BAHAN DAN METODE

TINJAUAN PUSTAKA

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan mulai Oktober 2011 sampai dengan Maret 2012 di Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Balai Besar Karantina Pertanian Tanjung Priok Wilayah Kerja Bogor, serta Balai Uji Terap Teknik dan Metode Karantina Pertanian.

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel umbi bawang merah impor asal Thailand, Filipina dan China; dan sampel umbi bawang merah lokal varietas Jawa, Biru, Brebes dan Nganjuk, serta sampel bawang merah bentuk biji varietas Tuk-Tuk (PT. East West Seed Indonesia). Jenis sampel bawang merah impor dan lokal yang didapatkan untuk penelitian sebagian besar berupa umbi (Tabel 1 dan Gambar 1). Sampel tanaman bawang merah bergejala virus digunakan sebagai kontrol positif untuk pemeriksaan virus. Pemeriksaan virus menggunakan tanaman indikator C. amaranticolor, bufer fosfat, Xprep Plant RNA Mini Kit (Philakorea Technology), First-Strand cDNA Synthesis Kit (GE Healthcare), MasterMix (Qiagen) dan primer spesifik untuk OYDV, SYSV, SLV, dan ShVX. Alkohol 70% dan media Heinze Polyvinyl Alcohol (PVA) diperlukan untuk pemeriksaan tungau.

Tabel 1 Sampel bawang merah yang digunakan untuk pemeriksaan virus dan tungau

Asal Negara asal / varietas Bentuk Keterangan (peruntukan) Impor Asal Filipina

Asal Thailand Asal Thailand Asal China Umbi Umbi Umbi Umbi Bibit Bibit Konsumsi Konsumsi Lokal Varietas Biru

Varietas Nganjuk Varietas Jawa Varietas Brebes Umbi Umbi Umbi Umbi Bibit Bibit Bibit Konsumsi Varietas Tuk Tuk Biji Bibit

Gambar 1 Sampel bawang merah yang digunakan untuk pemeriksaan virus dan tungau. Sampel bibit bawang merah impor asal Thailand (T1, T2), Filipina (F) dan China (C). Bibit lokal varietas Biru (Bi), Jawa (J), Nganjuk (Ng), Brebes (B) dan Tuk Tuk (Bj).

Metode Pengambilan Sampel

Sampel bawang merah impor diambil dari pelabuhan laut Tanjung Priok Jakarta dan pelabuhan laut Tanjung Perak Surabaya. Pengambilan sampel bawang merah impor dilakukan pada saat bawang merah diturunkan dari alat angkut di gudang pemilik. Pengambilan sampel bawang lokal dilakukan di gudang penyimpanan bawang merah di kabupaten Bantul Provinsi DIY dan sampel tanaman bawang merah bergejala virus yang digunakan sebagai kontrol positif diambil di kabupaten Bantul Provinsi DIY.

Pengambilan sampel dilakukan di dalam kontainer (sampel bawang merah impor) dan gudang penyimpanan (sampel bawang merah lokal) dengan cara mengambil bawang merah secara acak pada tiga titik di dalam kontainer atau gudang yaitu di bagian depan bawah, tengah dan bagian belakang atas untuk mendapatkan primary sample. Primary sample dicampur hingga homogen sehingga didapatkan composite sample. Dari composite sample diambil  2 kg

submitted sample untuk dibawa ke laboratorium.

Submitted sample tersebut dimasukkan ke dalam plastik, diberi label yang memuat informasi tanggal pangambilan, jenis dan tempat pengambilan, kemudian dimasukkan ke dalam kotak pendingin dan dihindarkan dari sinar matahari

langsung untuk menekan pengaruh fluktuasi suhu saat pengangkutan ke laboratorium.

Di laboratorium, submitted sample dipisahkan menjadi dua bagian yaitu

archive sample sebagai sampel cadangan dan working sample digunakan untuk pemeriksaan virus dan tungau. Pengambilan sampel tanaman bawang merah bergejala dilakukan dengan mengamati pertanaman bawang merah milik petani, kemudian memotong sampel daun dari tanaman yang menunjukkan gejala serangan virus berupa garis-garis mosaik berwarna kuning pada daun dan tanaman yang mengalami hambatan pertumbuhan.

