Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor dan Balai Besar Karantina Pertanian Tanjung Priok, Wilayah Kerja Bogor. Penelitian dilakukan sejak bulan Juli 2014 sampai dengan Januari 2015.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah Thermo Scientific Multiscan® FC Microplate Photometer (ELISA Reader), Biolog MicroStation Reader, turbidimeter, dan thermocycler PCR. Bahan yang digunakan adalah kit ELISA E. chrysanthemi (kode: 1080, Agdia), GEN III OmniLog® ID System (Biolog, Hayward, CA, USA), primer spesifik E. chrysanthemi Ec3F dan Ec4R, serta primer universal 16S rRNA 27F dan 1429R.
Pengambilan Sampel Tanaman
Sampel tanaman kentang diambil dari 4 lokasi pertanaman yaitu Kecamatan Pangalengan Jawa Barat pada posisi S 07’ 11 851’ E 107’ 36 476’ di ketinggian 1459 m, Kecamatan Cikajang Kabupaten Garut Jawa Barat pada posisi S 07’ 24 22 26’ E 107’ 49 38 76’ pada ketinggian 1380 m, kawasan Dieng Kecamatan Batur Kabupaten Banjarnegara Jawa Tengah pada posisi S 07’ 12 087’ E 109’ 46 057’ pada ketinggian 1400 m, dan Kecamatan Bumiaji Kota Batu-Malang Jawa Timur pada posisi S 07’44 937’ E 112’ 32 049’ di ketinggian 1656 m. Tiap lokasi diambil 100 tanaman yang menunjukkan gejala layu serta busuk basah. Bagian tanaman yang diambil adalah pangkal batang dan umbi. Umur tanaman berkisar antara 50-90 hari setelah tanam (HST). Sampel dimasukkan ke dalam amplop coklat, diberi nomor dan disusun dalam wadah yang tidak terlalu rapat agar tidak basah/busuk, disimpan dalam kulkas bersuhu 4 ᵒC sampai digunakan untuk pengujian.
Deteksi Serologi
Deteksi serologi terhadap sampel tanaman bergejala layu dilakukan untuk menentukan insidensi E. chysanthemi dan seleksi awal sampel yang akan diisolasi. Deteksi serologi dilakukan dengan indirect enzyme-linked immunosorbent assay (I-ELISA) menggunakan probe antibody (IgG Rabbit) dan conjugate [Goat anti-Rabbit (IgG-AP) enzym conjugate] E. chrysanthemi (Adgen). Sampel tanaman dari lapangan dibuat menjadi 20 sampel komposit dari tiap lokasi; 1 sampel komposit terdiri atas 5 tanaman. Pada sampel komposit yang positif, selanjutnya dideteksi lagi tiap individu untuk mengetahui insidensidari tiap lokasi. Bagian pangkal batang dan umbi tanaman kentang digerus dalam coating buffer dengan perbandingan 1:4 (b:v), kemudian dimasukkan ke dalam sumuran pada plat mikrotiter ELISA sebanyak 100 µL dan diinkubasi pada suhu 4
o
C selama semalam. Selanjutnya plat mikrotiter dicuci sebanyak 3 kali dengan phosphat buffer saline tween (PBST), kemudian plat mikrotiter diisi dengan 200
µL blocking buffer (5 g non fat dried milk powder dalam 100 ml PBST) dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC. Plat dicuci 3 kali dengan PBST, dan diberi 100 µL antiserum pertama E. chrysanthemi (dilarutkan dalam bufer konjugat dengan perbandingan 1:8000), dan selanjutnya diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 oC. Setelah 2 jam, plat dicuci 3 kali kemudian diisi 100 µL GAR-AP conjugate yang dilarutkan dalam bufer konjugat (1:4000). Setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC plat dicuci 3 kali dengan PBST. Sumuran diisi dengan 100 µL pNPP yang dilarutkan dalam bufer pNPP dengan perbandingan 1:1. Setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit dilakukan pengamatan secara kuantitatif menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Reaksi dihentikan dengan cara menambahkan larutan NaOH 3 M sebanyak 50 µL ke dalam masing-masing sumuran. Pada setiap pengujian disertakan kontrol negatif, kontrol positif, dan bufer. Uji dinyatakan positif jika nilai absorbansi ELISA (NAE) sampel uji ≥ 2 kali NAE kontrol negatif (tanaman sehat).
