nilai PIC maksimum pada

kodominant marker adalah 0.5. Roldan et al (2000) menyatakan nilai PIC penanda mendekati nilai maksimum sebesar 0.5 menunjukkan sifat diskriminatif

pada primer tersebut. Nilai PIC efisien dalam membedakan genotipe dan sangat

berguna dalam mendeteksi tingkat polimorfisme pada lokus tertentu. Sehingga 10

primer RAPD yang digunakan sesuai untuk tanaman manggis yang ditunjukkan

dengan rataan nilai PIC mendekati nilai maksimum yaitu sebesar 0.5.

Diantara 30 aksesi manggis primer OPC-07, OPD-03, OPD-13, OPI-20

memberikan persentase polimorfis terbesar yaitu 100%. Penelitian ini

sumber gen yang melimpah yang dapat dimanfaatkan untuk perbaikan tanaman

manggis.

Penentuan keragaman genetik diantara 30 aksesi manggis populasi

Sumatera Utara dan penanda RAPD sesuai prosedur William et al. (1990). Sub kelompok 1A berasal dari Tapanuli Selatan (3 aksesi), Simalungun (3 aksesi),

Deli Serdang (5 aksesi), Serdang Bedagai (1 aksesi). Sub kelompok 1B berasal

dari Langkat (1 aksesi). Sub kelompok 2A berasal dari Tapanuli Selatan (2

aksesi), Serdang Bedagai (4 aksesi), Langkat (1 aksesi). Sub kelompok 2B berasal

dari Langkat (8 aksesi). Kelompok utama ke-3 berasal dari Langkat (2 aksesi).

Hal ini menunjukkan adanya perbedaan asal dalam satu kelompok yaitu pada sub

kelompok 1A dan 2A. Perbedaan ini disebabkan adanya campur tangan manusia,

terbawa oleh hewan, keadaan geografi daerah aksesi yang memungkinkan biji

terbawa oleh angin dari satu daerah ke daerah yang lain.

Hasil PCoA yang dilakukan pada 30 aksesi manggis diungkapkan oleh 10

primer RAPD. Kelompok yang berbeda didiskriminasi dengan sumbu axis 1 dan 2

menjelaskan 38.11 % dari variasi total (Gambar 14). Keragaman molekuler yang

dapat dinyatakan oleh aksis 1 dan 2 pada 10 primer RAPD dengan 30 aksesi

sampel adalah sebesar nilai tersebut.

Pada penelitian ini nilai distance dapat menjadi acuan untuk melihat kekayaan diversitas gen. Sub kelompok 1A dibentuk oleh aksesi DS4, DS3, TS5,

DS5, Sim3, Srg1, TS2, Sim1, TS1, DS2, Sim2, DS1 dan nilai distance yang

dibentuk antara aksesi Sim2 dan Srg1 adalah 0.17. Sub kelompok 1B dibentuk

oleh aksesi Lkt1 yang berada pada kelompok tersendiri. Sub kelompok 2A

yang dibentuk antara aksesi Srg5 dan Lkt6 adalah 0.20. Sub kelompok 2B

dibentuk dari aksesi Lkt11, Lkt2, Lkt3, Lkt9, Lkt7, Lkt12, Lkt10, Lkt4 dan nilai

distance antara aksesi Lkt3 dan Lkt11 adalah 0.07. Kelompok utama ke-3

dibentuk oleh aksesi Lkt5 dan Lkt8 dengan nilai distance 0.14. Nilai distance

maksimum adalah 0.48 yaitu antara aksesi TS3 dan Lkt1 dan nilai minimum

adalah 0.06 yaitu antara aksesi Sim2 dan DS2 serta Lkt10 dan Lkt12. Perbedaan

nilai distance ini menunjukkan adanya keragaman genetik pada tanaman manggis.

Nilai distance dapat memberi kemungkinan untuk memperoleh keragaman yang semakin tinggi dengan menyilangkan aksesi dengan nilai distance (jarak genetik) terjauh untuk memperoleh varietas dengan karakter-karakter yang diinginkan.

Aksesi asal Tapanuli Selatan menyebar pada kelompok utama ke-1 dan

kelompok utama ke-2 yaitu pada sub kelompok 1A dan 2A. Pada sub kelompok

1A terdapat TS1, TS2 dan TS5, sedangkan TS3 dan TS4 berada pada sub

kelompok 2A. Aksesi yang berasal dari Serdang Bedagai juga tersebar pada

kelompok utama 1 dan 2 yaitu Srg1 pada sub kelompok 1A sedangkkan Srg2,

Srg3, Srg4, Srg5 berada pada sub kelompok 2A. Aksesi Lkt6 masuk dalam sub

kelompok 2A. Sedangkan pada sub kelompok 1B, 2B dan kelompok utama ke-3

hanya terdiri dari aksesi yang berasal dari daerah Langkat yaitu Lkt8 dan Lkt5.

Hal ini menunjukkan adanya keragaman genetik pada tanaman manggis.

Hasil yang diperoleh dari penelitian ini dapat memberikan informasi bagi

program pemulia manggis mengenai koleksi plasma nutfah manggis dan koleksi

pohon induk. Semua tanaman memiliki keragaman genetik namun kondisi

Bedagai memiliki proporsi keragaman genetik yang tinggi dilihat dari penyebaran

aksesinya.

Salah satu kekhasan dari populasi manggis Langkat adalah aksesi Lkt1

yang membentuk sub kelompok tersendiri yaitu 1B. Sedangkan aksesi yang

berasal dari Langkat lainnya tersebar pada sub kelompok 2A, 2B,dan kelompok

utama ke-3. Hal ini juga ditunjukkan pada primer OPH-09 yang mampu

mengamplifikasi dan memunculkan pola pita unik yaitu terdapat pada 780 bp

yang hanya terdapat pada aksesi Lkt1 dan tidak terdapat pada aksesi Langkat

lainnya seperti Lkt2, Lkt3, Lkt4, Lkt5, Lkt6, Lkt7, Lkt8, Lkt9,Lkt10, Lkt11,

Lkt12.

Aksesi Langkat lainnya yang tersebar dalam kelompok Utama 2 adalah

Lkt6 yang merupakan satu-satunya aksesi yang berasal dari Langkat yang berada

di sub kelompok 2A. Hal ini juga ditunjukkan pada primer OPD-13 yang mampu

mengamplifikasi dan memunculkan pola pita unik yaitu terdapat pada 770 bp

yang hanya terdapat pada aksesi Lkt6 dan tidak terdapat pada aksesi Langkat

lainnya

Kekhasan ini menunjukkan adanya perbedaan materi genetik Lkt1dan

Dalam dokumen Analisis RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Populasi Manggis (Garcinia mangostana L.) Di Sumatera Utara (Halaman 46-62)