Metode Pemeriksaan Virus

Pemeriksaan virus pada bibit bawang merah dilakukan dengan mengambil secara acak 30 umbi bawang merah dari working sample, kemudian ditumbuhkan pada tanah steril di rumah kasa. Sterilisasi tanah menggunakan otoklaf pada suhu 121 oC tekanan 1 atm selama 15 menit. Sebelum ditanam, umbi dipotong 25% (atau  1.5 cm) bagian ujung umbi untuk mempercepat pertumbuhan. Setelah bawang merah berumur 20 hari, diambil sampel daun komposit yang masing- masing mewakili 5 tanaman.

Sampel yang telah diambil digunakan untuk penularan pada tanaman indikator (C. amaranticolor), pemeriksaan secara molekuler dengan metode

reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) dan untuk penentuan kejadian penyakit (virus) pada sampel bawang merah tersebut.

Penularan pada tanaman indikator

Penularan pada tanaman indikator dilakukan dengan mengoleskan sap daun bawang merah ke daun tanaman indikator C. amaranticolor yang telah ditaburi

carborundum menggunakan cotton bud steril. Pembuatan sap dilakukan dengan cara menggerus 0.1 g sampel daun bawang merah dengan penambahan bufer fosfat yang mengandung 1% β-merkaptoetanol sebanyak 5 bagian sampel (0.5 ml). Selanjutnya C. amaranticolor tersebut dipelihara pada kurungan kedap serangga dan diamati sampai muncul gejala.

Deteksi secara molekuler

Deteksi virus secara molekuler dilakukan dengan metode two-step RT-PCR, dengan tahapan meliputi ekstraksi RNA, sintesis complementary DNA (cDNA), PCR, visualisasi hasil PCR dan dokumentasi.

Ekstraksi RNA. Ekstraksi RNA total dari 0.1 g daun bawang merah dilakukan dengan menggunakan Xprep Plant RNA Mini Kit (Philakorea Technology). XPRB buffer disiapkan dalam tabung bebas RNase dan ditambahkan 10 µl β-merkaptoetanol (β-ME) per 1 ml XPRP buffer, serta ditambahkan etanol (96–100%) sebanyak 60 ml ke dalam Wash buffer 2 sebelum digunakan untuk pertama kali.

Sebanyak 0.1 g sampel tanaman digerus dengan bantuan nitrogen cair, kemudian ditambahkan 450 µlXPRB buffer (yang telah ditambahkan β-ME) dan divortex. Selanjutnya campuran tersebut dipindahkan ke filter column yang telah ditempatkan pada collection tube dan disentrifugasi pada kecepatan 14 000 rpm atau 10 000 xg selama 2 menit. Supernatan dipindahkan dari collection tube ke tabung microcentrifuge baru, kemudian ditambahkan 0.5 volume etanol (96– 100%) dan diaduk dengan cara dipipet hingga tercampur. Sampel dipindahkan ke

XPPLR mini column, disentrifugasi pada kecepatan 14 000 rpm atau 10 000 xg

selama 1 menit, selanjutnya cairan yang tertampung pada collection tube dibuang.

Wash buffer 1 sebanyak 500 µl ditambahkan ke dalam XPPLR mini column dan disentrifugasi pada kecepatan 14 000 rpm atau 10 000 xg selama 1 menit. Selanjutnya cairan yang tertampung pada collection tube dibuang. Wash buffer 2 sebanyak 750 µl ditambahkan ke dalam XPPLR mini column, disentrifugasi pada kecepatan 14 000 rpm atau 10 000 xg selama 1 menit dan cairan yang tertampung pada collection tube selanjutnya dibuang. Sentrifugasi dilakukan kembali pada kecepatan 14 000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan column. XPPLR mini column ditempatkan pada ependorf baru, kemudian sebanyak 50 µl RNase-free water diteteskan tepat di bagian tengah membran XPPLR mini column, didiamkan selama 1 menit kemudian disentrifugasi pada kecepatan 14 000 rpm atau 10 000 xg selama 2 menit. Cairan yang tertampung pada ependorf mengandung RNA

hasil ekstraksi. RNA ini dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu -20 oC.