Isolasi dan Pemurnian Isolat
Sampel individu yang menunjukkan positif E. chrysanthemi pada pengujian ELISA, kemudian diisolasi menggunakan media selektif casamino acid peptone glucose (CPG) (Cuppels dan Kelman 1974). Batang dan umbi dari tanaman kentang bergejala layu dan busuk dicuci dengan air mengalir kemudian disterilisasi permukaan menggunakan alkohol 70%. Selanjutnya batang dan umbi dicacah menggunakan skalpel steril (sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol 70% dan dibakar api bunsen). Potongan sampel direndam dalam akuades steril hingga keluar masa bakteri (oose), kemudian divortex. Suspensi diencerkan bertingkat, dan sebanyak 100 µL dari masing-masing pengenceran ditumbuhkan pada media CPG.
Koloni tunggal bakteri yang tumbuh setelah 24-48 jam diambil menggunakan jarum ose steril (dicelupkan dalam alkohol 70% dan dibakar api bunsen), dan digores pada media nutrient agar (NA) dengan metode kuadran. Koloni tunggal yang tumbuh kemudian digores kembali pada media NA untuk memastikan bahwa bakteri yang tumbuh berasal dari koloni tunggal. Isolat murni bakteri yang diduga E. chrysanthemi kemudian diidentifikasi.
Sebelum dilakukan identifikasi, isolat bakteri terlebih dahulu diuji sifat patogennya melalui uji hipersensitivitas sehingga diharapkan hanya bakteri yang memiliki sifat patogen saja yang disertakan dalam rangkaian pengujian.
Uji Hipersensitivitas
Suspensi bakteri dengan kepadatan 109 CFU/mL berumur 24 jam diambil menggunakan syringe steril yang telah dilepas bagian jarumnya, disuntikkan ke tanaman tembakau dari bagian bawah daun. Setelah 24-48 jam diamati gejala yang muncul pada bagian daun tembakau yang disuntik dengann suspensi bakteri.
Identifikasi Bakteri Busuk Lunak yang diduga E. chrysanthemi
Karakter fisiologi
Menurut Hyman et al. (2002), beberapa pengujian sifat fisiologi yang perlu dilakukan untuk mengetahui karakter Erwinia yaitu uji oksidase, katalase, oksidasi-fermentasi, dan kemampuan untuk menyebabkan busuk pada umbi kentang. Tahapan pengujian dikerjakan sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan oleh De Boer dan Kelman (2001).
Uji Gram. Gelas objek steril, ditetesi larutan KOH 3% pada bagian tengahnya. Koloni bakteri diambil menggunakan jarum ose, kemudian dicampurkan dalam larutan KOH tersebut. Perlahan ose diangkat dari campuran tersebut. Apabila campuran bakteri dan KOH menempel/lengket pada jarum ose saat terangkat, maka koloni bakteri tersebut tergolong Gram negatif. Sebaliknya apabila campuran tidak menempel/lengket menunjukkan bakteri Gram positif (Gambar 3).
Uji katalase. Gelas objek steril, ditetesi larutan H2O2 (hidrogen peroksida) pada bagian tengah. Koloni bakteri diambil menggunakan jarum ose, kemudian dicampurkan dalam larutan H2O2 tersebut. Apabila muncul gelembung maka koloni bakteri tersebut bersifat katalase positif dan sebaliknya jika tidak muncul gelembung (Gambar 4).
Uji oksidase. Uji katalase dilakukan pada kertas saring steril. Kertas ditetesi larutan tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1%. Koloni bakteri diambil menggunakan ujung pipet tips kemudian digoreskan pada kertas saring tersebut.
b a
a b
Gambar 3 Pengujian Gram, Isolat bakteri Gram negatif akan lengket apabila dicampurkan dengan KOH 3% (a) sedangkan Gram positif tidak lengket (b)
Apabila setelah 10 detik terjadi perubahan warna menjadi ungu maka koloni bakteri tersebut memiliki sifat oksidase positif (Gambar 5).
Uji oksidasi/fermentasi (O/F). Uji O/F dilakukan menggunakan media yang mengandung larutan glukosa 1% dalam tabung reaksi. Untuk sekali pengujian digunakan 2 tabung reaksi paralel. Kedua tabung diinokulasi bakteri dengan cara menusukkan inokulum bakteri umur 48 jam, dan diberi minyak parafin steril hingga ketinggian 1 cm pada salah satu tabung dan kedua tabung diinkubasikan pada suhu 27 ᵒC selama 24-48 jam. Terbentuknya warna pada kedua tabung mengindikasikan bakteri yang bersifat fermentatif (+/+). Terbentuknya warna hanya pada tabung tanpa minyak parafin mengindikasikan bakteri bersifat oksidatif (+/-). Sebagai kontrol, digunakan media yang sama tanpa glukosa diinokulasi bakteri dan media tanpa glukosa dan tanpa bakteri dengan dan tanpa lapisan minyak parafin (Gambar 6).