Sintesis cDNA. Sintesis cDNA menggunakan First-Strand cDNA Synthesis Kit (GE Healthcare). Sintesis cDNA dilakukan dengan mengambil sebanyak 8 µl RNA hasil ekstraksi dipindahkan ke tabung ependorf ukuran 1.5 ml dan diinkubasi pada suhu 65 oC selama 10 menit pada penangas air. Selanjutnya dicampurkan dengan komponen reaksinya (Tabel 2).

Tabel 2 Komponen sintesis cDNA menggunakan First-Strand cDNA Synthesis Kit (GE Healthcare)

Komponen Volume (µl)

First-strand reaction mix 5.0

Primer pd(N)6 1.0

DTT solution 1.0

RNA template 8.0

Volume total 15.0

Setelah semua komponen reaksi dicampurkan, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 1 jam menggunakan heat block. Hasil sintesis menghasilkan cDNA yang selanjutnya digunakan untuk proses PCR.

Proses PCR. Reaksi PCR menggunakan cDNA hasil sintesis sebelumnya sebagai cetakan. Sebagai pereaksi digunakan MasterMix (Qiagen) dan primer spesifik untuk OYDV, SYSV, SLV, dan ShVX (Tabel 3). Total volume

campuran satu reaksi PCR sebanyak 25 µl (Tabel 4). Sebagai kontrol negatif digunakan sampel tanaman sehat, sedangkan untuk kontrol positif digunakan cDNA dari tanaman terinfeksi SYSV yang diperoleh dari pertanaman bawang merah milik petani di kabupaten Bantul Provinsi DIY.

Tabel 3 Primer yang digunakan untuk reaksi PCR terhadap virus pada bawang merah Virus target Primer Produk PCR Referensi OYDV F 5’- CGAAGCAAATTGCCAAGCAG -3’ R 5’- CGATTAGCTGCCCCTCTAAC -3’ 601 bp (Mahmoud et al. 2007) SYSV F 5’- ACACGAGCCACACACGCACA -3’ R 5’- TCCCTAACAAAACGTGCAACACTCA -3’ 749 bp (NCBI 2011) SLV F 5’- AAACCTTTTGGTTCACTTTAGG -3’ R 5’- GCGTGCTATATTTAAGTTGCATAC -3’ 992 bp (Torrico et al. 2010) ShVX F 5’- ATTTAGGGGTGAAGGTCTGT -3’ R 5’- GAGTTTTGAGGTCGTTGG -3’ 912 bp (Egusquiza et al. 2008) F (primer “forward”), R (primer ”reverse”)

Tabel 4 Komposisi reaksi PCR menggunakan MasterMix (Qiagen) untuk volume satu reaksi 25 µl

Komponen Volume untuk 1 reaksi (µl)

Nuklease free water 8.5

MasterMix 12.5

Primer Forward 1.0

Primer Reverse 1.0

cDNA 2.0

Volume total 25.0

Tabel 5 Siklus PCR yang digunakan untuk amplifikasi DNA

No Proses Primer Siklus

OYDV SYSV SLV ShVX 1. Denaturasi awal 95 oC (5 mnt) 95 oC (5 mnt) 95 oC (5 mnt) 95 oC (5 mnt) 1 kali 2. Denaturasi 95 oC (1 mnt) 95 oC (1 mnt) 95 oC (1 mnt) 95 oC (1 mnt) Proses no. 2–4 diulang 35 kali 3. Annealing 57 oC (45 dtk) 57 oC (45 dtk) 55.8 oC (45 dtk) 55 oC (1 mnt) 4. Extension 72 oC (1 mnt) 72 oC (1 mnt) 72 oC (1 mnt) 72 oC (1 mnt, 30 dtk) 5. Final extension 72 oC (7 mnt) 72 oC (7 mnt) 72 oC (7 mnt) 72 oC (7 mnt) 1 kali

Komponen PCR tersebut dipastikan tercampur dalam tabung PCR dan dilanjutkan dengan proses PCR. Mesin yang digunakan untuk proses PCR adalah

Visualisasi hasil PCR dilakukan dengan elektroforesis PCR menggunakan media agarose gel 1.5% (w/v) dalam bufer TAE 1X yang mengandung larutan etidium bromida 1 µl per 10 ml larutan agarose untuk pewarnaan pita DNA.

Elektroforesis dilakukan dengan mencampurkan DNA hasil PCR sebanyak 10 µl dengan 2 µl Loading dye di atas kertas parafilm dan diresuspensi hingga homogen. Selanjutnya dilakukan elektroforesis menggunakan alat elektroforesis (Mupid-eXu) yang diprogram pada tegangan 100 V, 400 mA, selama 30 menit. Marker yang digunakan adalah 50 bp DNA Ladder. Setelah proses elektroforesis selesai, pita-pita DNA yang terbentuk pada agarose gel didokumentasikan dengan menggunakan Gel Doc (Bio-Rad).

Hasil PCR yang menunjukkan adanya amplifikasi pita DNA virus (sesuai panjang produk primer yang digunakan), dilanjutkan sikuen di First Base Genetica Science (Singapura). Hasil sikuen dikonfirmasikan dengan data virus yang tersedia di GenBank menggunakan program BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) yang terdapat pada situs National Center for Biotechnology Information (NCBI) di www.ncbi.nlm.nih.gov. Selanjutnya dilakukan analisis homologi terhadap isolat virus lain yang tersedia pada GenBank menggunakan

BioEdit version 7.0.0, dan dilanjutkan pembuatan pohon filogeni menggunakan program Mega 4 untuk menunjukkan kekerabatan dengan virus isolat lain yang tersedia pada GenBank.

Metode Pemeriksaan Tungau Ekstraksi tungau

Pemeriksaan tungau dimulai dengan ekstraksi untuk mendapatkan tungau dari sampel bawang merah. Salah satu metode ektraksi tungau adalah metode

Berlese-Tullgren (Krantz 1978; Uys & Urban 1996) dan pada penelitian ini digunakan metode Berlese-Tullgren yang dimodifikasi. Metode ekstraksi tersebut dilakukan dengan cara menyusun lampu, kasa, corong dan gelas kaca yang diisi dengan alkohol 70% berturut-turut dari atas ke bawah (Gambar 2).

Gambar 2 Skema Berlese-Tullgren yang dimodifikasi untuk ekstraksi tungau.

Working sampel diambil sebanyak 15 g umbi dan 4 g daun bawang merah. Bagian umbi dipotong-potong  0.5 cm, dan bagian daun dipotong-potong  2 cm, kemudian ditempatkan pada kasa penyangga di dalam corong ekstraksi dan diinkubasi di bawah lampu pijar 40 watt yang ditempatkan 30 cm di atas corong ekstraksi selama 6 hari sampai sampel menjadi kering. Tungau yang tertampung pada gelas (berisi alkohol 70%) di bawah corong diamati menggunakan mikroskop stereo untuk menghitung populasi tungau yang ditemukan dan segera dilanjutkan dengan pembuatan preparat slide.

Pembuatan preparat

Pembuatan preparat slide menggunakan media Heinze Polyvinyl Alcohol

(PVA) dengan komposisi polyvinyl alcohol 10 g, air suling 40–60 ml, asam laktat (85–92%) 35 ml, fenol 1% (menggunakan pelarut air suling) 25 ml, Gliserol 10 ml, chloral hydrate 100 g (Zhang 2003; Collof 2009).

Pembuatan preparat dilakukan dengan mengait dua tungau, dan diletakkan pada media PVA yang telah diteteskan pada gelas benda. Satu tungau diletakkan pada posisi dorsal di bagian atas dan yang lain diletakkan pada posisi ventral di bagian atas, dan diatur agar tidak saling bertumpuk. Selanjutnya ditutup dengan gelas penutup secara hati-hati dan diusahakan agar tidak terbentuk gelembung. Apabila diperlukan, dapat dilakukan fiksasi dengan melewatkan gelas benda tersebut di atas api bunsen sampai tungkai-tungkainya meregang kesamping dan

tidak terlipat. Selanjutnya preparat diberi label sementara dan dioven pada suhu 43–45 oC selama 14 hari sampai tubuh tungau terlihat bening. Setelah tubuh tungau terlihat bening selanjutnya dilakukan pengamatan morfologi dan identifikasi tungau di bawah mikroskop compound. Identifikasi morfologi dilakukan berdasarkan kunci identifikasi tungau dari Hughes (1961) dan Zhang et al. (1997).