Uji pembusukan umbi kentang. Pada uji ini digunakan umbi kentang yang belum bertunas yang disterilisasi permukaannya menggunakan NaOCl 5% yang mengandung setetes deterjen selama 10 menit. Kentang dibilas dengan aquabides
a b c d e
-
+Gambar 5 Uji katalase positif (kanan) dan oksidase negative (kiri)
Gambar 6 Pengujian O-ksidasi dan Fermentasi (O/F); (a) media O-F tanpa glukosa, diinokulasi isolat kontrol +, (b) media O-F tanpa inokulasi, (c) media O-F tanpa inokulasi dengan minyak parafin, (d) pengujian kontrol +, (e) pengujian kontrol + dengan parafin
steril dan dikering anginkan pada suhu ruang. Umbi kentang diiris dengan ketebalan 7-8 mm menggunakan skalpel steril, kemudian setiap irisan diletakan dalam cawan petri yang sudah dialasi beberapa lembar kertas saring yang sudah dilembabkan. Permukaan umbi kentang tidak boleh basah. Kultur bakteri yang berumur 48 jam pada media NA kemudian dioleskan pada bagian tengah potongan umbi menggunakan jarum ose, kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 48 jam. Jika positif E.chrysanthemi, maka kentang akan membusuk setelah 48 jam (Gambar 7).
Identifikasi bakteri berdasarkan penggunaan sumber karbon
Isolat bakteri yang memiliki ciri fisiologi mirip dengan E. chrysanthemi kemudian diidentifikasi berdasarkan penggunaan sumber karbon menggunakan GEN III OmniLog® ID System (Biolog, Hayward, CA, USA) yang telah divalidasi oleh Sandle et al. (2013). Koloni tunggal bakteri berumur 24-48 jam diambil menggunakan cotton swab steril secara vertikal pada permukaan agar kemudian digosokkan pada dinding tabung yang berisi inoculation fluid (IF-A) agar bakteri terlepas. Tabung dibolak-balik perlahan sehingga konsentrasi bakteri dalam larutan merata, selanjutnya kepadatan sel bakteri diukur menggunakan Biolog Turbidimeter. Kepadatan sel untuk bakteri aerobik yang disarankan oleh produsen alat adalah adalah 93-98% Transmisi (% T). Suspensi bakteri dimasukkan ke dalam GEN III Microplates TM sebanyak 100 µL per sumuran, kemudian diinkubasi pada suhu 33 °C selama 4 jam, apabila belum terjadi perubahan warna ungu pada mikroplat maka inkubasi dilanjutkan hingga 24 jam. Pembacaan hasil identifikasi menggunakan Biolog MicroStation Reader. Dalam pengujian ini disertakan juga isolat kontrol positif E. chrysanthemi asal tanaman anggrek (isolat milik Giyanto dan Refa Firgianto).
Perbandingan identitas isolat bakteri yang diuji dengan basis data akan terlihat pada nilai probability, similarity, dan distance. Nilai probability merupakan persentase kemungkinan kesamaan antara isolat yang diuji dengan basis data GEN III OmniLog ID System. Nilai similarity merupakan kemiripan pola hasil pengujian isolat dengan basis data dan nilainya untuk masing-masing organisme berbeda-beda. Nilai probability dan similarity berkisar antara 0-1 (0-100%). Identitas isolat valid apabila pada pembacaan hasil 4 jam pertama setelah inkubasi nilai similarity ≥ 0.75 (75%), akan tetapi apabila pembacaan hasil
a b
Gambar 7 Pengujian pembusukan pada irisan umbi kentang, (a) diinokulasi isolat kontrol positif (E. chrysanthemi asal anggrek), (b) tanpa inokulasi
dilakukan setelah 24 jam maka nilai similarity ≥ 0.5 (50%). Nilai distance menunjukkan perbedaan hasil pengujian antara isolat sampel yang diuji dengan basis data Biolog yang berkisar antara 0-10, artinya apabila terdapat perbedaan lebih dari 10 sumuran uji, maka isolat bakteri yang diuji tidak dapat teridentifikasi.
Deteksi asam nukleat dengan polymerase chain reaction (PCR)
Deteksi asam nukleat dengan PCR dilakukan jika identifikasi berdasarkan uji fisiologi dan penggunaan sumber karbon menunjukkan hasil yang kurang jelas. DNA bakteri dideteksi dengan menggunakan primer spesifik E. chrysanthemi. Jika deteksi menggunakan primer spesifik E. chrysanthemi DNA tidak teramplifikasi, maka dilakukan deteksi DNA menggunakan primer universal 16S rRNA dan perunutan DNA.
Ekstraksi DNA. DNA diekstraksi berdasarkan metode yang telah dilakukan oleh Rahma (2013), yaitu dengan mengambil seujung pipet tips koloni bakteri, dimasukkan dalam tabung 1.5 mL yang berisi 100 µL ddH2O. Pada metode sebelumya suspensi bakteri direbus selama 10 menit, sedangkan pada pengujian ini dilakukan pemanasan pada suhu 95 ºC selama 1 menit. Selanjutnya suspensi bakteri tersebut menjadi cetakan untuk reaksi PCR.
Amplifikasi DNA dengan primer spesifik E. chrysanthemi. Metode
amplifikasi berdasarkan Hseu et al. (2007) menggunakan primer spesifik E. chrysanthemi Ec3F (5’-AAA TGC TGG C(T/C)G GTA TGC CGT A-3’) dan
Ec4R (5’-CAG CGT CAG GAA CGG ACA TAC-3’). Proses amplifikasi dilakukan dengan tahapan sebagai berikut: satu siklus predenaturasi pada suhu 94
ᵒC selama 5 menit, 30 siklus yang terdiri atas tahap denaturasi DNA pada suhu 94
ᵒC selama 30 detik, tahap penempelan primer ke DNA target pada suhu 60 ᵒC selama 30 detik, dan tahap pemanjangan DNA pada suhu 72 ᵒC selama 30 detik, 1 siklus pemanjangan DNA pada suhu 72 ᵒC selama 10 menit yang diakhiri pada suhu 10 ᵒC untuk penyimpanan. Produk hasil amplifikasi akan berukuran 548 pb.
Amplifikasi DNA dengan primer universal 16S rRNA. Metode
amplifikasi menggunakan primer universal 16S DNA yaitu 27F (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3’) dan 1429R (5’-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3’) dengan ukuran produk amplifikasi adalah ~1500 pb (Pradhap et al. 2011). Tahapan amplifikasi adalah sebagai berikut: satu siklus predenaturasi pada suhu 95 ᵒC selama 5 menit., 35 siklus yang terdiri atas tahap denaturasi DNA pada suhu 95 ᵒC selama 1 menit, tahap penempelan primer ke DNA target pada suhu 55 ᵒC selama 1 menit, dan tahap pemanjangan DNA pada suhu 72 ᵒC selama 2 menit, 1 siklus pemanjangan DNA pada suhu 72 ᵒC selama 10 menit yang diakhiri pada suhu 4 ᵒC untuk penyimpanan.
Reaksi PCR menggunakan total volume reaktan 25 µL yang terdiri atas 12.5
μl Dream Taq Green PCR master mix, masing-masing primer forward dan reverse 10 μM sebanyak 1 μL, DNA templet 1 μL, dan air bebas nuklease 9.5 μL. Produk hasil PCR diseparasi menggunakan gel agarosa (Thermo Scientific) 1.5% pada 75 volt selama 30 menit. Setelah gel agarosa direndam dalam larutan etidium bromida 2% selama 15 menit, visualisasi DNA dilakukan pada UV transluminator dan didokumentasi dengan kamera digital.
Perunutan DNA
DNA produk PCR dikirim ke First Base, Malaysia untuk dirunut sikuennya. Sikuen gen 16S DNA dibandingkan dengan sekuen DNA bakteri yang sama asal negara lain yang terdeposit dalam GenBank menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Homologi gen 16S DNA dilakukan menggunakan program ClustalW BioEdit yang dikalkulasi
dengan pilihan “sequence identity matrix”. Analisis filogenetik dilakukan dengan software Clustal W (Bioedit version 6.05.) dan program Mega version 5.05. berdasarkan pendekatan neighbour joining dengan nilai bootstrap 1000 kali.
